水牛奶品质优良，其中脂肪和蛋白质含量分别约为8.29%和5.23%，营养价值远高于荷斯坦牛乳^[1-5]。德宏水牛属于沼泽型水牛，是云南当地经过长期选择培育的优良地方牛种资源^[6]。德宏水牛与泌乳性能优良的摩拉水牛、尼里—拉菲水牛等河流型水牛进行杂交，培育出产乳性能优良的德宏奶水牛。改良后的德宏奶水牛属于乳、肉、役兼用型水牛，是构建杂交育种体系的理想模型^[7]。

分化抗原簇36 (cluster of differentiation 36，CD36)又被称为脂肪酸转位酶(fatty acid translocase，FAT)，存在于牛奶脂肪球膜^[8]，是直接参与反刍动物组织中脂肪酸(fatty acid，FA)跨膜运输和脂肪细胞积累脂质的重要运载体。有研究表明：FAT/CD36可作为FA转运和甘油三酯(triglyceride，TG)合成的关键基因^[9-11]。韩立强等^[12]研究表明：在小鼠泌乳中期，CD36的mRNA相对表达丰度较高，且其mRNA表达量可上调3倍。BIONAZ等^[13]认为：随着泌乳的进行，CD36基因的mRNA表达量增加，表明其在奶牛乳腺细胞摄取FA时发挥关键作用，可作为泌乳性状的关键基因。本研究利用实时荧光定量PCR法研究不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织中CD36基因mRNA的表达水平，并与乳脂率进行相关性分析，以期揭示CD36基因在乳脂合成中的作用，为研究其与德宏奶水牛乳脂的合成机制提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料及分组

选择同一养殖小区中饲养条件相同的健康德宏奶水牛216头，采集乳样并测定其乳脂率。经测，大部分德宏奶水牛乳脂率约为7.5%，故以乳脂率(7.5±0.5)%为基准，将德宏奶水牛分为高乳脂率组(H组，乳脂率>8%)、中乳脂率组(M组，乳脂率为7%~8%)和低乳脂率组(L组，乳脂率<7%)。每组选取胎次相同、年龄相近、处于泌乳中期的德宏奶水牛各3头，屠宰后采集乳腺组织，置于超低温冰箱中保存备用。

1.2   主要试剂和仪器

试剂：RNAiso Plus RNA提取试剂、Prime Script^TM reagent Kit Perfect Real Time和SYBR^® Premix Ex Taq^TM II购自TaKaRa公司；RNA Fixer组织RNA保存液购自艾德莱生物科技有限公司。

仪器：电泳仪(型号：Power Pac^TM Basic)、凝胶成像系统(型号：GelDoc^TM XR)和荧光定量PCR仪(型号：iCycler Thermal Cycler)购自Bio-Rad公司；超净工作台(型号：SW-CJ-IF)购自上海博迅实业有限公司；高速冷冻离心机(型号：Thermo Biofuge Primo R)购自Thermo科技有限公司；核酸蛋白定量检测仪(型号：Nano Drop Lite)购自Thermo科技有限公司；乳成分分析仪(型号：Milko Scan^TM FT120)购自上海技越国际贸易有限公司。

1.3   试验方法

1.3.1   乳脂率测定

每头试验牛采集乳样25 mL，采用乳成分分析仪测定乳脂率。

1.3.2   乳腺组织总RNA的提取及反转录

乳腺组织总RNA的提取及反转录参照孙政等^[14]的方法进行，总RNA提取后使用约1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.3   荧光定量PCR引物设计

根据NCBI上提供的水牛CD36基因(NW_005784248.1)和β-肌动蛋白基因(β-actin，XM_006044278)序列，利用Primer 6.0和 Oligo 7.0软件分别设计引物序列(表1)并对其进行分析评价，选择评分高的适宜引物进行试验。

表  1  CD36基因与β-actin基因引物信息

Table  1.  Primer information of CD36 gene and β-actin gene

基因名称 gene name	引物序列 (5′→3′) primer sequences	扩增片段/bp amplified fragment	退火温度/℃ annealing temperature
CD36	F：AAAGCAAGTTGTCCTCGAA	186	56
	R：TCCTTGGCTAGAAAACGAAC
β-actin	F：AAGGACCTCTACGCCAACACG	249	>60
	R：TTTGCGGTGGACGATGGAG

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1.3.4   CD36基因表达水平检测

采用实时荧光定量PCR技术检测CD36基因表达丰度，反应体系设置为20 µL，包括SYBR^®Premix Ex Taq^TM II 10 µL，上、下游引物各0.8 µL，RNase Free dH₂O 6.4 µL，cDNA模板2 µL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40个循环；55 ℃，30 s，81个循环进行熔解曲线分析。

每个样品与内参β-actin均设置3个重复，以减小系统误差。在实时荧光定量PCR反应结束后，用MyIQ软件统计数据，并保存熔解曲线及扩增曲线分析，确定产物是否为单一片段，运用2^−ΔΔC_t法计算CD36基因的表达量。

1.3.5   数据统计与分析

采用SPSS 26.0软件单因素方差分析各试验处理数据间的显著性；利用Pearson相关系数法对CD36基因的mRNA表达水平与乳脂率进行相关性分析。

2.   结果与分析

2.1   乳脂率测定结果

由表2可知：高乳脂率组(H组)德宏奶水牛牛乳中的乳脂率极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)(P<0.01)，且M组显著高于L组(P<0.05)。

表  2  德宏奶水牛牛乳中的乳脂率(n=3)

Table  2.  Milk fat content of Dehong dairy buffalo

组别 group	乳脂率/% milk fat content
高乳脂率组 high milk fat content group	9.16±0.53 Aa
中乳脂率组 medium milk fat content group	7.44±0.52 Bb
低乳脂率组 low milk fat content group	6.72±0.67 Bc
注：同列不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)，不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: In the same column, different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01), different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

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2.2   乳腺组织总RNA检测结果

由图1可知：凝胶成像系统可观察到完整清晰的3条带，得到符合试验需要质量标准的RNA；定量检测每个样品的RNA含量及纯度表明：该RNA有较高的纯度。

图  1  德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果

注：M. DL2000 Marker；1~3. 高乳脂率组；4~6. 中乳脂率组；7~9. 低乳脂率组。

Figure  1.  Results of agarose gel electrophoresis of total RNA of mammary gland tissue from Dehong dairy buffalo

Note: 1-3. high milk fat content group; 4-6. medium milk fat content group; 7-9. low milk fat content group.

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2.3   CD36基因的mRNA表达水平

由图2可知：高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)(P<0.01)，M组也极显著高于L组(P<0.01)。

图  2  德宏奶水牛CD36基因表达水平

注：H、M和L分别为高、中、低乳脂率组；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Figure  2.  Expression level of CD36 gene of Dehong dairy buffalo

Note: H, M and L represent high, medium and low milk fat content group, respectively; different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

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2.4   CD36基因表达水平与乳脂率相关性分析

德宏奶水牛乳腺组织CD36的mRNA表达量与乳脂率呈极显著正相关(P<0.01)，Pearson相关系数为0.906。

3.   讨论

乳腺是哺乳动物泌乳期合成乳汁的重要器官。乳腺腺泡是乳腺组织中主要的功能单位，其外部被毛细血管所围绕^[15]，血管中的血液可以为腺泡提供物质和氧气，充足的营养可为乳汁合成提供必要条件。乳脂作为乳汁的主要组成成分，在营养方面发挥着不可忽视的作用。乳脂的主要成分是甘油三酯(TG)，约占总乳脂含量的98%。乳腺组织中乳脂合成所需的脂肪酸(FA)既可由乳腺组织合成，也可从血液中直接摄取^[16]。有研究认为：乳腺上皮细胞能够利用从血液中摄取的FA合成TG，在FA被摄取进入乳腺上皮细胞的过程中，需要有特定的转运蛋白发挥作用，FAT/CD36就发挥着极其重要的作用^[13]。张航^[17]研究FA变化对乳脂的影响时指出：添加FA可引起乳腺上皮细胞中TG 含量增加，添加饱和长链脂肪酸对TG含量的上调作用更加显著，且乳腺组织中相关脂肪酸摄取和转运基因(CD36)的表达量最高。本研究表明：高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)，M组也极显著高于L组，说明CD36基因可能是乳脂合成过程的重要功能基因。

CD36作为一种乳脂球膜蛋白，在乳脂球膜上存在并表达，在FA的转运过程中起重要作用；且在泌乳阶段，CD36的mRNA表达量有所升高。吕艳涛^[18]研究显示：过氧化物酶体增殖物激活受体α调控靶基因CD36，其mRNA在泌乳期的表达量明显高于妊娠后期。母猪乳腺组织中CD36基因表达量随泌乳逐渐升高，到泌乳高峰期时进一步升高。由此可知：在母猪泌乳过程中，FA摄取与转运相关基因的表达不断升高。有研究发现：过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)的靶基因CD36参与FA转运，PPARG基因敲除小鼠试验表明：PPARγ缺失导致TG合成减少，这是由于负责FA转运的FA转运体CD36基因以及其他相关基因的mRNA表达量下调所致^[19]。许会芬^[20]通过siRNA介导的干扰技术对乙酰CoA合成酶短链家族成员2及ATP柠檬酸裂解酶基因进行共同干扰，将siRNA转染至山羊原代乳腺上皮细胞后，细胞内参与脂质合成代谢的相关基因(如CD36)的表达量明显下调，且脂滴沉积减少，TG含量也有所降低。综上所述，CD36基因的mRNA表达可以促进TG合成，进而可能提高乳质量，但是CD36基因调控乳脂合成的机制还需要进一步研究。

4.   结论

高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)，M组也极显著高于L组。CD36基因的mRNA表达水平与乳脂率呈极显著正相关关系，该基因的表达对德宏奶水牛乳质量的提高可能有显著作用。研究结果可为乳脂合成机制的研究提供科学依据。