山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus，GTPV)引起的一种急性接触性传染病，患病羊表皮甚至黏膜出现典型的痘疹结节。该病严重影响动物采食和生长，造成生产力下降；羊毛和皮革质量下降；甚至继发感染，造成患病动物死亡。该病分布广泛，危害严重，给养羊业带来巨大经济损失^[1-3]，是养羊业重点防控的疫病之一，世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)将其列为A类疫病。

预防该病最有效的方式是接种疫苗，国内以GTPV AV41株制作的疫苗广泛用于山羊注射免疫，为防控山羊痘取得了良好效果。目前，GTPV的分离和培养大多采用OFTu^[4]、MDBK^[5]、Vero^[6]和Hela^[7]等细胞，GTPV还能在绵羊睾丸细胞中增殖^[8]。值得注意的是，山羊睾丸原代细胞常用于培养GTPV^[9]，原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能上相似性较大，其培养的病毒较敏感、病毒滴度较高^[10]。因此，山羊睾丸原代细胞作为天然宿主细胞对GTPV的增殖培养具有先天的优势，研究原代细胞对病毒的增殖特性十分必要。本试验以山羊睾丸细胞为宿主细胞、GTPV AV41株为靶标病毒，开展病毒在不同日龄山羊原代睾丸细胞的传代培养特性、GTPV引起的细胞病变效应以及在不同日龄细胞中的增殖效率比较等研究，以丰富山羊睾丸细胞培养GTPV的相关资料。研究结果将丰富山羊睾丸细胞对GTPV培养特性的相关材料，以筛选更适合GTPV弱毒株培养的细胞，为山羊痘病毒的增殖培养及新型弱毒疫苗的研究提供基础数据。

1.   材料与方法

1.1   试验动物及毒株

供试山羊分别为7日龄和60日龄健康雄性山羊各1头，未接种GTPV疫苗，来源于重庆市大足某羊场。GTPV AV41弱毒疫苗株由重庆市兽用生物制品工程技术研究中心保存。

1.2   试剂及仪器

胰酶、磷酸缓冲液、胎牛血清和DMEM培养基均购自Gibco公司；青霉素和链霉素购自Hyclone公司；25 cm³ 6孔板和Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG购自Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Green I购自宝生生物公司；小鼠P32抗血清由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所保存。

1.3   细胞分离培养及最大传代次数比较

无菌采取供试山羊睾丸组织，按照标准规程去除脂肪和包膜，剪碎、洗涤、消化和分散细胞，制成原代山羊睾丸细胞^[11]。用含10%胎牛血清的DMEM培养基作为生长液，分别将处理好的细胞分装到细胞培养瓶中，37 ℃培养，连续观察其生长情况，待长满单层后，分别按照常规方法进行消化和传代。

1.4   不同日龄山羊原代睾丸细胞的生长效率

待山羊原代睾丸细胞传至第2代时，通过长时间动态细胞成像及数据分析系统，每隔6 h在固定点采集1次细胞图像，通过软件分析得出每个时间点细胞的生长融合度。

1.5   观察GTPV引起的细胞病变

选择生长良好的山羊睾丸单层细胞，分别按照细胞培养液的10%接种GTPV，感染2 h后弃病毒液，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，37 ℃培养，同时设置阴性对照；通过长时间动态细胞成像及数据分析系统每隔6 h在固定位置采集1次细胞图片，连续观察细胞病变情况。

1.6   间接免疫荧光比较GTPV增殖效率

将7日龄和60日龄山羊原代细胞分别铺板6孔板且内置爬片，按1.5节方法取山羊痘病毒感染细胞，并于感染3 d后弃去细胞上清，用PBS液清洗3次；向每孔加入预冷的4%多聚甲醛组织固定液，4 ℃固定15 min，弃去固定液，用PBS液清洗3次；再加入5%脱脂奶粉500 μL，室温封闭1 h，用PBS清洗3次。加入按照1∶200 倍稀释的小鼠P32抗血清，37 ℃孵育1 h，弃抗体，用PBST洗3次，每次5 min；避光加入1 000倍稀释的Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG 1 mL，37 ℃避光孵育45 min，弃去孔内液体，用PBST洗涤3次，每次5 min，置于荧光显微镜下观察^[12]。同时设置阳性血清、阴性血清和PBS组作为对照。

1.7   荧光定量PCR研究山羊痘病毒的增殖效率

选择生长良好的7日龄和60日龄山羊原代睾丸单层细胞，分别按照细胞培养液的10%接种GTPV，感染 2 h后弃去病毒液，用PBS洗2遍；加入细胞维持液，37 ℃培养，在细胞接毒48 、72 和96 h时收获病毒液。同时设置阴性对照。每个病毒样本取病毒液200 µL用于提取病毒DNA，采用荧光定量PCR方法扩增山羊痘病毒P32基因，上游引物为：TGTTATTATGTTTGATCCCGTTC；下游引物为：GTAAAATCATATAAGGTGCGACAA^[13]。设置10 µL的初始反应体系，包括上、下游引物各0.2 µL，SYBR Green I 5 µL，模板1 µL，nuclease-free H₂O 3.6 µL。反应程序为：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。每个样品设置3个重复，计算平均Ct值并根据课题组前期建立的标准曲线方程(y=−4.083x+43.147)计算病毒拷贝数。

2.   结果与分析

2.1   细胞培养特性

由图1可知：2个日龄的细胞在培养24、72和120 h的细胞形态无明显差异，均呈不规则的多边形。通常情况下，2个日龄的细胞在2~3 d后长至致密单层细胞，细胞边界清晰；继续培养至120 h，细胞出现老化脱落的现象。为了解2种原代细胞的最大传代次数，将2个日龄的细胞分别连续传代，随着传代次数的增加，细胞分裂能力下降，生长速度减缓；传至6~7代后，2个日龄的山羊睾丸细胞已无法长满至单层。

图  1  7日龄和60日龄山羊原代睾丸细胞的形态

Figure  1.  Morphology of 7-day-old and 60-day-old goat testicular cells

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2.2   不同日龄的山羊原代睾丸细胞生长曲线

由图2可知：7日龄山羊原代睾丸细胞的生长速率稍高于60日龄的原代睾丸细胞，两者的细胞融合度均在约42 h 达到最大，分别为94.2%和89.0%；42 h 后，由于细胞老化造成细胞脱落，导致细胞融合度减小。

图  2  不同日龄的山羊原代睾丸细胞的生长曲线

Figure  2.  Growth curve of goat primary testicular cells in different ages

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2.3   GTPV疫苗株接种后的细胞形态

GTPV疫苗株在7日龄和60日龄的原代山羊睾丸细胞均能产生细胞病变，但是发生病变的时间以及病变特征存在差异。由图3可知：7日龄细胞在接种GTPV 84 h后，细胞病变率达到90%以上，细胞形态呈现不规则的形状，细胞间质变大，脱落，出现明显的交织拉网现象；接种90 h后细胞间质进一步变大，脱落。由图4可知：60日龄的细胞在接种GTPV 84 h后也出现明显的细胞病变，细胞变圆，细胞间出现明显的聚团，但与7日龄细胞相比，细胞间交织拉网现象明显减少；到90 h时，细胞出现交织拉网和脱落的现象。可见，60日龄细胞相较于7日龄细胞出现细胞圆缩、交织拉网和脱落现象的时间均较晚。

图  3  7日龄山羊原代睾丸细胞接种GTPV疫苗株后的细胞形态

Figure  3.  Morphology of 7-day-old goat testicular primary cells infected by GTPV

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图  4  60日龄山羊原代睾丸细胞接种GTPV疫苗株后的细胞形态

Figure  4.  Morphology of 60-day-old goat testicular primary cells infected by GTPV

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2.4   山羊痘病毒的增殖效率

由图5可知：60日龄细胞的荧光信号多于7日龄细胞，初步判定山羊痘病毒的增殖效率在60日龄的原代山羊睾丸细胞中较高。由图6可知：7日龄羊睾丸细胞感染GTPV疫苗株48、72和96 h后，3个重复的平均Ct值为29.0、28.2和27.1，病毒拷贝数分别为2 884、5 128和8 912 copies/µL；60日龄羊睾丸细胞感染GTPV疫苗株48、72和96 h后，3个重复的平均Ct值为30.2、28.9和26.7，病毒拷贝数分别为1 622、3 090和10 715 copies/µL。

图  5  山羊痘病毒的增殖效率

Figure  5.  Comparison of propagation efficiency of GTPV

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图  6  GTPV在2个日龄细胞上的增殖效率比较

Figure  6.  Comparison of propagation efficiency of GTPV in different ages goat testicular cells

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3.   讨论

本研究分析了GTPV感染7日龄和60日龄山羊原代睾丸细胞的细胞病变效应以及增殖特性，结果表明：7日龄和60日龄山羊睾丸细胞的形态均呈不规则多边形，与杨璐等^[14]分离到的2日龄原代山羊睾丸细胞形态相似；但不同日龄细胞的生长速率和最大传代次数等无明显差异，与唐娜等^[8]对绵羊原代睾丸细胞的研究结果相似。本研究结果为选择60日龄山羊睾丸制备原代细胞提供了数据支撑。在接种GTPV后，细胞都在90 h内产生了细胞病变，最后脱落，与李有文等^[15]在绵羊睾丸细胞中接种GTPV后产生细胞病变现象的时间相似；60日龄山羊睾丸细胞接种GTPV后产生的细胞病变过程与周建胜等^[16]对3月龄绵羊原代睾丸细胞接种GTPV后产生的细胞病变特征非常相似，同样经历了细胞圆缩、脱落形成空斑和细胞堆积呈葡萄串状的过程。此外，本研究不同日龄细胞产生细胞病变的特征有所差别，7日龄细胞主要产生明显的交织拉网现象，60日龄细胞主要产生细胞聚团，这可能是由于7日龄细胞比60日龄细胞对GTPV更敏感，在感染病毒后细胞迅速发生病变，细胞紧密连接变弱，产生交织拉网现象。

从间接免疫荧光的结果初步判断：GTPV在60日龄细胞中的增殖效率比在7日龄细胞中高。荧光定量PCR的检测结果显示：病毒拷贝数随着培养时间的延长而增加，但是60日龄细胞在96 h的增殖效率高于7日龄细胞，与间接免疫荧光试验的结果一致。结合2个日龄细胞感染病毒后的培养特性来看，产生该结果的原因可能是7日龄细胞比60日龄细胞对GTPV更敏感，病毒增殖引起7日龄细胞发生严重病变，导致细胞更容易脱落。从藏绵羊羔羊细胞增龄性变化特征来看，3月龄前，绵羊羔羊细胞处于胚胎型向成熟型过渡的时期，随着日龄增加，细胞的局部分泌性颗粒为细胞提供结构支持^[17]。由此推测，7日龄细胞自身成熟度不及60日龄细胞，最终导致病毒的增殖效率低于60日龄细胞，即GTPV更适合采用60日龄山羊睾丸细胞进行增殖。该结果表明：相对于7日龄山羊睾丸原代细胞，选择更成熟的60日龄山羊睾丸原代细胞有利于GTPV增殖。然而，除7日龄和60日龄细胞外，是否还存在最适于GTPV增殖培养的其他年龄段的山羊睾丸原代细胞，将是需要进一步研究的重点。

4.   结论

7日龄和60日龄山羊睾丸细胞均能在感染GTPV后发生细胞病变，但60日龄细胞的增殖效率高于7日龄细胞。本研究结果对山羊痘病毒弱毒疫苗株的培养有一定的指导作用。