水稻新叶斑病害病原的鉴定及其与稻瘟病的比较研究
Identification of the Pathogen of a New Rice Leaf Spot Disease and the Differences between Leaf Spot Disease and Rice Blast
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Keywords:
- rice disease /
- pathogen identification /
- Curvularia lunata /
- rice leaf spot disease /
- rice blast
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水稻是全球重要的粮食作物，超过50%的人口以水稻为主食[1]。中国作为农业大国，水稻是最主要的粮食作物之一，每年种植面积约占可耕地面积的1/4~1/3，水稻年产量占全国粮食总产的45%[2-4]。保证水稻产量和质量对于粮食安全具有重要意义。近年来，水稻新病害时有发生，并有可能上升为主要病害，给水稻生产带来巨大的潜在威胁[5]。目前仅中国正式记载的水稻病害就多达70多种，可损害水稻的根、茎、叶、穗等部位[5-6]。稻瘟病、白叶枯病和纹枯病是目前水稻生产最严重的三大病害，严重威胁中国乃至世界的粮食安全[7-8]。稻瘟菌通过感染水稻的叶片、穗颈和穗引起水稻叶瘟、颈瘟和穗瘟，每年造成的水稻产量损失约10%~30%，严重时可达40%~50%[9-10]。由白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病每年在亚洲灌溉足和多雨水地区造成极大的产量损失，如其在日本造成的水稻产量损失约为20%，在流行年份可高达50%，在热带地区则更为严重[11-12]。水稻纹枯病在中国的发生逐年加重，其发病时期可以横跨秧苗期至穗期，抽穗期前后为发病盛期，主要危害叶鞘和叶片，导致每年产量损失10%~20%，严重时减产超过30%[13-15]。
近年来，随着气候环境变化、农业条件改变、水稻新品种推广以及大量化肥和农药的使用，新的水稻病害发生增多并趋于严重[16]。2014年，浙江发生了一种类似水稻白叶枯病的水稻新病害，经鉴定其病原为月状旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)[17]；同年，黄微等[18]报道了一种由膝曲旋孢腔菌(C. geniculatus)引起的水稻叶鞘黑斑病，在湖南省花垣县8个乡镇约1 000 hm2的稻田内发生；2020年，安徽省潜山市报道了一种与稻瘟病症状相似的水稻叶片新病害，病斑呈椭圆形沿叶脉发展，外周黄色晕圈，内部黑褐色，发病部位易折断，且相继在安徽潜山、巢湖、宣城、贵池、安庆和合肥等多地发生[19]。这些病害有可能上升为主要病害，给水稻生产带来巨大的潜在威胁。然而，对引起这些病害的新病原研究目前还仅局限于发病症状和发生情况，其对目前生产上大面积推广和利用的水稻种质资源的致病性研究几乎是空白。
海南是中国水稻育种单位的南繁聚集地，种植水稻材料遗传多样性丰富，对病原的进化造成了很强的环境选择压力。2018年，海南陵水南繁基地稻田大面积发生了一种叶斑病，导致成熟期水稻叶片枯死，严重影响水稻灌浆结实。其症状与稻瘟病相似，但田间观察发现发病水稻穗颈和谷粒上并无典型的稻瘟病病斑，推测其可能是一种不同于稻瘟病的水稻新病害。为了正确认识该病害，本研究通过单孢分离、形态学和分子生物学对病原进行分类鉴定，对其侵染水稻引起的叶斑症状与稻瘟病叶瘟症状进行比较观察，并对水稻育种中广泛研究和利用的抗稻瘟病水稻材料的致病性进行鉴定，以期为水稻病害的正确识别、有效防治及对水稻抗病育种提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
病样：采自2018年海南陵水发病稻田的成熟期水稻叶片病样若干。
稻瘟菌菌株：GUY11，由福建农林大学王莫教授提供；过表达绿色荧光蛋白标记基因的Zhong-10-8-14，由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱立煌研究员提供。
水稻材料：丽江新团黑谷、江南香糯、子预44、中花11、地谷、谷梅4号、丰优香占、宜香优2115、宜优673、两优816、明两优527、明两优829和楚粳27，均为本实验室保存。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、番茄燕麦培养基(TOA)和水琼脂培养基(WA)。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌单孢分离与保存
(1) 病样保湿培养：取田间采集的叶斑病病样，病叶切成大小约1 cm×5 cm，于超净台内使用75%酒精浸泡洗涤30 s后再用无菌水清洗3次，每次30 s，然后放在铺有扇形湿润滤纸的培养皿中，置于28 ℃恒温培养箱中培养2~3 d，病样表面产生霉层后在光学显微镜下挑取单孢[20]。
(2) 病原菌单孢分离与保存：基本操作参照郭敬玮等[20]和张君成[21]的方法。于无菌操作台内使用直径为1 mm的无菌毛细管圆头从病样分生孢子梗上轻划其顶端孢子，采用“Z”字划线法涂抹在WA培养基上，在光学显微镜下利用三点定位法确定单孢位置。用灭菌解剖针画“口”字，挑取只有单孢的琼脂块放在添加抗生素的PDA培养基上，置于28 ℃培养箱内倒置培养约3 d，挑取无污染的菌落铺在约为0.5 cm×0.5 cm的滤纸片上生长10 d，在无菌超净台内用镊子收集滤纸片，置于灭菌纸袋内，烘干后放于−20 ℃冰箱保存。
1.2.2 病原菌鉴定
(1) 形态鉴定：将分离的病原菌滤纸片活化4 d后接种到PDA培养基上，生长3~4 d后用打孔器打菌饼转接到新的PDA培养基上，于28 ℃黑暗培养5 d后观察菌落的培养性状。用接种针抠取少量菌落外圈菌丝体于PDB培养基，摇瓶培养4 d后用移液枪吸取1.4 mL菌液于TOA产孢培养基上，在28 ℃、12 h光照/12 h黑暗条件下交替培养4 d；使用灭菌刀片挑取分生孢子梗，用1 mL无菌水冲洗菌落后制片，在荧光显微镜(Olympus fluorescent microscope) 10×视野下观察分生孢子的颜色、形态、隔膜和大小等特征，参考《农业植物病理学》[3]对病原进行初步鉴定。
(2) 分子鉴定：分离菌株在PDA培养基上培养4 d后，挑取菌落外圈转至PDB培养基，在28 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 d；于无菌操作台过滤收集菌丝体，之后放入37 ℃烘箱烘干，将干燥后的样品液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取DNA[22]。采用真菌ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′)扩增ITS核酸片段。PCR反应体系20 μL，包括ddH2O 14.1 μL、10×Tag Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、25 mmol/L ITS1和ITS4引物各0.5 μL、10 ng/μL DNA模板1 μL和5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL。PCR 程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，送生工生物工程股份有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中已知序列进行比对分析，利用MEGA 7.0构建系统发育树[23]。
1.2.3 病原致病性的柯赫氏法则验证
按照1.2.2节的方法培养病原菌孢子，用无菌水洗下孢子，滤布(Miracloth 475855)过滤后将菌液的孢子密度调至2×105个/mL，加入4%的明胶配成孢子悬浮液，将孢子悬浮液混匀后均匀喷洒于3叶1心期的水稻材料丽江新团黑谷幼苗叶片上，直至叶片上挂满细小菌滴。接种后的水稻材料在温度为28 ℃、湿度为90%的培养箱内黑暗培育24 h，之后保持温度和湿度不变，正常光照(12 h光照、12 h黑暗)培养。分别在培养4和6 d后观察水稻发病情况，并与田间病样和稻瘟病叶瘟症状进行比较，重新分离病菌进行观察。
1.2.4 病原菌致病性研究
按照1.2.3节的方法，通过苗期喷雾接菌13个水稻材料，鉴定其致病性。
1.2.5 病原菌生长特性研究
(1) 病原菌生长速率的测定：使用保存的滤纸片活化菌株于PDA 培养基，用直径为6 mm的打孔器打菌饼转接到新的PDA培养基上，于28 ℃恒温黑暗培养5 d，采用十字交叉法测量菌落直径，每个菌株3次生物学重复，结果取平均值。
(2) 病原菌产孢量的测定：按照1.2.2节的方法获得产病原菌孢子的TOA培养基，向培养基中加入5 mL无菌水并用灭菌后的棉签轻轻刮洗孢子，将菌液过滤得到分生孢子悬浮液；用10 μL移液枪吸取孢子液并滴于血球计数板上，用盖玻片压片后于显微镜下统计孢子数量，3次生物学重复，结果取平均值。
1.2.6 病原菌侵染特性研究
(1) 水稻叶鞘离体注射接菌：按照1.2.2节的方法获得病原菌孢子液，并将其孢子密度调至1×105 个/mL，将混匀的病原菌孢子悬浮液通过移液枪沿着叶鞘底端缓慢注射进水稻材料丽江新团黑谷的叶鞘中，直至另一端有孢子液渗出，将其小心地放置在倒置的96孔板凹面处，并在叶鞘下垫滤纸片，随后将96孔板放入塑料盆中，喷洒水至滤纸片湿润，用保鲜膜将盆开口处密封，膜上戳出一些气孔，覆盖黑布黑暗培养1 d后去除黑布，于自然光下进行培养。
(2) 病原菌侵染观察与统计：分别于接种后3、10、22、34和48 h用刀片切取离体叶鞘凸面的内膜放在载玻片上，滴甘油后用盖玻片盖住，在显微镜下观察孢子的萌发、附着胞形成和侵染水稻细胞的过程并拍照。统计30个分生孢子的萌发、附着胞形成及侵染寄主细胞的情况，采用SPSS 20进行显著性分析，采用Excel 2013制图。
2. 结果与分析
2.1 病原鉴定
对发病田块采集的叶片病样(图1a)进行保湿培养和单孢分离，在荧光显微镜下观察到：病原菌分生孢子梗分化明显，多单生，生长直立，不分枝，呈浅色或半透明，顶部产孢(图1b)。分生孢子多新月形或屈膝状，深黑色或褐色，一般具有3个隔膜4个细胞，中间2个细胞膨大，多弯曲且颜色较深，孢子大小为20~40 μm×9~17 μm (图1c)。根据形态学特征，海南水稻叶斑病病原初步鉴定为子囊菌门(Ascomycota)座囊菌纲(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)弯孢属(Curvularia)真菌。
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图 1 田间病样及病原分生孢子梗和分生孢子形态注：a) 田间病样；b) 分生孢子梗；c) 分生孢子。标尺：20 μm。Figure 1. Field samples and the morphology of pathogenic conidiophore and conidiaNote: a) field samples; b) conidiophore; c) conidia. Scale bar is 20 μm.通过单孢分离获得并保存有效单孢菌株30株，编号为YB1~30，且其菌落形态相同，即：菌落正面从外向内依次为浅黄色、乳白色、浅灰色和褐色轮纹，边缘整齐，气生菌丝浓密，菌落背面均呈外圈浅黄色、中圈明黄色、内圈黑褐色(图2a)。PCR扩增产物分析表明：30株单孢菌株均扩增出预期大小的DNA条带(图2b)。随机对3株菌株的扩增产物进行凝胶回收和测序，序列比对结果表明：3株菌株的扩增产物均为572 bp的相同序列(图2c)，与GenBank中新月弯孢(Curvularia lunata，登录号：MN180824.1)的序列一致性达99%，聚类于同一分支(图3)。经形态学结合分子鉴定，确定该水稻叶斑病病原为弯孢属(Curvularia)真菌新月弯孢(C. lunata)。
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图 2 病原菌的菌落形态和病原中ITS序列的PCR产物扩增注：a) 病原菌在PDA培养基上的菌落形态；b) 凝胶电泳显示的部分单孢菌株ITS序列的PCR扩增产物；c) 病原菌ITS序列。Figure 2. Colony morphology of pathogen and PCR amplification of ITS sequenceNote: a) colony morphology of pathogen on PDA medium; b) PCR amplification of ITS sequence in some strains; c) ITS sequence of pathogen.![]()
图 3 病原菌的ITS DNA序列进化分析Figure 3. Analysis of evolutionary of pathogen by ITS DNA sequences2.2 病原致病性的柯赫氏法则验证及病害典型症状
喷雾接种单孢菌株YB28的孢子悬浮液后，丽江新团黑谷发病明显，病斑近圆形或椭圆形，中央棕褐色，外周黄色，沿中脉上下扩展，发病部位易折断(图4a)。利用接种后发病植株叶片进行保湿培养发现：病原分生孢子梗和分生孢子形态与海南田间病样保湿培养的一致，发病症状与田间症状相似。上述结果表明：2018年春季，海南田间叶斑病害是由新月弯孢菌(C. lunata)引起的。与新月弯孢叶斑病相比，稻瘟病的病斑呈梭形，病斑中央呈灰白色，边缘褐色，有时小病斑可连片形成不规则大病斑(图4b)。
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图 4 接种新月弯孢YB28和稻瘟菌GUY11后的水稻叶片病斑注：a) 水稻弯孢叶斑病病斑；b) 水稻稻瘟病病斑。Figure 4. Spot on rice leaf inoculated by Curvularia lunata YB28 and Magnaporthe oryzae GUY11Note: a) spot of rice Curvularia leaf spot disease; b) spot of rice blast.2.3 新月弯孢菌的致病性
新月弯孢菌株YB28对接种的13个水稻材料均表现出强致病性(图5)，发病快，接种后2 d叶片上就能观察到小型病斑，接种后4 d病斑沿叶脉形成较大的褐色病斑，且发病部位易折断。其中，地谷和谷梅4号还是水稻育种中广泛使用的广谱持久抗稻瘟病水稻资源。
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图 5 新月弯孢菌株YB28喷雾接种13个水稻品种注：1. 江南香糯；2. 丽江新团黑谷；3. 中花11；4. 子预44；5. 地谷；6. 谷梅4号；7. 丰优香占；8. 宜香优2115；9. 宜优673；10. 两优816；11. 明两优527；12. 明两优829；13. 楚粳27。Figure 5. 13 rice varieties were inoculated with C. lunata isolate YB28 by sprayingNote: 1. Jiangnanxiangnuo; 2. Lijiangxintuanheigu; 3. Zhonghua11; 4. Ziyu44; 5. Digu; 6. Gumei No.4; 7. Fengyouxiangzhan; 8. Yixiangyou2115; 9. Yiyou673; 10. Liangyou816; 11. Mingliangyou527; 12. Mingliangyou829; 13. Chujing27.2.4 新月弯孢菌的生物学特性
2.4.1 生长特性
随机选取3株分离保存的单孢菌株YB8、YB17和YB28，检测其在PDA培养基上培养5 d的平均生长速率和产孢能力，结果(图6)显示：3株菌株的生长和产孢能力无明显差异。上述研究表明：目前田间新月弯孢菌株还没有多样性的分化。
2.4.2 侵染特性
由图7可知：接种病菌3 h后，新月弯孢菌株YB28的芽管萌发率为50.00%，显著高于稻瘟菌株GUY11和Zhong-10-8-14，一些新月弯孢菌分生孢子的芽管可从两端细胞萌发，这与稻瘟菌芽管仅顶端细胞萌发长成芽管明显不同；接种10 h后，YB28有70.00%的分生孢子芽管顶端膨大形成附着胞，极显著高于GUY11和Zhong-10-8-14；接种病菌22 h后，新月弯孢菌株YB28形成的附着胞有90.00%穿过寄主表皮形成了初侵染菌丝，显著高于GUY11和Zhong-10-8-14；接种病菌34 h后，GUY11和Zhong-10-8-14仅分别有55.00%和50.00%初侵染细胞中的菌丝扩展到邻近细胞，显著低于YB28的75.00%；接种病菌48 h后，YB28菌丝已100%从初侵染细胞扩展到多个细胞，并出现细胞死亡的黄褐色斑块。以上结果表明：新月弯孢菌与稻瘟菌侵染水稻的方式极为相似，但新月弯孢菌的孢子萌发、附着胞形成和菌丝扩展速率比稻瘟菌快，病程短。
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图 7 新月弯孢菌株 (YB28) 和稻瘟菌株 (GUY11和Zhong-10-8-14) 侵染水稻叶鞘的生物学过程注：a) 新月弯孢和稻瘟菌侵染叶鞘的过程，标尺为20 μm；b) 新月弯孢和稻瘟菌侵染各时间点细胞统计情况， “*”和“**”分别表示P<0.05和P<0.01。Figure 7. The biological process of C. lunata (YB28) and M. oryzae (GUY11 and Zhong-10-8-14) infection in leaf sheath of riceNote: a) infection process of C. lunata and M. oryzae on leaf sheath, scale bar is 20 μm; b) the statistics of infection of C. lunata and M. oryzae at different time points, “*” and “**” indicate P<0.05 and P<0.01, respectively.3. 讨论
弯孢属真菌可引发多种植物病害，包括禾本科玉米[24]和稻谷[25]、芭蕉科香蕉[26]以及番木瓜科番木瓜[27]等植物。近年来，也有弯孢属真菌引起水稻叶部病害的报道[17-18]。本研究表明：2018年海南陵水水稻南繁基地水稻成熟期发生的一种水稻新叶斑病是由新月弯孢菌(C. lunata)所引起，其叶片病斑症状与稻瘟病极其相似。对该病原生物学特性的研究表明：其孢子萌发、附着胞形成和菌丝扩展速率都比稻瘟菌快，病程短，当环境条件适宜，一旦病害发生，很容易在短时间内大面积暴发，对水稻生产的潜在威胁是不可估量的。因此，对该病害发生范围、危害程度、流行趋势和潜在威胁进行全国范围内的全面系统调查已势在必行。此外，由新月弯孢菌引起的水稻叶片病害症状与稻瘟病极度相似，两者极易混淆，影响病害的正确防治，为此，本研究对新月弯孢菌和稻瘟菌侵染水稻的生物学特性和叶部病害症状进行了系统的比较研究，明确了区别稻瘟病和由新月弯孢菌引起的水稻叶斑病的典型症状，研究结果对水稻病害的识别和防治具有重要意义。
由于弯孢属引起水稻叶片病害，近几年才有少量报道，其潜在危害并未引起重视，目前水稻育种目标也没有把该病害列入考虑。本研究对新月弯孢菌致病性的初步研究表明：新月弯孢菌对接种的13种水稻材料(包括水稻生产上大面积推广种植的品种以及水稻育种中广泛使用的高抗稻瘟病和白叶枯病的亲本材料)都有较强的致病性，是否存在该病害的抗性水稻资源还有待进一步的资源抗性鉴定研究。
目前，水稻生产上最具威胁的稻瘟病多由培养特性不同、遗传基础存在差异的菌株复合侵染引起[20]。本研究表明：相较于稻瘟病，由新月弯孢菌引起的水稻新病害病程周期更短，发生发展更快，预防难度更大。然而，从2018年海南采集的不同田间病样上分离的30株单孢菌株具有相似的培养特性，暗示目前田间新月弯孢菌株遗传组成较单一，相关抗性水稻资源鉴定及育种应用对该病害的预防将非常经济有效。为此，加强抗性资源的鉴定和应用研究，对有效预防新月弯孢菌引起水稻新病害的流行、减轻对水稻生产的潜在威胁非常重要。
4. 结论
2018年海南南繁基地稻田发生水稻叶斑病的病原为子囊菌门(Ascomycota)座囊菌纲(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)弯孢属(Curvularia)新月弯孢(C. lunata)。其典型症状是在水稻叶片上形成较大的近圆形或椭圆形褐色病斑，病斑分2层，中央为褐色。对鉴定的13个水稻品种均有较强的致病性。侵染水稻的生物学过程与稻瘟病菌相似，但从分生孢子萌发到菌丝扩展过程所用的时间更短。
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图 1 田间病样及病原分生孢子梗和分生孢子形态
注：a) 田间病样；b) 分生孢子梗；c) 分生孢子。标尺：20 μm。
Figure 1. Field samples and the morphology of pathogenic conidiophore and conidia
Note: a) field samples; b) conidiophore; c) conidia. Scale bar is 20 μm.
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图 2 病原菌的菌落形态和病原中ITS序列的PCR产物扩增
注：a) 病原菌在PDA培养基上的菌落形态；b) 凝胶电泳显示的部分单孢菌株ITS序列的PCR扩增产物；c) 病原菌ITS序列。
Figure 2. Colony morphology of pathogen and PCR amplification of ITS sequence
Note: a) colony morphology of pathogen on PDA medium; b) PCR amplification of ITS sequence in some strains; c) ITS sequence of pathogen.
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图 3 病原菌的ITS DNA序列进化分析
Figure 3. Analysis of evolutionary of pathogen by ITS DNA sequences
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图 4 接种新月弯孢YB28和稻瘟菌GUY11后的水稻叶片病斑
注：a) 水稻弯孢叶斑病病斑；b) 水稻稻瘟病病斑。
Figure 4. Spot on rice leaf inoculated by Curvularia lunata YB28 and Magnaporthe oryzae GUY11
Note: a) spot of rice Curvularia leaf spot disease; b) spot of rice blast.
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图 5 新月弯孢菌株YB28喷雾接种13个水稻品种
注：1. 江南香糯；2. 丽江新团黑谷；3. 中花11；4. 子预44；5. 地谷；6. 谷梅4号；7. 丰优香占；8. 宜香优2115；9. 宜优673；10. 两优816；11. 明两优527；12. 明两优829；13. 楚粳27。
Figure 5. 13 rice varieties were inoculated with C. lunata isolate YB28 by spraying
Note: 1. Jiangnanxiangnuo; 2. Lijiangxintuanheigu; 3. Zhonghua11; 4. Ziyu44; 5. Digu; 6. Gumei No.4; 7. Fengyouxiangzhan; 8. Yixiangyou2115; 9. Yiyou673; 10. Liangyou816; 11. Mingliangyou527; 12. Mingliangyou829; 13. Chujing27.
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图 7 新月弯孢菌株 (YB28) 和稻瘟菌株 (GUY11和Zhong-10-8-14) 侵染水稻叶鞘的生物学过程
注：a) 新月弯孢和稻瘟菌侵染叶鞘的过程，标尺为20 μm；b) 新月弯孢和稻瘟菌侵染各时间点细胞统计情况， “*”和“**”分别表示P<0.05和P<0.01。
Figure 7. The biological process of C. lunata (YB28) and M. oryzae (GUY11 and Zhong-10-8-14) infection in leaf sheath of rice
Note: a) infection process of C. lunata and M. oryzae on leaf sheath, scale bar is 20 μm; b) the statistics of infection of C. lunata and M. oryzae at different time points, “*” and “**” indicate P<0.05 and P<0.01, respectively.
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