施氮促进旱作覆膜玉米产量和水分利用效率的生理机制
Physiological Mechanism of Nitrogen Fertilization Promoting Yield and Water Use Efficiency of Dryland Maize Fields with Plastic Mulching
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水牛奶品质优良,其中脂肪和蛋白质含量分别约为8.29%和5.23%,营养价值远高于荷斯坦牛乳[1-5]。德宏水牛属于沼泽型水牛,是云南当地经过长期选择培育的优良地方牛种资源[6]。德宏水牛与泌乳性能优良的摩拉水牛、尼里—拉菲水牛等河流型水牛进行杂交,培育出产乳性能优良的德宏奶水牛。改良后的德宏奶水牛属于乳、肉、役兼用型水牛,是构建杂交育种体系的理想模型[7]。
分化抗原簇36 (cluster of differentiation 36,CD36)又被称为脂肪酸转位酶(fatty acid translocase,FAT),存在于牛奶脂肪球膜[8],是直接参与反刍动物组织中脂肪酸(fatty acid,FA)跨膜运输和脂肪细胞积累脂质的重要运载体。有研究表明:FAT/CD36可作为FA转运和甘油三酯(triglyceride,TG)合成的关键基因[9-11]。韩立强等[12]研究表明:在小鼠泌乳中期,CD36的mRNA相对表达丰度较高,且其mRNA表达量可上调3倍。BIONAZ等[13]认为:随着泌乳的进行,CD36基因的mRNA表达量增加,表明其在奶牛乳腺细胞摄取FA时发挥关键作用,可作为泌乳性状的关键基因。本研究利用实时荧光定量PCR法研究不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织中CD36基因mRNA的表达水平,并与乳脂率进行相关性分析,以期揭示CD36基因在乳脂合成中的作用,为研究其与德宏奶水牛乳脂的合成机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及分组
选择同一养殖小区中饲养条件相同的健康德宏奶水牛216头,采集乳样并测定其乳脂率。经测,大部分德宏奶水牛乳脂率约为7.5%,故以乳脂率(7.5±0.5)%为基准,将德宏奶水牛分为高乳脂率组(H组,乳脂率>8%)、中乳脂率组(M组,乳脂率为7%~8%)和低乳脂率组(L组,乳脂率<7%)。每组选取胎次相同、年龄相近、处于泌乳中期的德宏奶水牛各3头,屠宰后采集乳腺组织,置于超低温冰箱中保存备用。
1.2 主要试剂和仪器
试剂:RNAiso Plus RNA提取试剂、Prime ScriptTM reagent Kit Perfect Real Time和SYBR® Premix Ex TaqTM II购自TaKaRa公司;RNA Fixer组织RNA保存液购自艾德莱生物科技有限公司。
仪器:电泳仪(型号:Power PacTM Basic)、凝胶成像系统(型号:GelDocTM XR)和荧光定量PCR仪(型号:iCycler Thermal Cycler)购自Bio-Rad公司;超净工作台(型号:SW-CJ-IF)购自上海博迅实业有限公司;高速冷冻离心机(型号:Thermo Biofuge Primo R)购自Thermo科技有限公司;核酸蛋白定量检测仪(型号:Nano Drop Lite)购自Thermo科技有限公司;乳成分分析仪(型号:Milko ScanTM FT120)购自上海技越国际贸易有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 乳脂率测定
每头试验牛采集乳样25 mL,采用乳成分分析仪测定乳脂率。
1.3.2 乳腺组织总RNA的提取及反转录
乳腺组织总RNA的提取及反转录参照孙政等[14]的方法进行,总RNA提取后使用约1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.3.3 荧光定量PCR引物设计
根据NCBI上提供的水牛CD36基因(NW_005784248.1)和β-肌动蛋白基因(β-actin,XM_006044278)序列,利用Primer 6.0和 Oligo 7.0软件分别设计引物序列(表1)并对其进行分析评价,选择评分高的适宜引物进行试验。
表 1 CD36基因与β-actin基因引物信息Table 1. Primer information of CD36 gene and β-actin gene基因名称
gene name引物序列 (5′→3′)
primer sequences扩增片段/bp
amplified fragment退火温度/℃
annealing temperatureCD36 F:AAAGCAAGTTGTCCTCGAA 186 56 R:TCCTTGGCTAGAAAACGAAC β-actin F:AAGGACCTCTACGCCAACACG 249 >60 R:TTTGCGGTGGACGATGGAG 1.3.4 CD36基因表达水平检测
采用实时荧光定量PCR技术检测CD36基因表达丰度,反应体系设置为20 µL,包括SYBR®Premix Ex TaqTM II 10 µL,上、下游引物各0.8 µL,RNase Free dH2O 6.4 µL,cDNA模板2 µL。反应程序为:95 ℃预变性30 s,1个循环;95 ℃变性5 s;60 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,共40个循环;55 ℃,30 s,81个循环进行熔解曲线分析。
每个样品与内参β-actin均设置3个重复,以减小系统误差。在实时荧光定量PCR反应结束后,用MyIQ软件统计数据,并保存熔解曲线及扩增曲线分析,确定产物是否为单一片段,运用2−ΔΔCt法计算CD36基因的表达量。
1.3.5 数据统计与分析
采用SPSS 26.0软件单因素方差分析各试验处理数据间的显著性;利用Pearson相关系数法对CD36基因的mRNA表达水平与乳脂率进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 乳脂率测定结果
由表2可知:高乳脂率组(H组)德宏奶水牛牛乳中的乳脂率极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)(P<0.01),且M组显著高于L组(P<0.05)。
表 2 德宏奶水牛牛乳中的乳脂率(n=3)Table 2. Milk fat content of Dehong dairy buffalo组别 group 乳脂率/% milk fat content 高乳脂率组
high milk fat content group9.16±0.53 Aa 中乳脂率组
medium milk fat content group7.44±0.52 Bb 低乳脂率组
low milk fat content group6.72±0.67 Bc 注:同列不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01),不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Note: In the same column, different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01), different lowercase letters indicate significant
difference (P<0.05).2.2 乳腺组织总RNA检测结果
由图1可知:凝胶成像系统可观察到完整清晰的3条带,得到符合试验需要质量标准的RNA;定量检测每个样品的RNA含量及纯度表明:该RNA有较高的纯度。
图 1 德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果注:M. DL2000 Marker;1~3. 高乳脂率组;4~6. 中乳脂率组;7~9. 低乳脂率组。Figure 1. Results of agarose gel electrophoresis of total RNA of mammary gland tissue from Dehong dairy buffaloNote: 1-3. high milk fat content group; 4-6. medium milk fat content group; 7-9. low milk fat content group.2.3 CD36基因的mRNA表达水平
由图2可知:高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)(P<0.01),M组也极显著高于L组(P<0.01)。
2.4 CD36基因表达水平与乳脂率相关性分析
德宏奶水牛乳腺组织CD36的mRNA表达量与乳脂率呈极显著正相关(P<0.01),Pearson相关系数为0.906。
3. 讨论
乳腺是哺乳动物泌乳期合成乳汁的重要器官。乳腺腺泡是乳腺组织中主要的功能单位,其外部被毛细血管所围绕[15],血管中的血液可以为腺泡提供物质和氧气,充足的营养可为乳汁合成提供必要条件。乳脂作为乳汁的主要组成成分,在营养方面发挥着不可忽视的作用。乳脂的主要成分是甘油三酯(TG),约占总乳脂含量的98%。乳腺组织中乳脂合成所需的脂肪酸(FA)既可由乳腺组织合成,也可从血液中直接摄取[16]。有研究认为:乳腺上皮细胞能够利用从血液中摄取的FA合成TG,在FA被摄取进入乳腺上皮细胞的过程中,需要有特定的转运蛋白发挥作用,FAT/CD36就发挥着极其重要的作用[13]。张航[17]研究FA变化对乳脂的影响时指出:添加FA可引起乳腺上皮细胞中TG 含量增加,添加饱和长链脂肪酸对TG含量的上调作用更加显著,且乳腺组织中相关脂肪酸摄取和转运基因(CD36)的表达量最高。本研究表明:高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组),M组也极显著高于L组,说明CD36基因可能是乳脂合成过程的重要功能基因。
CD36作为一种乳脂球膜蛋白,在乳脂球膜上存在并表达,在FA的转运过程中起重要作用;且在泌乳阶段,CD36的mRNA表达量有所升高。吕艳涛[18]研究显示:过氧化物酶体增殖物激活受体α调控靶基因CD36,其mRNA在泌乳期的表达量明显高于妊娠后期。母猪乳腺组织中CD36基因表达量随泌乳逐渐升高,到泌乳高峰期时进一步升高。由此可知:在母猪泌乳过程中,FA摄取与转运相关基因的表达不断升高。有研究发现:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)的靶基因CD36参与FA转运,PPARG基因敲除小鼠试验表明:PPARγ缺失导致TG合成减少,这是由于负责FA转运的FA转运体CD36基因以及其他相关基因的mRNA表达量下调所致[19]。许会芬[20]通过siRNA介导的干扰技术对乙酰CoA合成酶短链家族成员2及ATP柠檬酸裂解酶基因进行共同干扰,将siRNA转染至山羊原代乳腺上皮细胞后,细胞内参与脂质合成代谢的相关基因(如CD36)的表达量明显下调,且脂滴沉积减少,TG含量也有所降低。综上所述,CD36基因的mRNA表达可以促进TG合成,进而可能提高乳质量,但是CD36基因调控乳脂合成的机制还需要进一步研究。
4. 结论
高乳脂率组(H组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA表达量极显著高于中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组),M组也极显著高于L组。CD36基因的mRNA表达水平与乳脂率呈极显著正相关关系,该基因的表达对德宏奶水牛乳质量的提高可能有显著作用。研究结果可为乳脂合成机制的研究提供科学依据。
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表 1 施氮量对玉米产量、产量构成和水分利用效率的影响
Table 1 Effects of nitrogen application rate on grain yield and its components and water use efficiency of maize
处理
treatment果穗数
ears numbers穗行数
rows numbers行粒数
kernels numbers百粒质量/g
100 kernels weight籽粒产量/(kg·hm−2)
yield耗水量/mm
water consumption水分利用效率/(kg·mm−1·hm−2)
water use efficiencyN0 52500±0 b 15.9±0.5 a 22.9±1.3 c 28.6±1.0 b 4031.84±350.29 c 418.73±1.80 c 9.62±0.80 c N1 61250±8 750 b 16.2±0.3 a 37.6±1.4 a 33.4±0.8 a 8345.52±558.18 b 460.27±3.82 b 18.15±1.30 b N2 82250±1 750 a 15.7±0.1 a 34.3±1.3 ab 34.2±1.1 a 10542.67±813.55 a 473.34±5.49 a 22.28±1.71 a N3 85750±1 750 a 16.1±0.2 a 32.6±1.1 b 36.0±0.8 a 11461.26±124.56 a 466.16±2.55 ab 24.59±0.27 a 注:同列不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著;下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments at P=0.05; the same as below.表 2 施氮量对玉米净光合速率的影响
Table 2 Effect of nitrogen application rate on the net photosynthetic rate of maize
处理
treatment拔节期
jointing stage大喇叭口期
trumpet stage开花期
flowering stage灌浆期
filling stage蜡熟期
dough stageN0 17.3±0.2 d 23.1±1.3 b 15.9±0.8 d 16.0±0.9 b 9.1±0.3 c N1 23.0±1.8 c 25.4±0.3 b 45.6±0.4 c 31.6±1.6 a 23.3±0.4 b N2 30.3±0.8 b 45.2±1.7 a 48.4±0.3 b 34.2±0.1 a 26.1±1.1 a N3 41.2±0.5 a 48.2±1.6 a 51.9±0.8 a 34.4±0.4 a 26.3±0.7 a -
[1] LI F R, ZHAO S L, GEBALLE G T. Water use patterns and agronomic performance for some cropping systems with and without fallow crops in a semi-arid environment of northwest China[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2000, 79(2/3): 129. DOI: 10.1016/S0167-8809(99)00149-8.
[2] 张雷, 牛建彪, 赵凡. 旱作玉米提高降水利用率的覆膜模式研究[J]. 干旱地区农业研究, 2006, 24(2): 8. DOI: 10.3321/j.issn:1000-7601.2006.02.002. [3] 巩杰, 黄高宝, 陈利顶, 等. 旱作麦田秸秆覆盖的生态综合效应研究[J]. 干旱地区农业研究, 2003, 21(3): 69. DOI: 10.3321/j.issn:1000-7601.2003.03.015. [4] 王红丽, 张绪成, 宋尚有, 等. 西北黄土高原旱地全膜双垄沟播种植对玉米季节性耗水和产量的调节机制[J]. 中国农业科学, 2013, 46(5): 917. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.05.006. [5] 谢军红, 柴强, 李玲玲, 等. 黄土高原半干旱区不同覆膜连作玉米产量的水分承载时限研究[J]. 中国农业科学, 2015, 48(8): 1558. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.10. [6] 曹翠玲, 李生秀. 氮素形态对作物生理特性及生长的影响[J]. 华中农业大学学报, 2004, 23(5): 581. DOI: 10.3321/j.issn:1000-2421.2004.05.025. [7] 高逖, 李春喜, 周宝元, 等. 种植密度和施氮量耦合对夏玉米干物质积累及氮肥利用率的影响[J]. 玉米科学, 2017, 25(5): 105. DOI: 10.13597/j.cnki.maize.science.20170517. [8] 张林, 武文明, 陈欢, 等. 氮肥运筹方式对土壤无机氮变化、玉米产量和氮素吸收利用的影响[J]. 中国土壤与肥料, 2021(4): 126. DOI: 10.11838/sfsc.1673-6257.20285. [9] 蔡瑞国, 张敏, 尹燕枰, 等. 小麦灌浆过程中旗叶光合及抗氧化代谢与氮素营养关系研究[J]. 中国农业科学, 2008, 41(1): 53. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.01.007. [10] 杨亮, 赵宏伟, 刘锦红. 氮素用量对春玉米功能叶片谷氨酰胺合成酶活性及产量的影响[J]. 东北农业大学学报, 2007, 38(3): 320. DOI: 10.3969/j.issn.1005-9369.2007.03.007. [11] BERGES J A, CHARLEBOIS D O, FALKOWSKI M P G. Differential effects of nitrogen limitation on photosynthetic efficiency of photosystems I and II in microalgae[J]. Plant Physiology, 1996, 110(2): 689. DOI: 10.1104/pp.110.2.689.
[12] 高向阳, 徐凤彩, 赵亚华, 等. 普通玉米和超甜玉米苗期蔗糖合成酶与磷酸蔗糖合成酶的活力比较[J]. 华南农业大学学报, 2001, 22(2): 46. DOI: 10.3969/j.issn.1001-411X.2001.02.014. [13] 战秀梅, 韩晓日, 杨劲峰, 等. 不同施肥处理对玉米生育后期叶片保护酶活性及膜脂过氧化作用的影响[J]. 玉米科学, 2007, 15(1): 123. DOI: 10.3969/j.issn.1005-0906.2007.01.031. [14] 李婷. 覆膜、施氮和密度对旱地玉米产量和水氮利用效率的互作效应[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2018. [15] 杨忠浩, 党廷辉, 路远, 等. 黄土塬区春玉米氮肥—水分—产量关系研究[J]. 水土保持学报, 2020, 34(4): 237. DOI: 10.13870/j.cnki.stbcxb.2020.04.035. [16] 胡红玲, 张健, 胡庭, 等. 不同施氮水平对巨桉幼树耐旱生理特征的影响[J]. 西北植物学报, 2014, 34(1): 118. DOI: 10.7606/j.issn.1000-4025.2014.01.0118. [17] 李世清, 田霄鴻, 李生秀. 养分对旱地小麦水分胁迫的生理补偿效应[J]. 西北植物学报, 2000, 20(1): 22. DOI: 10.3321/j.issn:1000-4025.2000.01.004. [18] 王进斌, 谢军红, 李玲玲, 等. 氮肥运筹对陇中旱农区玉米光合特性及产量的影响[J]. 草业学报, 2019, 28(1): 60. DOI: 10.11686/cyxb2018096. [19] 王宜伦. 超高产夏玉米氮肥运筹效应及其生理基础研究[D]. 郑州: 河南农业大学, 2010. [20] 刘亚亮, 张治安, 赵洪祥, 等. 氮肥不同比例分期施用对超高产玉米叶片保护酶活性的影响[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2011, 39(2): 202. DOI: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2011.02.018. [21] 施教耐, 吴敏贤, 查静娟. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究: Ⅰ. PEP羧化酶同功酶的分离和变构特性的比较[J]. 植物生理学报, 1979, 5(3): 225. [22] RACKER E. Ribulose diphosphate carboxylase from spinach leaves[J]. Methods in Enzymology, 1962, 5: 266. DOI: 10.1016/S0076-6879(62)05216-7.
[23] 王学奎. 植物生理生化实验原理与技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 2015. [24] 李小方, 张志良. 植物生理学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2016. [25] 陈建勋, 王晓峰. 植物生理学实验指导[M]. 广州: 华南理工大学出版社, 2006. [26] 杨恩琼, 黄建国, 何腾兵, 等. 氮肥用量对普通玉米产量和营养品质的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(3): 509. DOI: 10.3321/j.issn:1008-505X.2009.03.003. [27] 张磊, 孔丽丽, 侯云鹏, 等. 施氮水平对玉米开花后干物质积累、转运及土壤无机氮含量的影响[J]. 玉米科学, 2020, 28(4): 155. DOI: 10.13597/j.cnki.maize.science.20200423. [28] LI S X, WANG Z H, LI S Q, et al. Effect of nitrogen fertilization under plastic mulched and non-plastic mulched conditions on water use by maize plants in dryland areas of China[J]. Agricultural Water Management, 2015, 162: 15. DOI: 10.1016/j.agwat.2015.08.004.
[29] LI S X, WANG Z H, MALHI S S, et al. Nutrient and water management effects on crop production, and nutrient and water use efficiency in dryland areas of China[J]. Advances in Agronomy, 2009, 102: 223. DOI: 10.1016/S0065-2113(09)01007-4.
[30] 黄高宝, 张恩和, 胡恒觉. 不同玉米品种氮素营养效率差异的生态生理机制[J]. 植物营养与肥料学报, 2001, 7(3): 293. DOI: 10.3321/j.issn:1008-505X.2001.03.008. [31] 吕鹏. 氮素运筹对高产夏玉米产量和品质及相关生理特性影响的研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2011. [32] 刘艳, 汪仁, 华利民, 等. 施氮量对玉米生育后期叶片衰老与保护酶系统的影响[J]. 玉米科学, 2012, 20(2): 124. DOI: 10.3969/j.issn.1005-0906.2012.02.026. [33] 金继运, 何萍. 氮钾互作对春玉米生物产量及其组分动态的影响[J]. 玉米科学, 1999, 7(4): 57. [34] 李佩艳, 尹飞, 王俊忠, 等. 施氮量和氮肥后施对夏玉米叶片衰老生理的影响[J]. 河南农业科学, 2010(10): 26. DOI: 10.3969/j.issn.1004-3268.2010.10.012. [35] 谢幸华, 郭书亚, 张艳, 等. 水肥管理对夏玉米叶片衰老及产量的影响[J]. 农业科技通讯, 2017(1): 4. DOI: 10.3969/j.issn.1000-6400.2017.01.033. [36] 李春燕, 陈思思, 徐雯, 等. 苗期低温胁迫对扬麦16叶片抗氧化酶和渗透调节物质的影响[J]. 作物学报, 2011, 37(12): 2293. DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02293. [37] 王静, 杨德光, 马凤鸣, 等. 水分胁迫对玉米叶片可溶性糖和脯氨酸含量的影响[J]. 玉米科学, 2007, 15(6): 57. DOI: 10.3969/j.issn.1005-0906.2007.06.013. [38] 王帅. 高产玉米生理生化特性及推荐施肥研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2008. [39] 熊亚梅. 水分与氮素对蔬菜产量和品质及土壤环境的影响[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2007. [40] 李朝苏, 吴晓丽, 汤永禄, 等. 小麦产量对中后期氮素胁迫的响应及品种间差异[J]. 作物学报, 2019, 45(8): 1260. DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.81083. [41] 杜伟莉, 高杰, 胡富亮, 等. 玉米叶片光合作用和渗透调节对干旱胁迫的响应[J]. 作物学报, 2013, 39(3): 530. DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00530. [42] 张仁和, 郭东伟, 张兴华, 等. 吐丝期干旱胁迫对玉米生理特性和物质生产的影响[J]. 作物学报, 2012, 38(10): 1884. DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01884. -
期刊类型引用(2)
1. 董和,杨军祥,何茂昌,郭海龙,顾玲荣,桑国俊. 平凉红牛CD36基因外显子8(exon 8)多态性及其与肉质性状相关性分析. 饲料研究. 2023(07): 89-93 . 百度学术
2. 庞双龙,徐维维,徐正尧,王梦迪,赵洪晓,徐思慧,杨忠,李卫真. 德宏奶水牛FASN基因乳腺组织表达及生物信息学分析. 云南农业大学学报(自然科学). 2023(05): 779-785 . 百度学术
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