解淀粉芽孢杆菌对葡萄白粉病的防控效果研究
Control Effect of Bacillus amyloliquefaciens on Grape Powdery Mildew
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Keywords:
- grape /
- powdery mildew /
- Bacillus amyloliquefaciens /
- biological control
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鸡白痢是一种由鸡沙门氏菌病引起雏鸡的急性全身性疾病，其特征为高死亡率。鸡为鸡白痢沙门氏菌的自然宿主，各品种鸡均易感染，主要感染14日龄以下的雏鸡且具流行性[1]。鸡白痢沙门氏菌既可以通过消化道、呼吸道水平传播，又可以通过种蛋垂直传播。它常存在于病鸡内脏，以血管、肝脏、肠道、心脏、卵巢和输卵管中居多。沙门氏菌被认为是一种细胞外和细胞内的细菌，当其引起细胞外感染时，病原菌主要存在于宿主淋巴液、组织液和血液中，与机体争夺营养物质，进行增殖，逃避吞噬细胞、补体溶菌和杀菌的作用，逃避宿主的体液免疫应答，并躲避巨噬细胞的吞噬和宿主的特异性免疫应答[2]；但其对细胞内的感染是慢性的，会引起细胞免疫，主要表现为炎症反应和细胞毒作用，进而清除胞内感染的沙门氏菌[3]。
Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是家禽天然免疫中的模式识别受体，目前在家禽和鸟类中已发现至少10种Toll样受体，其中TLR2a、TLR2b、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7与哺乳动物的Toll样受体同源[4]。HIGGS等[5]研究发现：TLR15为禽类特有的受体，位于鸡基因组3号染色体上。鸡白痢沙门氏菌感染肉鸡的试验中，其胃肠道组织中TLR15 mRNA的表达水平也发生上调，表明TLR15在家禽抗沙门氏菌的天然免疫中可能发挥作用[6]。
沙门氏菌通常经粪口途径感染家禽并从肠道开始入侵扩散[7]。在家禽中，当入侵肠道的沙门菌被Toll样受体识别后，机体开始产生大量炎性因子和趋化因子，包括白细胞介素1 (IL-1)、白细胞介素6 (IL-6)、CXC趋化因子i1 (CXCLi1)和CXC趋化因子i2 (CXCLi2)等[8-9]，可募集异嗜性白细胞和巨噬细胞等免疫细胞至沙门菌感染部位，启动免疫应答。
在鸡白痢沙门氏菌病程中，禽β防御素6 (avian beta-defensin 6，AvBD6)发挥重要生物活性，特别是其具有广谱抗微生物作用，在肠道中表达的蛋白对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌等有抑制作用[9]。研究表明：禽AvBD6在鸡的天然免疫中发挥着显著作用[10-11]。鸡白痢沙门氏菌是一种环境中存在的条件性致病菌，当在应激刺激下或其他致病因素作用下极易发病，对雏鸡危害较为严重。喹诺酮药物是防治鸡白痢沙门氏菌的常用药物，但其不合理的超剂量使用易产生耐药性，严重影响食品安全。近年来，一些兽医工作者采用中药防治雏鸡白痢沙门氏菌病收到良好效果。复方板蓝根口服液根据沙门氏菌病的临床辨证进行组方，由板蓝根、诃子和乌梅等中药组成，本研究在确证其临床疗效的基础上，进行体内外试验研究，为复方板蓝根口服液的开发应用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
1日龄健康雄性雏鸡150羽，购于哈尔滨市周边某种鸡孵化场。
1.1.2 药品
板蓝根、乌梅和诃子等均购于黑龙江中草药材大市场。
1.1.3 试验菌种
鸡白痢沙门氏菌CVCC533，购于中国微生物保藏中心。
1.2 方法
1.2.1 复方板蓝根口服液的制备
采用传统煎煮法制备复方板蓝根口服液。按照方中比例称取板蓝根、乌梅和诃子等中药，以1∶10 (质量比)的纯化水浸泡0.5 h，水浴锅加热，沸腾后恒温1.5 h，纱布过滤药渣，121 ℃高压20 min；待冷却后离心，无菌操作，将上清液配制为生药，质量浓度为500 mg/mL，于4 ℃保存备用(保存时间不超过1周)。
1.2.2 最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)的测定
按无菌操作规程，取8支无菌试管，依次编号为1~8号，然后分别加入l.0 mL的肉汤培养基，在第1~7管肉汤培养基中分别加入菌液100 µL。取质量浓度为500 mg/mL口服液l.0 mL加入1号试管，混匀，取出l.0 mL加入2号试管，依次重复操作，第1~7试管药物质量浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.95 mg/mL。第8号管不加中药，作为空白对照。37 ℃培养24 h后取出，观察细菌生长情况，通过与无菌空白管对比颜色变化判定有无细菌生长。无细菌生长的最低质量浓度判定为中药的最小抑菌质量浓度(MIC)。取上述观察无细菌生长的试管中的液体均匀涂布于营养琼脂培养基平板，经37 ℃培养24 h后观察结果。以肉眼观察菌落不生长视为100%被杀灭，将此试管的中药质量浓度作为最小杀菌药物质量浓度(MBC)。
1.2.3 复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌菌体形态的影响
将培养至对数生长期的鸡白痢沙门氏菌用LB液体培养基释成密度为107 CFU/mL的菌液，取出2 mL菌液并加入18 mL质量浓度为MIC的复方板蓝根口服液置于试管中，置于摇床中培养(37 ℃，180 r/min) 10 h后，以6 000 r/min离心10 min，收集菌体。将正常培养至对数生长期的沙门氏菌作为对照组，扫描电镜观察菌体形态。
1.2.4 复方板蓝根对雏鸡鸡白痢沙门氏菌病的防治试验
试验选取150羽1日龄雏鸡，随机选取30羽雏鸡做空白对照，其余120羽采用人工感染鸡白痢沙门氏菌制备雏鸡感染模型，将感染雏鸡随机分为模型组、中药治疗组、西药治疗组和中药预防组，每组30羽。1日龄时，中药预防组分别灌服质量浓度为250 mg/mL的复方板蓝根口服液0.5 mL/羽，连续灌服3 d。5日龄时，空白组雏鸡灌服生理盐水0.5 mL/羽，其余各组雏鸡按1×109 CFU/mL剂量灌服菌液0.5 mL/羽。6~12 h部分出现临床症状后，中药治疗组灌服复方板蓝根口服液，质量浓度1 000 mg/mL，灌服给药0.5 mL/羽；西药治疗组用质量浓度25 mg/mL的恩诺沙星水溶液灌服给药，0.5 mL/羽；均连续灌服5 d。空白组、模型组与中药预防组连续给予5 d等量的生理盐水。观察并记录各组发病率及死亡率情况。
1.2.5 血清中IL-1β和TNF-α含量测定
各组分别于治疗1、3和5 d后，随机选取3羽，心脏采血，室温静置过夜，3 000 r/min离心10 min，分离血清，−20 ℃分装保存备用。按照试剂盒说明进行白细胞介素1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)含量的测定。
1.2.6 AvBD6和ChTLR15的mRNA在雏鸡肠道中的表达
提取雏鸡小肠总RNA，将RNA按反转录试剂盒说明书反转录成cDNA。实时荧光定量PCR检测AvBD6和ChTLR15在感染雏鸡小肠中的转录水平，引物序列见表1。PCR反应体系总体积为20 μL，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL，PCR Foeward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，ROX Refereence DyeⅡ (50×)，0.4 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O 6.0 μL。反应程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火34 s，40个循环。之后进行熔解曲线分析鉴定引物的特异性：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因的转录水平以平均值(2−ΔΔCt)表示。
表 1 AvBD6及ChTLR15实时荧光定量PCR引物Table 1. Primers of AvBD6 and ChTLR15 for real time fluorescence quantitative PCR基因
gene引物序列
primer sequence产物长度/bp
product sizeβ-actin F：TGCGTGACATCAAGGAGAAG 111 R：GACCATCAGGGAGTTCATAGC AvBD6 F：AGGATTTCACATCCCAGCCGTG 156 R：CGACATGGCCCAGGAATGCAG ChTLR15 F：GTTCTCTCTCCCAGTTTTGAAAATAGC 262 R：GTGGTTCATTGGTTGTTTTTAGGAC 1.3 数据处理
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2. 结果与分析
2.1 体外抑菌结果
2.1.1 MIC和MBC
由表2可知：复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌的最小抑菌质量浓度为62.5 mg/mL，最小杀菌质量浓度为125 mg/mL。
表 2 复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌的MIC和MBC结果Table 2. Results of compound radix isatidis oral solution CRIOS on the MIC and MBC of S. pullorum指标index 复方板蓝根口服液质量浓度/(mg·mL−1)
mass concentration of CRIOS31.25 62.5 125 250 500 MIC + － － － － MBC + + － － － 注：MIC. 最小抑菌质量浓度; MBC. 最小杀菌质量浓度；“+”. 有菌出现；“－”. 无菌。
Note: MIC. minimum inhibitory concentration; MBC. minimal bactericidal concentration; “+” indicates the presence of bacteria and “－” represents asepsis.2.1.2 复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌菌体形态变化的影响
扫描电镜下观察到鸡白痢沙门氏菌菌体呈中等直杆菌，两端钝圆(图1a)，复方板蓝根口服液作用10 h后，菌体出现溢缩，断裂形成许多残体，形状不规则，大小不一(图1b)。
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图 1 复方板蓝根口服液作用鸡白痢沙门氏菌扫描电镜结果(×20 000)Figure 1. Effect of compound radix isatidis oral solution on S. pullorum by scanning electron microscope2.2 体内防治
2.2.1 复方板蓝根口服液对雏鸡鸡白痢沙门氏菌病的防治
由表3可知：经中药和西药治疗后，发病鸡死亡率均降低，且西药治疗组的治疗效果优于中药治疗组，中药预防组的死亡率更低。此外，中药预防组的发病率低于中药和西药治疗组。说明复方板蓝根口服液能够有效预防雏鸡白痢沙门氏菌病。
表 3 复方板蓝根口服液防治效果Table 3. Effect of CRIOS on the clinical prevention and treatment分组
group总数
number发病数
number of cases发病率/%
incidence rate死亡数
number of deaths死亡率/%
mortality rate空白组blank group 30 0 0 0 0 模型组model group 30 26 86.7 21 70.0 中药治疗组Chinese medicine treatment group 30 24 80.0 14 46.7 西药治疗组drug treatment group 30 25 83.3 6 20.0 中药预防组Chinese medicine prevention group 30 12 40.0 4 13.3 2.2.2 血清中IL-1β含量测定
由图2可知：雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后IL-1β含量明显升高。治疗1 d时，模型组和中药治疗组与空白组的IL-1β含量差异极显著(P<0.01)；治疗3 d时，模型组、中药治疗组和中药预防组与空白组的IL-1β含量差异显著(P<0.05)；治疗5 d时，模型组与空白组具有显著性差异(P<0.05)，其余各组与空白组差异不显著。治疗1、3和5 d时，西药治疗组的IL-1β含量与模型组相比有效降低，中药治疗组则无明显变化；治疗5 d时，中药预防组的IL-1β含量也显著低于模型组 (P<0.05)，但与空白组差异不显著。
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图 2 感染鸡白痢沙门氏菌的雏鸡血清中IL-1β和TNF-α的含量注：与空白组比较，“Δ”表示差异显著(P<0.05)，“ΔΔ”表示差异极显著(P<0.01)；与模型组比较，“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)；下同。Figure 2. The contents of IL-1β and TNF-α in serum of chicks infected by SalmonellaNote: Compared with the blank group, “Δ” means significant difference (P<0.05), “ΔΔ” means significant difference (P<0.01); compared with the model group, “*” means significant difference (P<0.05); “**” means significant difference (P<0.01); the same as below.2.2.3 血清中TNF-α含量测定结果
由图2可知：雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后TNF-α含量明显升高。与空白组相比，治疗1和3 d时，各治疗组TNF-α含量均升高，且模型组与空白组具有极显著差异(P<0.01)；治疗5 d时，中药治疗组、西药治疗组和中药预防组的TNF-α含量趋于正常，与空白组差异不显著。治疗1、3和5 d时，中药治疗组、西药治疗组和中药预防组的TNF-α含量均极显著低于模型组(P<0.01)。
2.2.4 肠道中ChTLR15的转录水平
由图3可知：在肠道ChTLR15的转录水平上，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，治疗1、3和5 d时，模型组与空白组间差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05)，其余各组与空白组差异不显著。治疗1 d时，中药治疗组、中药预防组和西药治疗组与模型组差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)；治疗3和5 d时，西药治疗组和中药预防组与模型组相比差异显著(P<0.05)，中药治疗组与模型组差异不显著。
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图 3 染鸡白痢沙门氏菌的雏鸡肠道中ChTLR15和AvBD6的含量Figure 3. The contents of ChTLR15 and AvBD6 in intestines of chicks infected Salmonella2.2.5 肠道中AvBD6的转录水平
由图3还可知：在肠道AvBD6的转录水平上，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，治疗1 d时，模型组、中药治疗组和中药预防组与空白组间差异极显著(P<0.01)；治疗3 d时，模型组与空白组差异极显著(P<0.01)，中药预防组与空白组具有显著性差异显著(P<0.05)，治疗5 d时，模型组与空白组具有显著差异(P<0.05)，其余各组与空白组差异不显著。治疗1 d时，西药治疗组与模型组差异显著(P<0.05)；治疗3 d时，西药治疗组与模型组差异极显著(P<0.01)，中药治疗组和中药预防组差异显著(P<0.05)；治疗5 d时，模型组与中药治疗组、西药治疗组和中药预防组均具有显著差异(P<0.05)。
3. 讨论
板蓝根为解热解毒药，兽医临床常用于预防和治疗细菌和病毒的感染。本试验依据中兽医辩证理论，选用板蓝根、乌梅和诃子等中药进行组方，方剂中板蓝根清热解毒、凉血利咽；乌梅敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢；诃子涩肠止泻；诸药合用，可提高疗效。本试验结果显示：复方中药对鸡白痢沙门氏菌的最小抑菌质量浓度为62.5 mg/mL，最小杀菌质量浓度为125 mg/mL，有明显的抑制作用。通过扫描电镜观察发现复方板蓝根口服液作用菌体后形态结构发生了变化，表明复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌具有抑制作用。
家禽的天然免疫是机体抵抗病原菌侵染的第一道防线，在抗沙门菌感染中发挥着重要的作用[12]。当雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌时，激活机体天然免疫系统非常重要。然而在实际生产中，常因霉菌毒素超标或滥用抗生素导致免疫系统受到抑制[13]。一些如黄芪、党参等补益类中药具有激活机体非特异性免疫系统的功效。试验表明：复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌病的预防有一定的效果，能降低雏鸡的发病率及死亡率。感染鸡白痢沙门氏菌，治疗1 d后，除空白组外，其他各组的ChTLR15表达量显著升高，说明机体的免疫系统对微生物的刺激做出应答，并在先天性免疫和抗病力上发挥作用；中药预防组治疗5 d后，ChTLR15表达量下降，且与空白组差异不显著，说明机体感染沙门氏菌后体内ChTLR15表达增加，机体杀菌能力增强并调动了机体的免疫，有效控制了鸡白痢沙门氏菌对机体的损伤。证明复方板蓝根口服液预防给药能起到提高机体免疫和对抗病原微生物的作用。有报道称在沙门氏菌感染2 d雏鸡的各肠段组织中均能检测到ChTLR15 mRNA的转录水平增加[14]，与本试验结果相一致。
已有报道肠炎沙门菌感染鸡源巨噬细胞后，明显诱导ChTLR5等Toll样受体转录水平增加，同时炎性因子IL-1、IL-6、IL-1β和IL-18、趋化因子CCL4和CCL5以及其他抗菌物质转录水平明显增加，表明鸡巨噬细胞可通过Toll样受体依赖的途径抵抗沙门菌侵染[15-16]。治疗1 d后，模型组的IL-1β含量高于其他各组，说明鸡白痢沙门氏菌可诱导IL-1β大量释放；治疗5 d后，模型组与中药治疗组差异不显著(P>0.05)，西药治疗组和中药预防组与空白组差异不显著(P>0.05)，说明西药治疗组及中药预防组有较好的效果。在治疗后1、3和5 d后，中药预防组的IL-1β含量较低，可能是复方板蓝根口服液能够促进机体免疫力和耐受力，表明复方板蓝根口服液能有效预防原微生物对机体的损伤，快速有效地降低感染鸡白痢沙门氏菌雏鸡的炎性因子水平。雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，TNF-α含量显著升高；治疗1 d后，模型组TNF-α含量高于空白组，说明机体受到致病菌感染后，TNF-α含量会迅速升高，介导炎症反应；治疗后3和5 d，模型组TNF-α含量下降，但高于空白组；中药治疗组、西药治疗组和中药预防组与空白组差异不显著(P>0.05)。表明复方板蓝根口服液能快速有效的抑制TNF-α的分泌，减轻炎症反应，从而达到机体免受病原菌的侵害，对机体起到保护作用。
禽β-防御素(AvBDs)具有十分广泛的生物活性，对细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体都具有杀伤作用，还对免疫细胞有趋化功能，并参与免疫调节，在天然免疫中发挥着重要的作用。已有报道用定量RT-PCR法发现肉鸡感染鸡白痢沙门菌后AvBD6在鸡肠道内表达显著升高，AvBD6转录水平的差异性解释了在雏鸡感染鸡白痢沙门菌的早期阶段会诱导先天免疫反应[17-18]，与本研究结果一致，说明机体感染沙门氏菌后体内AvBD6表达增加，机体杀菌能力增强，并调动了机体的免疫，有效控制了鸡白痢沙门氏菌对机体的损伤。证明了复方板蓝根口服液预防给药能起到提高机体免疫和对抗病原微生物的作用。
4. 结论
复方板蓝根口服液对鸡白痢沙门氏菌有明显的抑制作用，其杀菌机制是通过改变菌体的形态结构使细菌丧失活性。试验证实复方板蓝根口服液可有效预防雏鸡白痢沙门氏菌病，并能有效降低体内炎性因子水平，减轻炎症反应。
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表 1 解淀粉芽孢杆菌和杀菌剂对葡萄白粉病的防治效果(宾川)
Table 1 Control effect of Bacillus amyloliquefaciens and bactericide on grape powdery mildew (Binchuan)
处理
treatment药前病指
disease index
before spraying第1次施药后
after the 1st spraying第2次施药后
after the 2nd spraying第3次施药后
after the 3rd spraying病情指数
disease index防效/%
control efficiency病情指数
disease index防效/%
control efficiency病情指数
disease index防效/%
control efficiency腈菌唑+吡唑醚菌酯
myclobutanil+pyraclostrobin78.20 58.20 40.49±4.31 b 37.80 61.86±3.00 a 22.80 77.20±1.83 a 解淀粉芽孢杆菌
B. amyloliquefaciens83.10 44.40 54.60±5.47 a 33.70 66.02±2.13 a 30.00 70.00±3.11 b 对照CK 83.60 97.80 99.10 100.00 注：不同小写字母表示处理间有显著差异 (P<0.05)；下同。
Note: Data in the same line with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05); the same as below.
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表 2 解淀粉芽孢杆菌和杀菌剂对葡萄白粉病的防治效果(寻甸)
Table 2 Control effect of B. amyloliquefaciens and bactericide on grape powdery mildew (Xundian)
处理
treatment药前病指
disease index
before spraying第1次施药后
after the 1st spraying第2次施药后
after the 2nd spraying第3次施药后
after the 3rd spraying病情指数
disease index防效/%
control efficiency病情指数
disease index防效/%
control efficiency病情指数
disease index防效/%
control efficiency腈菌唑+吡唑醚菌酯
myclobutanil+pyraclostrobin84.33 65.33 20.08±10.68 a 60.33 35.06±9.60 a 53.67 46.33±5.51 b 解淀粉芽孢杆菌
B. amyloliquefaciens78.33 68.67 16.58±4.23 a 51.67 44.11±11.26 a 35.00 65.00±8.89 a 对照CK 75.33 82.33 92.67 100.00
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表 3 葡萄叶片光合作用参数总体差异性分析
Table 3 Analysis of total difference of photosynthetic parameter in grape leaves
处理
treatment净光合速率平均值/(μmol·m−2·s−1)
average net photosynthetic rate气孔导度平均值/(mol·m−2·s−1)
average stomatal conductance胞间CO2浓度平均值/(μmol·mol−1)
average intercellular CO2 concentration解淀粉芽孢杆菌
B. amyloliquefaciens4.44±0.29 a 64.53±8.11 a 405.94±14.85 a 对照CK 3.35±0.16 b 37.03±3.75 b 372.78±13.52 a
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