铅是一种有毒重金属元素，在土表累积后，会影响土壤生化活性，降低农作物的产量，对动植物及人类造成不利影响。植物修复是治理重金属污染的一种可行的方法，开展植物对铅的生理抗(耐)性机理以及筛选抗性强的重金属土壤污染修复的植物具有重要意义。国内外研究表明：植物在铅胁迫下形态学上的反应表现为地上部分生长速度减缓，根系生物量减少，植物失水萎蔫及形态变化等方面^[1-2]，而在生理生化方面则主要表现在植物根系活力降低^[3]，细胞膜透性急剧增加^[4]，体内的保护酶系统修复功能减弱等方面^[5-6]。自然界中植物通过对铅离子的自我调控来使得自身能够生存，同时也减少了土壤中铅离子的含量，从而达到净化土壤的目的。因此，研究植物对铅胁迫的响应机制具有重要价值。

中华常春藤(Hedera nepalensisvar. sinensis)为五加科常春藤属多年生常绿植物。近年来在中国各地引种栽植，在林地植被恢复、城市园林绿化中具有极高的开发利用价值^[7]。当前，对中华常春藤的研究主要集中于城市绿化、养护管理^[8-9]和扦插繁殖^[10]等，在其生长及抑制因素影响分析^[11]、抗寒性及抗逆性^[12-15]等方面也有部分研究，而有关中华常春藤抗重金属胁迫的研究鲜有报道。本试验通过对中华常春藤进行不同浓度铅处理，探究不同程度的铅胁迫对中华常春藤生长发育的影响，为今后中华常春藤的栽培推广提供一定的依据，也为选择铅高富集植物提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

于2016年4月初选取当年生中华常春藤半木质化枝条扦插于育苗钵中，生根后于4月中旬移栽至底部直径为10 cm、为15 cm的玻璃瓶中进行水培，并用黑色的聚乙烯膜包裹玻璃瓶外部，防止光对根系的影响。采用不加蔗糖和琼脂的MS营养液进行水培，pH值为5.5~6.5。待植株生长稳定后，选取生长健壮、长势一致的当年生中华常春藤幼苗进行胁迫处理。

1.2   试验设计

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1.3   指标测定与分析

1.3.1   生长指标测定

用游标卡尺和卷尺分别进行株高、节间距、节间数的测量；观测中华常春藤胁迫前后叶片的数量并进行叶面积测量，收取所有植株，洗净，量取根系长度，并将根、茎、叶分开，放入烘箱80 ℃烘至恒重，称量植株根、茎、叶生物量及总生物量。

1.3.2   生理指标测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法，依据抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性高低；过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法，于紫外—可见分光光度计上读取并记录2 min内每2 s在波长470 nm处吸光光度值的变化。根据摩尔消光系数39.4 mM²/cm，计算酶活性；过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外分光光度法^[16]，将每1 分钟 OD降低0.1为1个酶活力单位；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TAB)法，用分光光度计(Μnicam ΜV-330，ΜSA)测定其在440、532及600 nm的吸光度；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，用分光光度计在595 nm处进行比色。以上指标均设3次重复。

1.4   数据处理与分析

试验数据使用Origin 9.1和Excel进行作图分析，数据统计分析利用SPSS 11.5软件进行一元方差分析(one-way ANOVA)，平均数间的多重比较采用Ducan’s检验方法。

2.   结果与分析

2.1   铅胁迫对中华常春藤株高、节间距和节间数的影响

由表1可知：随着Pb²⁺浓度的增加，中华常春藤株高表现为先下降再上升的趋势，与对照(CK)相比，A处理(轻度胁迫)和B处理(中度胁迫)下的株高和节间距均显著降低，而在C、D处理(重度胁迫)下的株高和节间距则显著增加，株高和节间距均在C处理时达到最大值。中华常春藤的节间距在A、B处理下，表现出明显的下降趋势，C、D处理下其与对照(CK)相比较无明显变化，三者同A、B处理间存在较为显著的差异。然而，在不同Pb²⁺浓度处理下中华常春藤的节间数变化并无显著差异(P>0.05)。

表  1  铅胁迫对中华常春藤株高、节间距和节间数影响

Table  1.  Effect of Pb²⁺ stress on growth indexes of H. nepalensis var. sinensis

处理 treatments	株高/cm plant height	节间距/cm internodes length	节间数 internode number
CK	18.82±3.46 b	2.84±0.70 b	5.20±1.30 a
A	13.22±2.58 a	1.73±0.73 a	5.40±1.34 a
B	12.36±0.99 a	1.70±0.37 a	4.80±1.10 a
C	26.70±5.76 c	3.70±0.96 b	6.00±0.00 a
D	23.60±4.51 bc	3.18±0.75 b	6.00±0.00 a
注：不同处理间不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。 Note: The different lowercase letters in different treatments show the significant difference at P<0.05; the same as below.

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2.2   铅胁迫对中华常春藤生物量的影响

由图1可知：在Pb²⁺胁迫下中华常春藤各项生物量指标均出现不同程度的变化。与对照(CK)相比，在A、B处理下其叶生物量、茎生物量及总生物量均呈显著下降趋势，特别是在B处理下；在C、D处理下除叶生物量、茎生物量表现为增加趋势外，其他生物量无明显变化。不同浓度Pb胁迫处理下，中华常春藤的总生物量大小变化呈现为D>C>CK>A>B。

图  1  铅胁迫对中华常春藤生物量的影响

注：不同处理间不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。

Figure  1.  Effect of Pb²⁺ stress on biomass of H. nepalensis var. sinensis

Note: The different lowercase letters in different treatments show the significant difference at P<0.05; the same as below.

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2.3   铅胁迫对中华常春藤叶片抗氧化酶活性的影响

由表2可知：在Pb²⁺胁迫处理下，与对照(CK)相比，中华常春藤叶片的SOD活性随着胁迫程度的加重呈上升的总趋势，SOD活性变化明显，在C处理时达到最大值，相比对照上升了8.1%；中华常春藤叶片POD活性变化呈无规律的波动下降趋势，其中B、C和D处理下其值各下降79.5%、55.6%和69.2%。在各浓度Pb²⁺胁迫下，中华常春藤叶片CAT活性表现为急剧的上升—下降趋势，差异性极为显著。在A、B处理下CAT活性变化尤为突出，出现了较大幅度的上升，与对照(CK)相比，分别上升了8.1倍和9.1倍，其他处理变化并不明显。

表  2  铅胁迫对中华常春藤抗氧化酶活性(鲜重)的影响

Table  2.  Effect of Pb²⁺stress on activities of antioxidant enzymes (fresh weight) of H. nepalensis var. sinensis

处理 treatments	SOD 活性/(U·g−1 ) superoxide dismutase activity	POD 活性/(mmol·min−1·g−1) peroxidase activity	CAT 活性/(μmol·min−1·g−1) catalase activity
CK	758.71±23.86 a	274.90±27.00 b	19.04±0.00 a
A	757.46±26.75 a	458.18±103.92 c	180.84±54.95 b
B	740.05±27.66 a	56.39±23.02 a	199.87±24.57 b
C	820.90±9.95 b	122.18±32.56 a	42.83±9.51 a
D	813.43±19.27 b	84.59±23.02 a	28.55±19.03 a

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2.4   铅胁迫对中华常春藤叶片可溶性蛋白含量的影响

由图2可知：随着所受Pb²⁺胁迫程度的增加，植物体内的可溶性蛋白含量呈上升趋势，且在C、D处理下变化最为明显，相较于对照(CK)分别上升了29.01%、35.19%。在Pb²⁺处理下，随处理浓度递增中华常春藤叶片的可溶性蛋白含量与对照(CK)存在显著的差异性。

图  2  铅胁迫对中华常春藤可溶性蛋白含量(鲜重)的影响

Figure  2.  Effect of Pb²⁺ stress on soluble protein (fresh weight) of H. nepalensis var. sinensis

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2.5   铅胁迫对中华常春藤叶片氧自由基和MDA的影响

由图3可知：Pb²⁺胁迫刺激了中华常春藤叶片氧自由基的产生及MDA的累积。A、B处理下MDA比对照组显著增加，其中，Ｂ处理比对照组升高了46.19%；而在C、D处理下MDA含量有所下降，但与对照(CK)相比差异并不显著。氧自由基含量在A、B处理下与对照组相比有所增加，但差异不显著；而在C、D处理下显著增加，与对照(CK)相比其值分别上升48.2%和56.3%。

图  3  铅胁迫对中华常春藤氧自由基和MDA含量(鲜重)的影响

Figure  3.  Effect of Pb²⁺ stress on the oxygen free radicals (OFR) and MDA contents (fresh weight) of H. nepalensis var. sinensis

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2.6   铅胁迫下中华常春藤生长和生理特性相关性分析

由表3对中华常春藤生长和生理特性相关性分析得知：铅胁迫后，植株各生长及生理指标间存在不同的相关性。其中，中华常春藤的株高与节间距、茎和叶的生物量、总生物量、SOD及氧自由基间均呈极显著正相关性，而与CAT和MDA存在负相关性；茎、叶及总生物量与SOD、CAT以及氧自由基、MDA之间也存在一定的相关性；同时，可以明显看出中华常春藤的氧自由基与SOD、CAT和可溶性蛋白之间也兼具极高的相关性，而其余指标相关性并不显著。

表  3  铅胁迫下中华常春藤生长和生理特性相关性分析

Table  3.  The correlation analysis between the growth and the physiological indexes of H. nepalensis var. sinensis to Pb²⁺ stress

参数 parameter	PH	IL	IN	RB	SB	LB	TB	SOD	POD	CAT	SP	ROS	MDA
株高	1.000
节间距	0.895**	1.000
节间数	0.448*	0.019	1.000
根生物量	0.137	0.062	0.075	1.000
茎生物量	0.656**	0.618**	0.278	−0.057	1.000
叶生物量	0.592**	0.606**	0.171	−0.114	0.628**	1.000
总生物量	0.705**	0.678**	0.272	−0.022	0.961**	0.814**	1.000
SOD	0.619**	0.579**	0.392	−0.242	0.438	0.630**	0.532*	1.000
POD	−0.324	−0.267	−0.170	−0.474*	−0.298	−0.185	−0.320	−0.268	1.000
CAT	−0.685**	−0.575**	−0.568*	0.013	−0.750**	−0.537*	−0.751**	−0.597**	0.215	1.000
可溶性蛋白	0.428	0.434	0.128	−0.161	0.138	0.207	0.165	0.577**	−0.451	−0.107	1.000
氧自由基	0.622**	0.537*	0.465*	−0.112	0.430	0.436	0.468*	0.691**	−0.371	−0.553*	0.758**	1.000
MDA	−0.487*	−0.524*	−0.066	0.090	−0.706**	−0.566*	−0.723**	−0.374	−0.011	0.745**	−0.017	−0.376	1.000
注：“*”表示差异 5%水平显著相关(P＜0.05)；“**”表示差异1%水平极显著相关(P＜0.01)。PH. 株高；IL. 节间距；IN. 节间数；RB. 根生物量；SB. 茎生物量；LB. 叶生物量；TB. 总生物量；SP. 可溶性蛋白。 Note：“**” shows significant difference at 0.01 level; “*” shows significant difference at 0.05 level. PH. height; IL. internode length; IN. internode number; RB. root biomass; SB: stem biomass; LB. length biomass; TB. total biomass; SP. soluble protein.

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3.   讨论

在不同浓度Pb²⁺胁迫下，中华常春藤生长形态及生理生化指标均受到不同程度的影响，中低浓度铅胁迫下，中华常春藤株高、节间距及生物量呈显著下降，这可能是该植物生长受到了明显刺激所产生的暂时性应激防御反应；而高浓度Pb²⁺胁迫下，株高及节间距都有较大幅度的增加，但生物量没有显著变化，有可能是高浓度Pb²⁺胁迫导致了该植物的异常徒长，或由于中华常春藤对铅具有较强的耐性。夏建国等^[17]在铅胁迫对茶树的研究中发现：Pb²⁺胁迫为400~1 500 mg/kg时，对春茶的生长有一定的促进作用，对夏茶的生长则有一定的毒害作用。孟晓霞等^[18]在Pb²⁺胁迫对西南山梗菜的研究中发现：Pb²⁺处理为1 000 mg/kg时，植物的各生物量指标最大，仅次于对照，这一结果与本研究相类似。每一种植物对重金属的生长响应不同，其耐受范围也不同。本研究中，800 μmol/L的Pb²⁺胁迫对中华常春藤的生长并未产生较大伤害，说明该植物对这一浓度范围的Pb²⁺有较好的耐受性。

植物的抗氧化酶系统对重金属胁迫比较敏感，POD、CAT和SOD是植物体内的3种重要活性酶。试验结果表明：中华常春藤叶片的CAT、POD活性在Pb²⁺胁迫下，呈现为先升高后下降的变化趋势，两者均存在极为显著的变化，其中POD活性的变化趋势与王艳等^[19]在铅胁迫下对紫穗槐的POD活性研究结果一致。而中华常春藤叶片的SOD活性则表现为波动性上升的变化趋势，在高浓度Pb²⁺处理下达到最大值，这可能是由于植物通过激活植物自身的抗氧化系统来抵御活性氧对细胞的伤害^[20-21]，抑制铅的跨膜运输，达到减缓铅对植物的毒害作用^[22]。在高浓度Pb²⁺处理下，中华常春藤的POD活性最小，这可能是由于POD合成酶下降，植株在Pb²⁺胁迫下其体内所产生的活性氧超过中华常春藤自身清除能力范围，不足以清除细胞内的自由基活性氧，从而引起细胞代谢失调，生长受阻。当铅浓度达到200 μmol/L时，其CAT活性最大，变化极为显著，产生这一变化的原因可能是植物在铅胁迫环境下所产生的应激反应。随着铅离子浓度的增加，超过植物所能忍受的阈值时，作为防御体系的酶活性也随之减弱，这符合植物对胁迫反应的典型特征，与ESTRELLA-GÓMEZ等^[3]的研究结果一致。可溶性蛋白作为植物渗透调节溶质的重要组成部分，其含量的增加有助于抵御逆境产生的不利影响，增强植株对外界环境的适应性。陶玲等^[23]对豆类作物生理特性进行的研究表明：抗铅性弱的植物其可溶性蛋白积累量低于抗铅性强的植物。中华常春藤幼苗的可溶性蛋白含量随着Pb²⁺浓度的增加呈递增趋势，与对照(CK)相比差异极为显著，说明中华常春藤是一种抗铅性强的植物。氧自由基是活性氧的一种，其产生可导致植物体内脂质过氧化、生物膜透性增加等伤害。随着Pb²⁺胁迫程度的加剧，中华常春藤叶片的氧自由基含量变化显著，总体变化趋势表现为急剧升高。在中低浓度胁迫下其氧自由基含量较低，可能是中华常春藤叶片的保护酶活性增加，分解氧自由基，促使其产生和清除达到平衡，有效地阻止氧自由基导致的脂质过氧化、生物膜透性增加等伤害过程；而在高浓度处理下其产生速率不断加剧，可能是由于高浓度Pb²⁺使得植物受到极为严重的不可逆伤害，保护酶活性不断降低，不足以清除显著增加的氧自由基，氧自由基的清除和产生失去动态平衡，从而使得大量的O₂^-积累，说明中华常春藤对一定区间范围内的Pb²⁺具有耐受性。MDA作为细胞中过氧化产物之一，对植物具有很强的细胞毒性。通过试验结果可以看出：中华常春藤的丙二醛含量表现为先升后降的趋势，在200 μmol/L浓度下，达最大值，相比对照(CK)增加了46.19%，之后呈下降趋势。这与POD活性变化相似，故MDA含量的变化可能与抗氧化酶活性变化有关，相似的结果在周朝彬等^[24]在铅胁迫对草木樨的研究中有过报道。在铅胁迫下，中华常春藤的生理指标具相关性且存在差异性，其SOD活性呈上升趋势，POD和CAT则表现为先升后降的不同趋势，这3种酶对铅胁迫的响应可能存在一定的差异，表现为相互协调作用。这进一步验证了在逆境胁迫下植物的应激机制具关联性^[25]，在植株受到胁迫时各项生理指标协调应对逆境，互相且共同作用，最终表现于形态方面，使得其生长指标与生理指标的相关性更为显著。

综上所述，在不同Pb²⁺浓度胁迫下，中华常春藤的生长及生理特性都受到了不同的影响，各项指标均随Pb²⁺浓度的增加呈波动性变化。中华常春藤对Pb²⁺具有一定适应性，在不同浓度的Pb²⁺胁迫环境下会做出相应的生理及生长响应，低浓度下植株生长受刺激，通过缓慢的生长代谢来调节自身以应对胁迫环境对其的伤害；而高浓度Pb²⁺胁迫下，会造成植株徒长，节间距拉长，生长异常，在短期内生物量并未受到影响。本研究说明中华常春藤对铅胁迫具有较强的耐性，可以作为铅污染地区的复垦或修复植物。