宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，位居女性生殖系统恶性肿瘤首位，发病早期无特异性症状，部分出现症状就诊时已进展至中晚期，目前多采用以手术和放化疗为主的综合治疗方案，毒副作用较强^[1-3]。阿霉素(doxorubicin，DOX)为蒽醌类高效广谱化疗药物，用于临床治疗各类恶性肿瘤，具有较大副作用，主要体现在心肌损伤，并伴随肌肉萎缩等不良症状，因此其临床应用受限^[4-5]。由于近年来女性患者人数逐渐增多，年龄逐渐年轻化，新型辅助药物的开发显得越发重要。熊果酸(ursolic acid，UA)，又称乌索酸、乌苏酸，为五环三萜类化合物，富含于苦丁茶中，苦丁茶老叶中熊果酸的平均含量为1.211%，嫩叶中熊果酸的平均含量为0.574%，具有广泛的生物学活性^[6-8]。许多研究发现：熊果酸能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤活性^[9-11]。本研究通过将熊果酸与阿霉素联合使用，初步探讨其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响，为熊果酸能否作为化疗辅助药物，减少阿霉素的使用剂量，以减轻抗癌药物的毒副作用提供依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

UA和DOX均购自北京索莱宝科技有限公司；宫颈癌HeLa细胞购自云南省细胞工程有限公司。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

细胞培养使用含10%胎牛血清(购自Hyclone公司)、1%青链霉素(北京索莱宝科技有限公司)的DMEM高糖培养基(购自Hyclone公司)，于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中进行培养。在倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞长满培养皿80%~90%时，进行传代培养。

1.2.2   MTT检测细胞存活率

将处于对数生长期的细胞以4×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，每孔200 μL，每组设5个复孔，置于培养箱中进行贴壁培养。待细胞贴壁后，进行加药处理，DOX质量浓度梯度为1、2、3、4、5、6、7、8和9 mg/L；UA浓度梯度为0、5、10、15和20 μmol/L；联用试验组为2 mg/L DOX分别与5、10、15和20 μmol/L UA联用。将细胞进行药物培养24 h，后加入MTT (购自上海碧云天生物技术有限公司)，每孔16 μL，继续培养4 h，吸除培养基，每孔加入160 μL DMSO (购自北京索莱宝科技有限公司)，使用酶标仪进行震板并在492 nm处检测吸光值，计算细胞存活率，采用Prism 8.0进行数据分析。

1.2.3   细胞形态学观察

将处于对数生长期的细胞以1.25×10⁵个/mL的密度、每皿4 mL的体积接种于60 mm培养皿中，放置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，进行4 h饥饿处理，后加药处理，处理组分别为0 (CK)、20 μmol/L UA、2 mg/L DOX、5 mg/L DOX和2 mg/L DOX+20 μmol/L UA。药物培养24 h后吸除培养基，使用PBS冲洗2次，在倒置显微镜下进行观察。

1.2.4   Hoechest染色

将处于对数生长期的细胞以1.25×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，每孔接种2 mL。待细胞贴壁后，进行4 h饥饿处理，后加药处理，药物处理剂量同1.2.3节。药物培养24 h后吸除培养基，使用PBS冲洗1次，再加入1 mL培养基，并加入10 μL Hoechst 33342活细胞染色液(100 ×) (购自上海碧云天生物技术有限公司)染色10 min，吸除培养基，用PBS冲洗3次，在倒置荧光显微镜下进行观察并拍照。

1.2.5   Western-blot法检测HeLa细胞凋亡相关蛋白的表达

将处于对数生长期的细胞以1×10⁶个/mL的密度、每皿4 mL的体积接种于60 mm培养皿中。待细胞贴壁后，进行4 h饥饿处理，后进行加药处理，培养12 h。收集处理后的各组细胞，用预冷的PBS (购自北京索莱宝科技有限公司)缓冲液洗细胞2次，加入预冷的裂解液(购自上海美仑试剂有限公司) 100 μL处理细胞，在冰上裂解30 min后用4 ℃离心机14 000 r/min高速离心15 min，收集上清液，进行BCA (购自上海碧云天生物技术有限公司) 蛋白定量检测。采用湿转膜法将目标蛋白转移至PVDF膜上，使用TBST进行洗涤，5% 脱脂奶粉封闭1 h，后铺一抗：Bax Antibody (购自Cell Signaling Technology)、Bcl-2 Antibody (购自Cell Signaling Technology)、Caspase-3 Antibody (购自abcam)和Beta Tubulin Antibody (购自Cell Signaling Technology)，置于4 ℃摇床上孵育过夜。后铺相应二抗室温孵育1 h，经TBST溶液洗涤后，将曝光液(购自北京四正柏生物科技有限公司)均匀滴在PVDF膜置上进行曝光，并使用ImageJ软件对条带灰度值进行分析，采用Prism 8.0进行数据分析。

1.2.6   统计学分析

数据采用SPSS 17.0软件进行分析，单因素分析采用AVONA进行数据处理，图像处理采用imageJ，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果与分析

2.1   UA与DOX单独使用对HeLa细胞存活率的影响

当UA浓度为5 μmol/L时，HeLa细胞存活率与对照组不存在显著差异(图1)；当UA浓度增加至10 μmol/L以后，细胞存活率极显著低于对照组(P<0.01)，抑制效果增强；当UA浓度为20 μmol/L时，细胞存活率最低，抑制效果最为显著。当DOX质量浓度为1~3 mg/L时，HeLa细胞存活率与对照组相比显著降低(P<0.01)；当DOX质量浓度为3~8 mg/L时，虽然与对照组相比显著降低(P<0.01)，但处理组之间不存在显著差异。

图  1  UA与DOX单独使用对HeLa细胞存活率的影响

注：同一细胞不同处理组相比，图柱上标不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)；下同。

Figure  1.  The effects of UA and DOX uesed alone on the survive rate of HeLa cells

Note: Among different groups in the same tissues different small letters indicate significant difference (P<0.05), different capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01); the same as below.

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2.2   UA与DOX联用对HeLa细胞存活率的影响

选取5、10、15、20 μmol/L UA分别与2 mg/L DOX进行联用，由图2可知：4组不同浓度的UA和2 mg/L DOX联用分别与2 mg/L DOX单独使用相比，细胞存活率均极显著降低(P<0.01)，且4个联用组的细胞存活率均极显著低于5 mg/L DOX单独使用；5、10、15 μmol/L UA与2 mg/L DOX的3组联用分别与相应的3个不同浓度的UA单独使用相比，细胞存活率均极显著降低(P<0.01)，而20 μmol/L UA和2 mg/L DOX联用与20 μmol/L UA相比，细胞存活率不存在显著差异，但显著低于15 μmol/L UA单独使用，达到UA与DOX联用作用效果最高剂量。

图  2  UA和DOX联用对HeLa细胞存活率的影响

Figure  2.  The effect of the combination of UA and DOX on the survival rate of HeLa cells

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2.3   UA与DOX联用细胞形态学观察

细胞具有表面结构和自身表面张力，以及受到外界的机械压力，能够保持一定的形态。细胞形态学观察发现(图3)：经20 μmol/L UA和2 mg/L DOX单独给药处理的HeLa细胞的形态由梭状转变为不规则形状，细胞密度降低、细胞分离数增加；经5 mg/L DOX单独处理的HeLa细胞形态明显皱缩，由梭状变为圆形，细胞密度明显降低；联用组(20 μmol/ UA+2 mg/L DOX)处理的HeLa细胞形态变化最为明显，由梭状变为圆形，而细胞密度变化不太明显。

图  3  HeLa细胞形态

Figure  3.  Cell morphology of HeLa

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2.4   UA与DOX联用细胞凋亡观察

Hoechst是一种可穿透细胞膜的蓝色荧光探针，常用细胞凋亡检测。在荧光显微镜下，活细胞核呈现弥散均匀荧光；出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质可见浓染致密的颗粒块状荧光。如图4所示：联用组(20 μmol/L UA+2 mg/L DOX)给药处理的HeLa细胞出现较强的浓染致密的颗粒块状荧光(红色圆圈所示)。因此，联用组细胞凋亡数量高于单独用药组。

图  4  Hoechest染色

注：红色圆圈内为较强荧光颗粒。

Figure  4.  Staining of Hoechest

Note: Strong fluorescent particles are in the red circle.

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2.5   HeLa细胞促凋亡相关蛋白的表达

相关促凋亡蛋白的表达结果如图5所示：对于Cleaved caspase-3蛋白表达量，联合用药组(20 μmol/L UA +2 mg/L DOX)显著高于20 μmol/L UA单独使用(P<0.05)，但与2 mg/L DOX相比，没有显著差异；联用组Bax/Bcl-2表达量分别与20 μmol/L UA和2 mg/L DOX单独使用相比，也没有显著差异。

3.   讨论

本研究MTT结果显示：熊果酸可显著降低HeLa细胞的活性，与阿霉素联用效果高于2种药物单独使用效果，且高于较高质量浓度的阿霉素单独使用效果，这发挥了熊果酸抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用^[10]。

在细胞形态学中，二者联用对细胞形态的影响较为明显；细胞凋亡观察结果中发现：出现较强的浓染致密的颗粒块状荧光，即凋亡细胞数较多。此外，有研究表明：经熊果酸可诱导人乳腺癌细胞凋亡，导致核固缩，细胞核呈致密浓染的颗粒块状荧光^[12]，该结果与本试验结果一致。

关于促凋亡蛋白，半胱天冬蛋白酶Caspase-3是细胞凋亡的级联反应途径中的执行者，在Caspase家族介导的凋亡通路中，级联反应最终聚集于此，并将刺激信号往下传导，可与大量的蛋白因子共同调控细胞凋亡，具有不可逆作用^[13]。Caspase-3活化可导致细胞凋亡进入不可逆阶段，最终使得核小体间DNA降解，细胞发生凋亡^[13-15]；B细胞淋巴瘤/白血病-2基因即Bcl-2基因是一种原癌基因，它具有抗凋亡作用。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，具有促进细胞凋亡的功能，在通过线粒体应激诱导的细胞凋亡中起关键作用，是细胞凋亡内源性线粒体途径的重要调节因子，通常以二者比值判断细胞凋亡状态。有研究表明：线粒体跨膜电位的改变预示细胞可能出现凋亡^[16]。熊果酸可保护心脏免受阿霉素引起的伤害，其通过增加AKT磷酸化水平和增强内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，同时抑制阿霉素诱导的eNOS通过NADPH氧化酶4 (NOX4)下调解偶联^[17]。本试验结果提示：二者联用可达到减少阿霉素毒副作用的效果。有研究表明：高剂量熊果酸(50 mg/kg)可以降低阿霉素肾病小鼠的尿蛋白，抑制肾小管间质TGF-β1蛋白的表达，减轻阿霉素的毒副作用^[18]。Western-blot结果显示：Cleaved caspase-3蛋白含量(图5)联用组低于高剂量阿霉素组，与熊果酸单独用药组存在差异性(P<0.05)，但与低剂量阿霉素组不存在差异性，这可能与熊果酸的给药剂量有关。相关研究显示：20~50 μmol/L熊果酸作用于HuH7肝癌细胞8 h后，能呈剂量依赖性地下调凋亡相关蛋白 (XIAP) 的表达量^[19]。而Bax蛋白含量不存在差异性，可能是进行了细胞核凋亡途径，此外，还可能与药物作用时间、给药浓度以及相关凋亡通路有关，具体作用机制还有待深入研究。

图  5  促凋亡蛋白的表达量

注：HeLa细胞分别用20 μmol/L UA (U)、2 mg/L DOX (D1)、5 mg/L DOX (D2)、20 μmol/L UA+2 mg/L DOX (UD)培养12 h，并设置空白对照组(control)。

Figure  5.  Levels of proteins associating with apoptosis

Note: HeLa cells were cultured with 20 μmol/L UA (U), 2 mg/L DOX (D1), 5 mg/L DOX (D2), 20 μmol/L UA+2 mg/L DOX (UD) for 12 hours and set blank control group (control).

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4.   结论

MTT结果显示：熊果酸与阿霉素联用效果高于2种药物单独使用效果；联用效果在细胞形态学结果中变化最为明显，由梭状变为圆形，且在荧光染色中出现较强的浓染致密的颗粒块状荧光，细胞凋亡较多。而根据相关细胞凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2的表达量结果显示：二者联用的作用机制可能是进行了细胞核凋亡途径，具体机制仍需探究。因此，二者在一定程度上减少阿霉素的使用剂量，增强阿霉素对宫颈癌HeLa细胞的治疗作用。