津巴布韦烟草丛顶病病原物的分子鉴定
Molecular Identification of the Causative Agents of Tobacco Bushy Top Disease in Zimbabwe
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Keywords:
- Zimbabwe /
- tobacco bushy top disease /
- virus complex /
- satellite RNA /
- potato leafroll virus
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烟草丛顶病(tobacco bushy top disease，TBTD)是一种严重危害烟草的病毒病害，该病最早于1958年在津巴布韦北部烟区报道，随后在南非和马拉维等撒哈拉以南非洲多个地区广泛发生，造成巨大的经济损失[1-2]。早期通过对津巴布韦烟草丛顶病症状、寄主范围和传播途径等研究认为：烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus，TBTV) 和烟草脉扭病毒(tobacco vein distorting virus，TVDV)为该病的病原物[1,3]。NDOWORA[4]对1个津巴布韦TBTV分离物(TBTV-A2)进行了初步的分子生物学研究，分析了感病烟株的双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)组成。
自1993年以来，烟草丛顶病在中国云南烟区大面积发生，造成了严重的经济损失[5]。对中国烟草丛顶病病原复合体的分子鉴定表明：该病原复合体的组分包括幽影病毒属(Umbravirus)的TBTV及其卫星RNA[6]以及马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的TVDV及其伴随RNA[7-8]。
埃塞俄比亚近年来暴发了烟草丛顶病，对当地烟叶生产造成了严重的影响。ABRAHAM等[9]研究表明：埃塞俄比亚烟草丛顶病由1个病原复合体引起，该复合体由1个幽影病毒属成员——埃塞俄比亚烟草丛顶病毒(Ethiopian tobacco bushy top virus，ETBTV)及其卫星RNA以及马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus，PLRV)组成。分子系统进化分析表明：ETBTV与幽影病毒属花生丛簇病毒(groundnut rosette virus，GRV)亲缘关系最近，两者基因组全长核苷酸序列的一致性为70.7%，而与中国TBTV基因组全长核苷酸序列的一致性仅为59.3%，故ETBTV与TBTV是2种不同的病毒。
马拉维位于津巴布韦南部，烟草丛顶病对当地烤烟生产造成严重的危害[1]。UDAGAWA等[10]应用深度测序技术获得了TBTV马拉维分离物(TBTV-MW)基因组全长核苷酸序列，其与ETBTV基因组全长核苷酸序列一致性为87.7%，而与中国TBTV基因组全长核苷酸序列一致性为51.6%，表明TBTV-MW为ETBTV的分离物(ETBTV-Malawi)。
除了TBTV-A2复制酶基因片段(549 nt)序列(GenBank登录号：AJ704818)被测定外，津巴布韦烟草丛顶病研究局限于病害的普通生物学特征，未完成病原物的分子鉴定工作，它与其他国家烟草丛顶病病原物之间的区别也未见报道。本研究采集了1个津巴布韦烟草丛顶病样品，开展其病原物分子鉴定。研究结果将明确津巴布韦烟草丛顶病病原复合体的组分及分类地位，明确不同国家发生的烟草丛顶病病原物之间的关系。
1. 材料与方法
1.1 样品来源
津巴布韦烟草丛顶病烟株样品采集自津巴布韦哈拉雷市郊区农场，经过蚜虫连续传播接种烤烟(品种K326)，活体隔离保存于云南省烟草农业科学研究院研和试验基地。病株表现褪绿黄化、侧枝丛生和节间缩短等烟草丛顶病典型症状。
1.2 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物基因组全长核苷酸序列分析
应用VALVERDE等[11]的方法提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的dsRNA，总dsRNA经过琼脂糖电泳分离后，纯化长度约为4 kbp的烟草丛顶病毒津巴布韦分离物(TBTV-Zimbabwe)dsRNA复制中间型。参考ATTOUI等[12]的方法对病毒的5′和3′端进行扩增，所用特异引物根据ETBTV基因组序列设计，分别为ZTBTVR281(5′-CCTCATTGGGTGGTGTGGTG-3′)和ZTBTVF3861 (5′-TAAGCTCGGGTGTGTGAACC-3′)；扩增产物经过切胶纯化(QIAquick Gel Extraction Kit)后，连接PMD-19T载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa)；经过菌落PCR筛选，提取重组质粒进行插入片段序列测定(Invitrogen)。根据获得的基因组两端序列设计引物ZTBTV5 (5′-GGGTTTCAACATGGCAATTCGAGCAATAAC-3′)和ZTBTV3 (5′-GGGCGCGCGGGGGTGAAATCCCGCCGCTA-3′)，然后进行病毒基因组全长序列扩增；扩增产物经过切胶纯化，插入双元载体PCB301-CH (数据未发表)中，应用基因组步移法对插入片段进行序列测定(Invitrogen)。
基因组片段序列应用DNASTAR软件组装，获得TBTV-Zimbabwe基因组全长序列。应用NCBI在线分析软件ORF Finder，结合BLAST等生物信息学分析工具对TBTV-Zimbabwe基因组进行注释。应用DNASTAR软件进行TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员基因组核苷酸序列以及基因组编码的推测蛋白质氨基酸序列对比，应用MEGA X软件的NJ法构建分子系统进化树，进化树节间的数值为1 000次自展法检验的结果[13]。参加比较的病毒及其基因组序列GenBank登录号为：胡萝卜拟斑驳病毒(carrot mottle mimic virus，CMoMV，U57305)、胡萝卜斑驳病毒(carrot mottle virus，CMoV，FJ188473.1)、ETBTV (KJ918748.1)、 花生丛簇病毒(groundnut rosette virus，GRV，Z69910.1)、罂粟花叶病毒(opium poppies mosaic virus，OPMV，EU151723.4)、豌豆耳突花叶病毒2号(pea enation mosaic virus-2，PEMV-2，U03563.1)、TBTV (AF402620.2)、烟草斑驳病毒(tobacco mottle virus，TMoV，AY007231)、小苦荬黄斑驳病毒2号(ixeridium yellow mottle virus 2，IxYMV2，KT946712.1)和ETBTV-Malawi (LC494673.1)。
1.3 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物卫星RNA基因组全长核苷酸序列分析
提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的dsRNA，纯化长度约为0.5 kbp的TBTV-Zimbabwe卫星RNA的dsRNA复制中间型，参考已有方法[6,12]对该病毒卫星RNA全长基因组进行扩增。扩增产物序列测定和分析方法同1.2节。
1.4 津巴布韦烟草丛顶病样品中马铃薯卷叶病毒属成员的分子鉴定
采用Trizol试剂(Invitrogen)提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的总RNA，以此为模板，应用黄症病毒科(Luteoviridae)的通用引物[14]，采用一步法RT-PCR (TaKaRa)对样品中可能存在的黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员的外壳蛋白(coat protein，CP)基因片段进行扩增。扩增产物序列测定和分析方法同1.2节。
2. 结果与分析
2.1 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物分子鉴定
TBTV-Zimbabwe基因组全长核苷酸序列为4185 nt (GenBank登录号：MW113249 )。编码4个开放阅读框架(open reading frame，ORF)，其基因组结构具有幽影病毒属的典型特征[15]。ORF1 (11~886 nt)编码推测的P1蛋白与病毒复制有关；在ORF1终止密码子(884~886 nt)上游发现开放阅读框架-1移码信号(877~883 nt，GAATTTT)，通过在该位置的移码翻译产生ORF1-2的翻译产物P1-2，ORF1-2 (11~2547 nt)编码推测的病毒复制酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF3 (2679~3467 nt)编码的P3蛋白为推测的病毒多功能蛋白；ORF4 (2773~3549 nt)编码的P4蛋白为推测的病毒细胞间运动蛋白。TBTV-Zimbabwe基因组有3个非编码区，分别是5′端非编码区(1~10 nt)、基因间非编码区(2548~2678 nt)和3′端非编码区(3550~4185 nt) (图1)。
TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员在基因组全长核苷酸序列水平上的一致性为47.8%~94.6%，其中与ETBTV和ETBTV-Malawi序列的一致性最高，分别为94.6%和87.5%；与在非洲发生流行的GRV序列一致性为71.6%；与TBTV序列一致性仅为56.9% (表1)。根据幽影病毒属各成员基因组全长序列构建的分子系统进化树(图2a)显示：TBTV-Zimbabwe与ETBTV和ETBTV-Malawi位于一个进化分支，它们与GRV亲缘关系较近，TBTV则与OPMV位于另一个进化分支。
表 1 TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属成员基因组序列和蛋白质氨基酸序列的一致性Table 1. Genome sequence identities and amino acid sequence identities of the putative proteins between TBTV-Zimbabwe and other umbraviruses% 参比病毒
reference viruses基因组核苷酸
序列一致性
genome sequence identityP1氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P1P1-2氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P1-2P3氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P3P4氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P4CMoMV 47.8 29.2 49.2 17.6 37.7 CMoV 48.8 31.4 49.0 15.6 41.6 ETBTV 94.6 91.1 95.9 90.1 96.1 ETBTV-Malawi 87.5 85.2 92.0 79.0 90.3 GRV 71.6 54.1 73.5 51.0 77.9 IxYMV2 52.7 28.4 48.5 28.3 39.3 OPMV 56.1 35.9 56.4 39.0 56.8 PEMV-2 52.1 30.9 49.0 35.6 58.4 TBTV 56.9 33.4 57.8 38.1 64.7 ![]()
图 2 幽影病毒属分子系统进化树注：系统进化树分别根据幽影病毒属成员基因组全长核苷酸序列(a)、推测的P1蛋白(b)、P1-2蛋白(c)、P3蛋白(d)和P4蛋白(e)的氨基酸序列构建。Figure 2. Phylogenetic trees of umbravirusesNote: The phylogenetic trees were inferred from genomic sequences of umbraviruses (a), amino acid sequences of putative umbraviral P1s (b), P1-2s (c), P3s (d) and P4s (e).由表1还可知：TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员P1蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为29.2%~91.1%，其中与ETBTV和ETBTV-Malawi的序列一致性最高，分别为91.1%和85.2%；TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员的P1-2蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为49.0~95.9%，其中与ETBTV和ETBTV-Malawi的序列一致性最高，分别为95.9%和92.0%；TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员P3蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为15.6%~90.1%，其中与ETBTV和ETBTV-Malawi的序列一致性最高，分别为90.1%和79.0%；TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员P4蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为37.7%~96.1%，其中与ETBTV和ETBTV-Malawi的序列一致性最高，分别为96.1%和90.3%。根据幽影病毒属成员P1、P1-2、P3和P4蛋白氨基酸序列分别构建的分子系统进化树(图2b~e)显示：TBTV-Zimbabwe与ETBTV和ETBTV-Malawi位于一个进化分支，TBTV则与OPMV位于另一个进化分支。
2.2 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物卫星RNA分子鉴定
TBTV-Zimbabwe卫星RNA基因组全长核苷酸序列为522 nt (GenBank登录号：MW113250)，不编码ORF。TBTV-Zimbabwe卫星RNA与ETBTV卫星RNA (GenBank登录号：KJ918747)和TBTV卫星RNA (GenBank登录号：KU997687)基因组全长核苷酸序列的一致性分别为93.9%和42.9%。BLAST分析表明：TBTV-Zimbabwe卫星RNA与GenBank数据库中除ETBTV卫星RNA各个分离物外的其他序列无同源性。
2.3 津巴布韦烟草丛顶病样品中马铃薯卷叶病毒的分子鉴定
应用黄症病毒科通用引物对津巴布韦烟草丛顶病样品提取的总RNA进行RT-PCR扩增，在津巴布韦样品中获得约550 bp的目标片段，显示有马铃薯卷叶病毒属成员的存在。序列分析表明：该扩增片段为马铃薯卷叶病毒属马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus，PLRV)外壳蛋白的部分序列。该序列与GenBank登录的其他PLRV分离物在核苷酸水平上的一致性为95.3%~96.1%；其编码的病毒外壳蛋白氨基酸序列与其他PLRV分离物的一致性为94.3%~97.8%，而与TVDV的一致性仅为58.5%。说明津巴布韦烟草丛顶病病原复合体包含PLRV。
3. 讨论
根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分类报告，幽影病毒属目前有11个确定成员：CMoMV、CMoV、ETBTV、GRV、IxYMV2、莴苣小斑驳病毒(lettuce speckles mottle virus，LSMV)、OPMV、败酱草和性斑驳病毒(patrinia mild mottle virus，PMMV)、PEMV-2、TBTV和TmoV；该属的暂定成员有菜豆黄脉带病毒(bean yellow vein-banding virus，BYVBV)、向日葵皱缩病毒(sunflower crinkle virus，SuCV)、向日葵黄斑病毒(sunflower yellow blotch virus，SuYBV)和烟草黄脉病毒(tobacco yellow vein virus，TYVV)。幽影病毒属内种的划分原则为：天然寄主范围、dsRNA带型、基因组核苷酸序列一致性小于70%、与代表大部分基因组的cDNA探针不能杂交或者杂交很弱[15]。本研究表明：TBTV-Zimbabwe具有典型的幽影病毒属成员基因组结构特征。分子系统进化分析显示：TBTV-Zimbabwe与ETBTV和ETBTV-Malawi亲缘关系很近，而与TBTV亲缘关系较远。本研究中TBTV-Zimbabwe与另一个津巴布韦TBTV分离物TBTV-A2复制酶基因部分序列在核苷酸水平上的一致性为94.5%，在氨基酸水平上的一致性为97.3%。根据ICTV幽影病毒属内种的划分原则，津巴布韦烟草丛顶病病原之一的TBTV-Zimbabwe应是ETBTV的分离物，它与中国烟草丛顶病病原之一的TBTV分别属于幽影病毒属内不同的病毒种。
根据ICTV的分类报告，幽影病毒属病毒的卫星RNA有4种：CMoMV卫星RNA、GRV卫星RNA、PEMV卫星RNA和TBTV卫星RNA[16]。埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体包含ETBTV的卫星 RNA[9]。本研究中TBTV-Zimbabwe卫星RNA与ETBTV卫星RNA基因组全长核苷酸序列一致性为93.9%，这2个病毒卫星RNA应归为1个种。
本研究在津巴布韦烟草丛顶病植株中检测到马铃薯卷叶病毒属的PLRV，埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体中除ETBTV及其卫星外，也含有PLRV[9]，表明PLRV为非洲发生的烟草丛顶病病原复合体的组分之一。中国烟草丛顶病病原复合体中的马铃薯卷叶病毒属成员为烟草脉扭病毒(TVDV)[7]。中国烟草丛顶病病原复合体中包含TVDV伴随RNA，为马铃薯卷叶病毒属伴随RNA组成员[8]。应用马铃薯卷叶病毒属伴随RNA组通用引物[17]对津巴布韦烟草丛顶病样品总RNA进行RT-PCR扩增，未扩增出目标条带。对本研究的津巴布韦烟草丛顶病样品分别应用小RNA深度测序和转录组深度测序的方法进行测定并注释其中含有的病毒序列，也未发现马铃薯卷叶病毒属伴随RNA组成员(数据未发表)。
4. 结论
津巴布韦烟草丛顶病病原复合体的病毒组分分别为ETBTV、ETBTV卫星RNA和PLRV，与埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体的相应组分在病毒种的分类水平上一致，但与中国烟草丛顶病病原物在分子水平上差异较大。
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图 2 幽影病毒属分子系统进化树
注：系统进化树分别根据幽影病毒属成员基因组全长核苷酸序列(a)、推测的P1蛋白(b)、P1-2蛋白(c)、P3蛋白(d)和P4蛋白(e)的氨基酸序列构建。
Figure 2. Phylogenetic trees of umbraviruses
Note: The phylogenetic trees were inferred from genomic sequences of umbraviruses (a), amino acid sequences of putative umbraviral P1s (b), P1-2s (c), P3s (d) and P4s (e).
表 1 TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属成员基因组序列和蛋白质氨基酸序列的一致性
Table 1 Genome sequence identities and amino acid sequence identities of the putative proteins between TBTV-Zimbabwe and other umbraviruses
% 参比病毒
reference viruses基因组核苷酸
序列一致性
genome sequence identityP1氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P1P1-2氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P1-2P3氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P3P4氨基酸序列一致性
amino acid sequence
identity of P4CMoMV 47.8 29.2 49.2 17.6 37.7 CMoV 48.8 31.4 49.0 15.6 41.6 ETBTV 94.6 91.1 95.9 90.1 96.1 ETBTV-Malawi 87.5 85.2 92.0 79.0 90.3 GRV 71.6 54.1 73.5 51.0 77.9 IxYMV2 52.7 28.4 48.5 28.3 39.3 OPMV 56.1 35.9 56.4 39.0 56.8 PEMV-2 52.1 30.9 49.0 35.6 58.4 TBTV 56.9 33.4 57.8 38.1 64.7 
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