铁皮石斛粗多糖预防化疗性肠道黏膜炎作用的研究
Effect of Dendrobium Officinale Polysaccharide on the Prevention of Chemotherapy-induced Intestinal Mucositis
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竹子是禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，全世界有竹类植物1 200余种，中国是世界上竹类资源最丰富的国家，素有“竹子王国”之称[1-3]。竹叶在中国具有悠久的食用和药用历史[4]，《本草求真》《本草逢原》等古代医学著作均有大量记载。有研究表明：竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖等有效成分，应用价值极大[5]；尤其是竹叶黄酮具有显著的抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、抗癌、抗衰老、抗心血管疾病、抗菌抗炎、增强免疫、抗辐射及保肝等多种功效[6-7]。竹叶具有广谱抗菌性，在中性条件下竹叶防腐剂有很强的抑菌作用，其防腐性能明显优于山梨酸钾和苯甲酸钠[8]，如超声波微波提取法提取的竹叶提取液对食源性细菌的生长有较高的抑制作用，可用于天然食品防腐剂的开发[9]。国外主要是日本对竹叶防腐剂的应用进行研究，如日本中山食品技术研究所从竹叶中提取出高效天然食品防腐剂，其防腐效果比现有天然防腐剂高1倍[10]。但目前鲜有以粉单竹为原料的竹叶提取物的抑菌防腐报道。
本研究以粉单竹 (Bambusa cerosissima McClure) 为材料，采用系统分离法萃取分离粉单竹竹叶水提液，以打孔法研究竹叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酿酒酵母和黄曲霉等常见微生物的抑菌活性和最低抑菌质量浓度，同时考察了温度、pH、紫外线和化学药剂等外界因素对其抗菌活性的影响，为进一步开发利用粉单竹竹叶提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
粉单竹 (B. cerosissima) 竹叶采于广东省湛江市寸金公园，洗净、晾干，打粉装入封料袋中备用。
细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 和大肠杆菌(Escherichia coli)，真菌包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黄曲霉(Aspergillus flavus)，均为岭南师范学院微生物实验室保存菌种。
细菌用培养基为营养琼脂培养基(nutrient agar medium)：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1 L，加热溶解，调pH 7.0~7.2，然后121 ℃灭菌30 min。真菌用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，去皮、去芽眼，切片，加水煮沸30 min，加水至1 L，加入葡萄糖20 g溶解后，121 ℃灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 竹叶提取物的制备与分离
把300 g竹叶粉放在锅里煮沸，浓缩提取至100 mL，减压干燥得竹叶粗提物；粗提液转入500 mL 分液漏斗中，加入200 mL石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，得上层的石油醚萃取液，剩余水相用同样的方法再萃取4次，每次分别加入200、150、100和50 mL石油醚，将5次石油醚萃取液合并，在35~40 ℃下减压回收石油醚，得到墨绿色脂状物124.2 mg，为石油醚萃取物；石油醚萃取下层水相再分别加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，按上述操作分别得到4个样品：氯仿萃取物1 37.3 mg、乙酸乙酯萃取物519.8 mg、正丁醇萃取物1 500 mg和萃余水相物285.0 mg。5种萃取物即竹叶总提取物共2 566.3 mg。
1.2.2 粉单竹竹叶提取物抑菌活性的测定
细菌经37 ℃ 24 h、真菌经28 ℃ 48 h恒温培养活化后制备10倍系列稀释的菌悬液。取合适浓度菌液或孢子涂布平板，打孔法检测抑菌活性，即每皿打3个孔(抑菌试验孔直径1 cm，稳定性试验孔直径0.6 cm)，每孔加入20 μL提取物样液。细菌经37 ℃ 24 h、真菌经28 ℃ 48 h培养后，以抑菌圈直径作为竹叶抑菌活性指标，重复3次，直径越大抗菌活性越强。
1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定
取各菌稀释的菌悬待测液依次进行梯度稀释，以上述打孔法测定生长抑制率，重复3次，最小抑制率对应浓度为最低抑菌浓度。
1.2.4 外界条件对抑菌稳定性的影响
10倍稀释的竹叶粗提物稀释液，以大肠杆菌和酿酒酵母为指示菌，抑菌圈法检测其抑菌活性稳定性，重复3次。
(1) 温度影响
竹叶粗提物分别置于4、60、80和100 °C水浴和121 °C湿热条件 (水蒸气高压灭菌)，对照样置于30 °C条件，各处理20 min，进行测定其抑菌活性。
(2) pH影响
竹叶粗提物分别调节pH为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，比较样品的抑菌效果。
(3) 紫外线影响
将竹叶粗提物倒入无菌平皿中，铺成约1 mm薄层，在无菌条件下用40 W紫外灯距50 cm处照射l、2、3、4、5和6 h。以未照射过的原液作为对照。
(4) 化学试剂影响
向竹叶粗提物分别加入Triton X-100、EDTA、Tween 80、Tween 20和NaCl，使各物质的终质量浓度达到1 mg/mL，30 ℃温浴2 h，检测样品的化学稳定性。
1.3 数据分析
试验数据均为3个重复的平均值，采用Excel 2007处理数据、绘图并进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 竹叶提取物的抑菌作用
由图1可知：竹叶提取物系统分离各部分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黄曲霉和酿酒酵母抑制作用各不相同。石油醚萃取物对大肠杆菌的抑制效果最好，对黄曲霉没有抑菌作用；氯仿萃取物对黄曲霉的抑制效果最好；乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑制作用最好，但对金黄色葡萄球菌和黄曲霉没有抑制作用；正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的抑制作用最好，对黄曲霉没有抑菌作用；萃余水相物对大肠杆菌和酿酒酵母有较好的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌和黄曲霉没有抑制作用。由上可知：5个部分对大肠杆菌都有抑菌作用，但只有氯仿萃取物对黄曲霉有抑菌作用。
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图 1 竹叶提取物的抑菌作用Figure 1. Bacteriostasis of extracts from bamboo leaves注/Note: Pee. petroleum ether extract; Che. chloroform extract; Eae. ethyl acetate extract; Nbe. N-butanol extract; Aqe. aqueous extract.2.2 竹叶提取物各部分的最小抑菌质量浓度
由表1可知：石油醚萃取物对大肠杆菌的抑菌活性最好，最小抑菌质量浓度为1.38×10−3 mg/mL，而乙酸乙酯萃取物和萃余水相物对金黄色葡萄球菌则无抑菌效果。乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌和酿酒酵母的抑菌活性最好。氯仿萃取物对黄曲霉的最小抑菌质量浓度是5.38×10−1 mg/mL，其余部分对黄曲霉则没有抑菌作用。
表 1 竹叶系统分离提取物的最小抑菌质量浓度Table 1. Minimum inhibitory mass concentration of extracts isolated from bamboo leaves system系统相
system phase大肠杆菌
E. coli金黄色葡萄球菌
S. aureus酿酒酵母
S. cerevisiae黄曲霉
A. flavus石油醚萃取物Pee 1.38×10−3 1.38×10−2 1.38×10−1 — 氯仿萃取物Che 1.53 1.53×10−1 1.53×10−2 5.38×10−1 乙酸乙酯萃取物Eae 5.38×10−5 — 5.38×10−5 — 正丁醇萃取物NBe 1.67 1.67×10−1 1.67×10−2 — 萃余水相物Aqe 3.17×10−3 — 3.17×10−2 — 注/Note: Pee. petroleum ether extract; Che. chloroform extract; Eae. ethyl acetate extract; Nbe. N-butanol extract; Aqe. aqueous extract. 2.3 外界条件对粉单竹叶提取物稳定性的影响
由图2可知：温度、pH、紫外照射时间变化对竹叶提取物抑菌活性没有太大影响，酿酒酵母和大肠杆菌的抑菌效果虽有一定波动，但总体变化不大。
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图 2 温度、pH和紫外线对粉单竹叶提取物稳定性的影响Figure 2. The effect of temperature, pH and UV irradiation on the stability of the extract of bamboo leaf由图3可知：粉单竹竹叶提取物抑菌物质经EDTA、Triton X-100和NaCl处理后未受明显影响，抑菌活性仍然保持稳定。而加入吐温后，特别是Tween 20抑菌活性明显的增加。
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图 3 化学试剂对粉单竹叶提取物稳定性的影响Figure 3. Effects of chemical reagents on stability of leaves of bamboo leaves3. 讨论
随着人们生活水平的提高，安全健康消费意识不断增强，对食品安全问题日益关注，寻找一种新的安全高效食品防腐添加剂显得尤为迫切。竹叶提取物作为天然食品防腐剂具有安全无毒高效的特点[11-13]，其开发研究蕴藏着良好的市场前景。
近年来已有不少竹叶提取物的抗菌研究。赵艳芹等[14]制备的淡竹叶抗菌再生纤维素纤维对金黄色葡萄球菌的抑菌率达94.8%；王媛媛[15]发现竹叶精油及其复配物有较好的抑菌活性，并基于竹叶精油组分构成及其抑菌稳定性，从细胞层面研究了其抑菌作用机制；操海群等[16]对毛竹抑菌有效成分进行了初步分离，表明毛竹粗提物经萃取分离得到组分中乙酸乙酯组分具有较强的抑菌作用，其抑菌有效成分为苯酚类化合物；江惠等[17]从毛竹竹叶中分离纯化出一种新的抗菌肽，此竹叶多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌表现出良好的抑菌活性；姚志蕊[18]研究了毛竹叶提取物的抑菌活性，结果显示毛竹叶提取物中乙酸乙酯相抑菌活性最强，其主要活性成分为黄酮类化合物。
虽然有较多竹叶抗菌活性的研究报道，但竹叶抗菌活性的对象多是以细菌为主，真菌较少，对于食品中危害极大的黄曲霉的抑菌活性则未见报道。本试验针对竹叶各系统分离提取成分的抗菌活性进行了研究，发现竹叶提取物系统分离各部分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酿酒酵母和黄曲霉4种菌均有不同的抑制作用，其中，乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和酿酒酵母有很高的抗菌活性，这一结果与部分文献[16,18]相似。各系统分离成分中氯仿萃取物对黄曲霉有较好抑菌作用，这一点未见报道。黄曲霉是食品加工贮存中常见的污染菌，其产生的黄曲霉毒素有极强毒性，粉单竹竹叶提取物作为食品防腐添加剂在这方面有很好的应用价值。本研究进一步考察了环境条件对竹叶提取物抑菌活性的影响，发现其在多种条件下稳定性较高，说明粉单竹叶提取物具备开发为抑菌防腐剂的良好条件。另外，课题组还将进行后续研究，包括竹叶抗菌成分的分析鉴定、不同时间采摘对竹叶的成分及抗菌活性的影响及抗菌复合作用等，其结果将进一步揭示竹叶提取物的抗菌活性。
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图 1 铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠体质量变化的影响
注：CK. 正常组；CIM. CIM模型组；L. 铁皮石斛粗多糖低剂量组；M. 铁皮石斛粗多糖中剂量组；H. 铁皮石斛粗多糖高剂量组；“*”、“**”和“***”分别表示在0.05、0.01和0.001水平上差异显著；下同。
Figure 1. Effect of D. officinale polysaccharide on the body weight variation of mice with chemotherapy-induced intestinal mucositis
Note: CK. normal group; CIM. CIM model group; L. D. officinale polysaccharide lowdose group; M. D. officinale polysaccharide medium dose group; H. D. candidum polysaccharide highdose group; “*”, “**” and “***” mean significant difference at 0.05, 0.01 and 0.001 level, respectively; the same as below.
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图 2 各组小鼠小肠组织切片(HE染色，×100)
Figure 2. Histopathological features of small intestine tissues in mice (HE staining, ×100)
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图 3 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠黏膜形态学参数的影响
Figure 3. Effects of D. officinale polysaccharides on the morphological parameters of small intestinal mucosa in mice
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图 4 各组小鼠小肠免疫组化组织切片(PCNA染色，×200)
Figure 4. Immunohistochemical tissue sections of mice small intestine in each group (PCNA staining, ×200)
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图 5 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠PCNA表达量的影响
Figure 5. Effect of D. officinale polysaccharide on PCNA expression in small intestine of mice
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图 6 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠肠道屏障mRNA表达量的影响
Figure 6. Effect of D. officinale polysaccharides on the expression of intestinal barrier mRNA in mice
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图 7 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠炎症因子mRNA表达量的影响
Figure 7. Effect of D. officinale polysaccharides on the expression of inflammatory factors mRNA in small intestine of mice
表 1 RT-PCR扩增条件
Table 1 RT-PCR amplification conditions
反应步骤
reaction steps反应环节
reaction lin循环数
number of cycles反应温度/℃
reaction temperature反应时间/s
reaction time升降温率/(℃·s−1)
temperature rise and fall speed1步 stage 1 预变性 pre-denaturation 1 95 30 4.40 2步 stage 2 PCR 40 95 5 4.40 60 30 2.20 3步 stage 3 溶解曲线 dissolution curve 1 95 5 4.40 65 60 2.20 95 0.11 4步 stage 4 降温 cooling 1 50 30 2.20 
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表 2 RT-PCR引物序列
Table 2 RT-PCR primer sequence
基因 gene 上游引物(5′→3′) upstream primer 下游引物(5′→3′) downstream primers ZO-1 TTTTTGACAGGGGGAGTGG TGCTGCAGAGGTCAAAGTTCAAG Occludin ATGTCCGGCCGATGCTCTC TTTGGCTGCTCTTGGGTCTGTAT IL-1β TCCATGAGCTTTGTACAAGGA AGCCCATACTTTAGGAAGACA TNF-α AGACCCTCACACTCAGATCA TCTTTGAGATCCATGCCGTTG β-actin GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC GACTCATCGTACTCCTGCTTG C
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