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苜蓿、小冠花和百脉根花粉管引导和胚珠败育研究

王晓娟, 黄利春, 张树振

王晓娟, 黄利春, 张树振. 苜蓿、小冠花和百脉根花粉管引导和胚珠败育研究[J]. 云南农业大学学报（自然科学）, 2021, 36(1): 114-123. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202008060
引用本文: 王晓娟, 黄利春, 张树振. 苜蓿、小冠花和百脉根花粉管引导和胚珠败育研究[J]. 云南农业大学学报（自然科学）, 2021, 36(1): 114-123. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202008060
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Xiaojuan WANG, Lichun HUANG, Shuzhen ZHANG. Study on the Pollen Tube Introduction and Ovule Abortion after Cross-pollination in Medicago sativa, Coronilla varia and Lotus cornioulatous[J]. JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY（Natural Science）, 2021, 36(1): 114-123. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202008060
Citation: Xiaojuan WANG, Lichun HUANG, Shuzhen ZHANG. Study on the Pollen Tube Introduction and Ovule Abortion after Cross-pollination in Medicago sativa, Coronilla varia and Lotus cornioulatous[J]. JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY（Natural Science）, 2021, 36(1): 114-123. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202008060
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苜蓿、小冠花和百脉根花粉管引导和胚珠败育研究

  • 1.

    上海科技馆，上海自然博物馆自然史研究中心，上海 200127

  • 2.

    科尔沁右翼前旗农业技术推广中心，内蒙古 科尔沁右翼前旗 137713

  • 3.

    新疆农业大学 草业与环境科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052

基金项目: 上海市自然科学基金（18ZR1425400）
详细信息
    作者简介:

    王晓娟(1972—)，女，甘肃静宁人，博士，教授，主要从事植物生态学和传粉生物学研究。E-mail：wangxj@sstm.org.cn

摘要:
目的豆科牧草苜蓿、小冠花和百脉根异花授粉，胚珠败育现象显著，种子实际产量远低于理论产量，但有关其授粉后的花粉管引导和受精后胚胎发育的基础数据缺乏。
方法采用人工授粉方法，对3种豆科牧草花粉管引导和胚胎发育进行荧光显微观察，并结合田间数据进行胚珠败育统计分析。
结果3种牧草柱头授粉最佳时期为花药开裂阶段，柱头角质层是其花粉管穿入花柱的机械屏障；苜蓿授粉2 h后花粉萌发，8 h后花粉管生长并到达胚珠，24 h后75%的胚珠处有花粉管到达；小冠花和百脉根花粉管萌发生长到达胚珠的时间比苜蓿快，授粉4 h后即观察到花粉管生长到达胚珠，8 h后2种牧草96%和100%的胚珠处均有花粉管分布。进一步的荚果结实观察发现：苜蓿、小冠花和百脉根授粉后胚珠败育严重，平均败育率分别为87.67%、78.00%和81.33%，荚果内败育胚珠的位置具有随机性。以上结果表明：授粉后不同牧草花粉萌发和花粉管生长速率明显不同，尽管小冠花和百脉根的花柱比苜蓿长，其花粉管生长引导速度比苜蓿快；从到达胚珠的花粉管数量来看，3种牧草花粉数量均可满足其胚珠受精需要。
结论3种豆科牧草胚珠败育并非由于受精前的花粉萌发和花粉管引导限制，而是和受精后的胚胎发育受阻有关。

 

Study on the Pollen Tube Introduction and Ovule Abortion after Cross-pollination in Medicago sativa, Coronilla varia and Lotus cornioulatous

  • 1.

    Shanghai Science & Technology Museum, Natural History Research Center for Shanghai Natural History Museum, Shanghai 200127, China

  • 2.

    Agricultural Technology Extension and Service Center, Ke'erqinYouyiQianqi 137713, China

  • 3.

    College of Grassland and Environment Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China

Abstract:
PurposeLeguminous forages Medicago sativa, Coronilla varia and Lotus cornioulatous are typical allogamy. Ovule abortion reduced the seeds numbers per pod, and actual seed production is much lower than their potential seed production. But fundamental data related to pollen tube introduction and embryo development after pollination are still lack.
MethodUsing controlled pollination method, pollen tube introduction and embryo development were observed in M. sativa, C. varia and L. cornioulatous using fluorescence microscope. And random abortive position of seed in one pod was also collected and analyzed in field trial.
ResultThe stigmas of these three leguminous forages were receptive at the stage of dehiscence, and cuticles of stigma were mechanical barrier as pollen tubes penetrating the style. In M. sativa, pollen grains germinated 2 h after pollination and pollen tube reached the ovary after 8 h. The potential rate of ovule fertilization was up to 75% and remained unchanged 24 h after pollination. In C. varia and L. cornioulatous, pollen tubes reached the ovule 4 h after pollination, and the potential rate of ovule fertilization reached 96% and 100% 8 h after pollination, respectively. Even then, the percentage of seed abortion in M. sativa, C. varia and L. cornioulatous were still higher as 87.67%, 78.00% and 81.33%, respectively. Pollen tube growth and introduction were different in three leguminous forages. Although style lengths of C. varia and L. cornioulatous were longer than that of M. sativa, pollen tubes grew quicker in these two legumes. In M. sativa, C. varia and L. cornioulatous respectively, and random abortive position of seed in one pod was also observed. These results indicated that number of pollen tubes arrived in embryo sac in M. sativa, C. varia and L. cornioulatous could meet the demand of double fertilization.
ConclusionThe numbers of pollen grains loaded on the stigma as well as pollen tube introduction were not the limited factors for seed set, and ovule abortion could be due to embryo development restriction after fertilization in these leguminous forages.

 

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  • 朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)是泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒，2013年在中国云南被首次发现并报道[1]，本课题组首次报道了朱顶红褪绿环斑病毒的全基因组序列[2-3]。朱顶红褪绿环斑病毒能系统侵染一点红、番茄、莴苣、旱金莲和豇豆等经济作物，主要症状为同心环纹、叶片畸形、局部褪绿和坏死[4]，对农业生产造成了严重的威胁。HCRV为三分子基因组，分别是L RNA、M RNA和S RNA。L RNA仅有1个开放阅读框，正向编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；M RNA正向编码非结构蛋白(non-structural protein of M RNA，NSm)，互补链编码糖蛋白前体(glycoproteins，Gn/Gc)；S RNA正向编码非结构蛋白NSs (non-structural protein of S RNA，NSs)，互补链编码核壳体蛋白 (nucleocapsid protein，N)[5]，N蛋白序列保守程度较高[6]，因此通常被用于进行Tospovirus属病毒的分类检测和鉴定[7]，N蛋白也可能与病毒粒子装配有关[8]。本研究通过RT-PCR鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草感染HCRV的4份样品。为研究核壳体蛋白序列特征，通过RT-PCR、克隆和测序得到样品完整的HCRV S RNA序列，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得其N蛋白序列并进行分析，为HCRV的后续研究提供基础。

    1.   材料与方法

    1.1   材料采集

    2016年在云南省昆明市主要园林景区进行了调查，采集到八角金盘(Fatsia japonica)、葱莲(Zephyranthes candida)、酢浆草(Oxalis corniculata)、旱金莲(Tropaeolum majus)、蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和鸢尾(Iris tectorum)等疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品(图1)，主要表现为褪绿、坏死斑和皱缩等症状，将采集回来的样品用RT-PCR进行鉴定。

    图  1  疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品
    注：a) 葱莲；b) 喜林芋；c) 酢浆草；d) 八角金盘。
    Figure  1.  Samples suspected infection with Tospovirus virus
    Note: a) Zephyranthes candida; b) Philodendron schott; c) Oxalis corniculata; d) Fatsia japonica.
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    1.2   总RNA提取

    采用去除多糖多酚的TransZol Plant (全式金生物技术有限公司，北京)试剂盒提取RNA，以RNA为模板，采用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (宝生物技术有限公司，大连)进行反转录合成cDNA。

    1.3   RT-PCR扩增、克隆及测序

    利用Primer Premier 6.0软件，以GenBank中公布的HCRV S RNA序列(序列号：JX833564.1)设计引物，S RNA扩增引物为：F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′。50 μL PCR反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，FastPfu 1 μL，Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，40个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反应产物用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的PCR产物进行纯化以及加A反应。将已纯化的PCR产物连接在pEASY-T1载体上，将连接产物导入T1感受态细胞中，经过菌液PCR鉴定出阳性重组子并送到公司进行测序。

    1.4   生物信息学分析

    通过ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得4个HCRV分离物的N蛋白序列，利用DNAMAN 8.0与分离自云南省蜘蛛兰上的HLS1-2 N蛋白(登录号：AFX74694)进行序列比对分析；利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的分离自云南、广东、广西和福建地区蜘蛛兰上的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白进行系统进化分析。

    2.   结果与分析

    2.1   RT-PCR结果

    通过RT-PCR技术鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4份感染HCRV的样品并扩增出HCRV S RNA序列，电泳检测条带大小约为2 700 bp (图2)。

    图  2  HCRV S RNA扩增结果
    注：M. Marker；1. 酢浆草；2. 葱莲；3. 文殊兰；4. 喜林芋。
    Figure  2.  Amplification of HCRV S RNA
    Note: M. Marker; 1. O. corniculata; 2. Z. candida; 3. C. asiaticum; 4. P. schott.
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    2.2   不同株系HCRV N蛋白序列比对分析

    本研究获得的葱莲YN-ZCH、文殊兰YN-CA、喜林芋YN-PS和酢浆草YN-OC的N蛋白，通过DNAMAN 8.0与首个公布的HLS1-2 N蛋白进行序列比对，一致性达到99.34%。YN-ZCH存在6个突变位点，YN-CA存在5个突变位点，YN-PS存在4个突变位点，YN-OC存在6个突变位点(表1)。

    表  1  氨基酸突变位点
    Table  1.  Amino acid mutation sites
    病毒株系 virus strains氨基酸位点 amino acid site
    2 9 50 82 113 118 178 241 249
    HCRV-HLS1-2 S A N A N Q I E V
    HCRV-YN-ZCH T V N V S Q V E A
    HCRV-YN-CA T V N V N Q V G V
    HCRV-YN-PS T V N V N Q V E V
    HCRV-YN-OC T V S V N R V E V
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    2.3   不同株系HCRV N蛋白系统进化分析

    利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白构建系统发育树，建树方法选择邻接法(neighbor-joining，NJ)。结果显示：本研究获得的4个HCRV分离物的N蛋白与分离自云南省的HCRV N蛋白聚为1支，来自广东、广西和福建地区的聚为1支(图3)。

    图  3  HCRV N蛋白氨基酸序列系统进化树
    Figure  3.  Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence
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    3.   讨论

    云南省丰富的植物资源和复杂的气候以及丰富的传播介体种类为Tospovirus病毒的发生和流行提供了条件，该属病毒在云南的发生呈逐年上升趋势[9]。自2013年首次在云南省发现HCRV至今，国内外对其研究较少，目前已知寄主包括蜘蛛兰、烟草、番茄、君子兰[10]和葱莲[11]等，仍有许多寄主尚未被发现。本研究鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4个感染HCRV样品，其中文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV寄主。研究结果表明：4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次公布的HLS1-2 N蛋白有较高的同源性，从系统发育分析可知不同株系的分离物聚类现象与寄主无明显关联，推测可能环境因子对病毒进化的影响强于寄主的影响。

    4.   结论

    本研究通过采集疑似感染番茄斑萎病毒属病毒的样本，应用症状学和分子生物学方法鉴定出了葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草 4 个感染 HCRV 样品，对 4个寄主植物 S RNA 序列中 N 蛋白进行序列比对和系统进化分析，结果表明 4 个HCRV 分离物 N 蛋白与 NCBI 公布的 HLS1-2 N 蛋白有较高的同源性，HCRV 病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。研究结果为 HCRV 的进化研究提供基础，也为进一步探究番茄斑萎病毒属病毒的扩散和进化策略提供参考。

  • 图  1   紫花苜蓿(a)、多变小冠花(b)和百脉根(c)的花

    Figure  1.   Florets of M. sativa (a), C. varia (b) and L. cornioulatous (c)

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    图  2   苜蓿异花授粉后2~48 h花粉管的生长和引导

    注：a)~b)授粉2 h，柱头上的花粉(a)和花柱基部(b)；c)~e)授粉4 h，花粉在柱头萌发(c)，少量花粉管进入花柱(d)，尚未到达胚珠(e)；f)~h)授粉8 h，大量花粉在柱头萌发(f)，穿过花柱的花粉管(g)和到达胚珠的花粉管(h)；i)授粉12 h，大量花粉管生长至胚珠位置；j)~k)授粉24 h，花粉管继续引导生长(j)直至珠孔位置(k)；l)授粉48 h，花粉管进入胚囊。

    Figure  2.   Growth and guidance of pollen tubes in M. sativa 2-48 h after cross pollination

    Note: a)-b) 2 h after pollination, pollens on the stigma (a) and style (b); c)-e) 4 h after pollination, few pollens germinated on the stigma (c), pollen tubes appeared in the style (d) but not at the ovule (e); f)-h) 8 h after pollination, lots of pollens germinated on the stigma (f), pollen tubes through style (g) arrived at the ovules (h); i) 12 h after pollination, more pollen tubes arrived at the ovules; j)-k) 24 h after pollination, pollen tube growth (j) and guidance to the micropyle (k); l) 48 h after pollination, pollen tube entered into the embryo sac.

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    图  3   小冠花异花授粉后2~48 h花粉管的生长和引导

    注：a)~b)授粉2 h，柱头上花粉尚未萌发(a)和花柱(b)；c)~d)授粉4 h，花柱基部少量花粉管(c)和到达胚珠的花粉管(d)；e)~g)授粉8 h，柱头上花粉萌发和花粉管生长(e)，穿过花柱基部到达胚珠的花粉管(f)，花粉管向胚珠珠孔端的生长和引导(g)；h)~i)授粉12和24 h的胚珠；j)~l)授粉48 h，花柱道(j)、胚珠附近(k)的花粉管和花粉管进入胚囊(l)。

    Figure  3.   Growth and guidance of pollen tubes in C. varia 2-48 h after cross pollination

    Note: a)-b) 2 h after pollination, pollens not yet germinated on the stigma (a) and the style (b); c)-d) 4 h after pollination, pollen tubes appeared in the style (c) and few arrived at the ovule (d); e)-g) 8 h after pollination, pollens germinated on the stigma (e), pollen tubes through the style, arrived at the ovules (f) and guidance to the micropyle (g); h)-i) the ovules pollinated after 12 and 24 h; j)-l) 48 h after pollination, pollen tubes in the style (j) , around the ovules (k) and entered into the embryo sac (l).

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    图  4   百脉根的异花授粉后2~48 h花粉管生长和引导

    注：a)~b)授粉2 h，柱头上尚未萌发的花粉(a)和胚珠(b)；c)~d)授粉4 h，柱头上萌发花粉(c)和少量花粉管向花柱道生长(d)；e)~f)授粉8 h，花粉管向花柱基部生长(e)和少量花粉管到达胚珠位置(f)；g)~h)授粉12 h，大量花粉管向胚珠方向生长(g)和花粉管向珠孔端的引导(h)；i)~k)授粉24 h，花粉管向胚珠珠孔处的引导生长；l)授粉48 h，花粉管进入胚囊。

    Figure  4.   Growth and guidance of pollen tubes in L. cornioulatous 2-48 h after cross pollination

    Note: a)-b) 2 h after pollination, pollens not yet germinated on the stigma (a) and the ovule (b); c)-d) 4 h after pollination, pollens germinated on the stigma (c) and few pollen tubes appeared in the style (d); e)-f) 8 h after pollination, pollen tubes went through the style (e) and few arrived at the ovule (f); g)-h) 12 h after pollination, lots of pollen tubes towards the ovule (g) and guided to the micropyles (h); i)-k) 24 h after pollination, guidance of pollen tube to ovules and then to the micropyles; l) 48 h after pollination, pollen tube entered into the embryo sac.

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    表  1   3种豆科牧草的柱头可授性比较

    Table  1   Comparisons of stigma receptivity in three leguminous forages

    豆科牧草
    leguminous forages    		柱头可授性 stigma receptivity柱头角质层
    cuticle of stigma
    阶段 1
    stage 1    		阶段 2
    stage 2    		阶段 3
    stage 3
    紫花苜蓿
    M. sativa    		 × √ √ √
    多变小冠花
    C. varia    		 × × √ √
    百脉根
    L. cornioulatous    		 × √ √ √
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    表  2   3种豆科牧草不同授粉时间胚珠受精率

    Table  2   Ovule fertilization rate after cross pollination in three leguminous forages %

    授粉时间/h
    time    		苜蓿
    M. sativa    		小冠花
    C. varia    		百脉根
    L. cornioulatous
    4 —88.97±8.41 a89.81±4.85 a
    817.42±6.86 a96.43±3.57 b95.38±1.56 b
    1240.28±8.33 b97.73±3.94 b99.39±1.22 c
    2464.24±11.47 bcd97.92±3.61 b99.09±1.82 c
    4870.69±7.82 cd100.00±0.00 b100.00±0.00 c
    9676.40±4.45 d100.00±0.00 b100.00±0.00 c
    注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
    Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05); the same as below.
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    表  3   3种豆科牧草胚珠败育位置及其败育率

    Table  3   Position of ovule abortion and ovule abortion rate in three leguminous forages %

    败育位置
    position of ovule abortion    		苜蓿
    M. sativa    		小冠花
    C. varia    		百脉根
    L. cornioulatous
    荚果上部 upper part of pod 94±2.58 a 82±3.65 a 76±9.09 a
    荚果中部 middle part of pod 88±5.16 a 74±4.76 a 86±5.03 a
    荚果下部 lower part of pod 81±8.22 a 78±7.39 a 82±7.02 a
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-25
  • 修回日期:  2020-10-06
  • 网络首发日期:  2021-01-29

目录

HTML全文

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   材料采集

  • 1.2   总RNA提取

  • 1.3   RT-PCR扩增、克隆及测序

  • 1.4   生物信息学分析

  • 2.   结果与分析

  • 2.1   RT-PCR结果

  • 2.2   不同株系HCRV N蛋白序列比对分析

  • 2.3   不同株系HCRV N蛋白系统进化分析

  • 3.   讨论

  • 4.   结论

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