鹌鹑MITF基因的克隆、表达及启动子甲基化研究
Study on the Cloning, Expression and Promoter Methylation of MITF Gene in Quail
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Keywords:
- quail /
- feather color /
- MITF gene /
- methylation /
- gene expression
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羽色是鹌鹑重要的品种特征之一，也是其重要的经济性状。利用羽色进行自别雌雄不仅简单易行，而且准确率高，在蛋用鹌鹑生产中得到广泛应用[1]。朝鲜鹌鹑是中国蛋用鹌鹑生产的主要品种，常见的羽色有栗羽(野生型)、黄羽、白羽和黑羽等，其中栗羽和白羽可以通过羽色自别雌雄[2]，在鹌鹑蛋生产中占有一定比重。
MITF (microphthalmia-associtated transcription factor)基因与动物毛色形成之间的关系最初发现于小鼠，该基因突变导致小鼠毛色变浅、虹膜色素退减、小眼畸形和耳聋[3]，故将其命名为小眼畸形相关转录因子。MITF蛋白由419个氨基酸残基组成，包含1个由90个氨基酸残基组成的基本—螺旋—环—螺旋—亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucine-zipper，bHLHLZip)结构[4]，是蛋白的转录激活功能域；在其N末端和C末端分别具有1个强转录激活结构功能区和1个富含丝氨酸的激活域[5]。
MITF基因在禽类羽色形成中同样发挥着重要作用，该基因突变或表达异常能导致羽色发生明显改变。在日本鹌鹑上，该基因第11外显子发生2 bp的缺失突变，导致编码蛋白的翻译提前终止，生成无生物活性的MITF蛋白，可能是导致日本鹌鹑白羽突变的原因，同时，该突变对日本白羽鹌鹑的生长发育和生产性能产生一定的影响[6]。此外，MITF基因突变与浙东白鹅[7]和北京鸭[8-9]等水禽的白羽性状有关。本研究以MITF为候选基因，分析该基因在朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑羽色形成过程中的表达变化，克隆该基因的启动子区域，检测不同羽色鹌鹑MITF基因启动子的甲基化状态，从分子水平上研究MITF基因与鹌鹑羽色形成之间的关系。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
试验用朝鲜鹌鹑(野生型)和北京白羽鹌鹑种蛋各60枚，购于河南科技大学鹌鹑种业有限公司。
1.1.2 主要试剂
总RNA提取试剂盒、PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit、SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒、LA Taq® with GC Buffer、DNA Ligation Kit、pMD-19T载体和DH5α大肠杆菌感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司；EpiTect Bisulfite Kit购自Qiagen公司；动物组织基因组DNA提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒购自TIANGEN公司；琼脂糖、50×TAE、GoldView、DNA Marker和2×RNA Loading Buffer均购自北京Solarbio科技有限公司。
1.1.3 主要仪器
实时荧光定量PCR 仪、梯度PCR仪和凝胶成像系统购自Bio-Rad 公司；超微量核酸浓度测定仪购自Thermo 公司；低温高速离心机购自湖南湘仪仪器开发有限公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 种蛋孵化和组织样品采集
种蛋在恒温恒湿孵化器中孵化，孵化温度在第1~6 天为38 ℃，第7~14 天为37.8 ℃；孵化湿度为55%~65%。分别在孵化第6、8、10、12和14 天各取出10枚种蛋，采集胚胎翅组织于液氮中保存，用于检测MITF基因mRNA表达水平；在孵化第12 天另取出10枚种蛋，采集翅组织用于MITF基因启动子区域克隆及甲基化分析。
1.2.2 总RNA的提取及反转录
取适量鹌鹑翅组织于加入液氮的研钵中研成粉末状，用总RNA提取试剂盒提取各组织样品的总RNA；将其溶解于DEPC处理的双蒸水中，利用NanoDrop 2000测定总RNA 的纯度和质量浓度；用DEPC 处理的双蒸水稀释至1 μg/μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；选择高质量的RNA用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第1链。所有操作均参照试剂盒说明进行。
1.2.3 鹌鹑MITF基因CDS区的克隆及生物信息学分析
参考日本鹌鹑MITF基因mRNA序列(XM_015875345.2)设计引物M1 (表1)，以合成的cDNA第1链为模板进行RT-PCR扩增，总反应体系为20 μL，包括5 U/μL LA Taq 0.2 μL、2×GC Buffer I 10 μL、dNTP Mixture 3 μL、上下游引物各0.7 μL和cDNA第1链 1 μL，加水补至20 μL。PCR扩增在C1000梯度PCR仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后送北京擎科新业有限公司测序。测序结果与GenBank数据库进行BLAST比对，用ORF Finder分析潜在的开放阅读框，利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白的分子量和等电点，利用在线软件SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析编码蛋白的信号肽，利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白的跨膜区信息，利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)预测蛋白的亚细胞定位。
表 1 引物信息表Table 1. The information of primers引物名称
primer name引物序列(5′→ 3′)
primer sequence退火温度/℃
anneal temperature产物长度/bp
product length引物用途
purposeM1 ACGATGCAGGCGGAGTC 57 1581 CDS区克隆
CDS cloningAGCAGTTTATGAAAGGCGTG M2 TTGGACGGTAATAATGGATAGG 57 247 RT-qPCR CAAGTGTTTACAAAGAACGCAG M3 GCCCTATCCAAGTTGTTGCC 60 1267 启动子克隆
promoter cloningGCACCCAAAACGCAAAGC M4 TTTGTTTAGTAAAGGGGTGG 53 165 BSP分析
BSP analysisACACTACAACTAAAACCCCAC GAPDH TGCCGTCTGGAGAAACC 55 160 RT-qPCR内参
RT-qPCR internal referenceCAGCACCCGCATCAAAG 1.2.4 鹌鹑MITF基因的RT-qPCR分析
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1.2.5 鹌鹑MITF基因启动子区域的克隆及序列分析
用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取各样品的基因组DNA，用NanoDrop 2000测定其质量浓度和纯度，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，高质量的基因组DNA保存于−80 ℃冰箱备用。下载日本鹌鹑MITF基因第1外显子及其之前的2000 bp基因组(NC_029527.1)序列，用Primer Premier 5.0软件设计1对克隆MITF基因启动子区域的引物M3 (表1)。以提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增鹌鹑MITF基因的启动子区域，总反应体系为20 μL，包括5 U/μL LA Taq 0.2 μL、2×GC Buffer I 10 μL、dNTP Mixture 3 μL、上下游引物各1 μL和基因组DNA 1 μL，加水补至20 μL。PCR扩增在C1000梯度PCR仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后送北京擎科新业有限公司测序。利用NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测核心启动子元件，利用PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)预测转录因子结合位点，利用CpGplot (https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)分析潜在的CpG岛位置。
1.2.6 利用BS-PCR技术检测MITF基因启动子区域的甲基化水平
取20 μL基因组DNA溶液于0.2 mL的EP管中，参照EpiTect Bisulfite Kit说明书进行重亚硫酸盐处理和回收。利用MethPrimer在线软件针对预测的CpG岛设计1对特异性引物M4 (表1)。PCR的反应体系为25 μL，包括Premix TaqTM 12.5 μL、上下游引物各1 μL和重亚硫酸盐处理后的基因组DNA 2 μL，加水补至25 μL。PCR扩增在C1000梯度PCR仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后与pMD-19T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含AMP的固体LB培养基上培养，随机挑选阳性克隆送北京擎科新业有限公司测序。
1.2.7 数据统计与分析
利用SPSS 18.0软件进行统计学分析，用2个样本t检验分析MITF基因在不同羽色鹌鹑组织间的表达差异；BS-PCR测序结果用BiQ-Analyzer 软件分析CpG位点的甲基化状态，然后用在线软件MSR calculate (www.msrcall.com/MSRcalcalate.aspx)绘制甲基化位点棒棒糖模型，计算每个样品甲基化百分比，用配对样本ｔ检验法比较不同鹌鹑品种间MITF基因启动子区域的甲基化水平差异。
2. 结果与分析
2.1 鹌鹑MITF基因克隆及生物信息学分析
利用引物M1克隆鹌鹑MITF基因的CDS区，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测出现单一目标条带(图1)。产物经纯化回收后进行DNA测序，经BLAST比对分析后发现该序列与日本鹌鹑同源基因相似度达99%，与原鸡的相似度也达98%。开放阅读框分析表明：该序列包含1个1476 bp的完整开放阅读框，编码492个氨基酸残基。鹌鹑MITF蛋白分子量54.8 ku，等电点6.07，该蛋白没有信号肽和明显的跨膜区，亚细胞定位发现成熟蛋白位于细胞核中。
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图 1 朝鲜鹌鹑MITF基因CDS区PCR产物的电泳检测注：1和2是PCR扩增产物；M. DL2000 DNA Marker。Figure 1. Electrophorogram of PCR product of MITF CDS in Korean quailNote:1 and 2 are PCR products; M. DL2000 DNA Marker.2.2 MITF基因mRNA在鹌鹑胚胎中的表达
由图2可知：MITF基因的表达水平在鹌鹑胚胎发育的第6~10 天处于上升阶段，之后表达水平下降。鹌鹑胚胎发育的第6~12天，MITF基因在朝鲜鹌鹑中的表达水平显著或极显著高于在北京白羽鹌鹑中的表达水平(P<0.05或P<0.01)。
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图 2 MITF基因mRNA在鹌鹑胚胎发育不同阶段的相对表达水平注：“*” 表示在0.05水平上差异显著(P<0.05)；“**” 表示在0.01水平上差异极显著(P<0.01)。Figure 2. Relative expression of MITF gene in different developmental stages of quail embryosNote: “*” indicates significant difference at 0.05 level (P<0.05); “**” indicates extremely significant difference at 0.01 level (P<0.01).2.3 鹌鹑MITF基因启动子区域的克隆及生物信息学分析
引物M3的PCR产物经纯化回收后进行DNA测序，得到1267 bp的启动子序列，该序列与日本鹌鹑基因组(NC_029527.1)上MITF基因启动子区域的同源性达99%。用NNPP软件预测到该段序列包含1个核心启动子元件。用PROMO软件发现该段序列含有丰富的转录因子结合位点，其中包括1个RNA聚合酶结合位点 TATA-box (图3)。该段序列的平均GC含量为65%，用MethPrimer软件预测到该段序列包含1个346 bp的CpG岛，预测到的核心启动子元件和TATA-box均位于该CpG岛上，因此，该CpG岛可用于甲基化分析。
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图 3 MITF基因启动子区域的顺式作用元件分析注：方框表示转录因子结合位点；下划线表示核心启动子序列。Figure 3. Cis-elements prediction of the MITF promoter sequenceNote: The box represents the transcription factor binding site; the underline indicates the core promoter sequence.2.4 鹌鹑MITF基因启动子的甲基化分析
BS-PCR产物测序后经BiQ-Analyzer 软件分析发现：在该CpG岛上有9个CpG位点(图4)，其中朝鲜鹌鹑的甲基化水平为18.52%，北京白羽鹌鹑的甲基化水平为29.63%，统计学分析表明两者甲基化水平差异显著(t=2.82，P=0.022<0.05)。
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图 4 MITF基因启动子甲基化结果注：黑圈代表甲基化位点，白圈代表未甲基化位点。Figure 4. Methylation results of MITF promoterNote: A black circle represents a methylation site, and a white circle represents an unmethylated site.3. 讨论
3.1 MITF基因表达与禽类羽色形成的关系
MITF基因的表达能够促进黑素母细胞增殖分化，促进黑色素合成[10]，该基因突变导致动物皮肤和毛发色素沉积减少，故MITF基因被认定为影响动物毛色和羽色的关键候选基因[11]。LI等[8]利用RNA-Seq技术分析不同羽色鸭子毛囊组织的差异表达基因，发现MITF基因在黑羽毛囊组织中的表达水平极显著高于在白羽毛囊组织的表达水平。本研究中，朝鲜鹌鹑MITF基因的表达水平显著或极显著高于北京白羽鹌鹑，这与前人研究结果一致。MITF基因在黑色素细胞中特异性表达[12]，MITF蛋白能够识别并结合TYR基因家族启动子区域的E-box，激活该基因家族中TYR和DCT等基因表达，从而合成黑色素[13]，故推测朝鲜鹌鹑较深的羽色与其MITF基因高表达有一定关系。鹌鹑胚胎发育的6~8 d是绒毛大量形成的时期，也是黑色素沉积旺盛的时期[14]，本研究发现MITF基因在胚胎发育的6~10 d处于上升阶段，可能与该时期黑色素大量合成有关。成熟的miRNA能够与靶基因mRNA通过碱基互补配对的方式结合，降低靶基因的表达水平。目前已鉴定出多个靶向MITF基因的miRNA[15]，其中miR-101a-3p和miR-144a-3p能够与羊驼MITF基因的3′ UTR 结合，抑制MITF基因表达，减少黑色素形成[16]；miR-186-5p也能在绵羊黑色素细胞中达到同样效果[17]。miR-137的靶基因也是MITF，将miR-137注射到黑皮肤小鼠胚胎中，出生后的小鼠肤色变浅，其皮肤组织中MITF基因mRNA的表达水平显著低于正常小鼠[18]。这些研究表明：下调MITF基因的表达水平导致黑色素合成减少，这与本研究中北京白羽鹌鹑MITF基因的表达水平极显著或显著低于朝鲜鹌鹑的结果一致，说明MITF基因对动物皮肤和毛发中色素沉积起重要的调控作用。
3.2 启动子甲基化与基因表达的关系
基因启动子区CpG岛的甲基化和去甲基化是基因表达调控的重要方式。通常情况下，启动子区域CG碱基甲基化水平升高可抑制基因表达，而甲基化水平降低能够激活基因表达[19]。白羽莆田鸭皮肤毛囊组织中MITF基因启动子区域的甲基化水平显著高于黑羽莆田鸭，且启动子CpG岛的甲基化水平越高，MITF基因的表达水平越低，两者呈显著负相关[20]。类似现象在獭兔[21]、斑点狗[22]和鲫鱼[23]都有发现。本研究中，朝鲜鹌鹑MITF基因的表达水平显著高于北京白羽鹌鹑，可能与朝鲜鹌鹑MITF基因启动子区域低甲基化有关。MITF基因启动子甲基化状态与表达水平间的关系在人类黑色素瘤细胞系中得到了深入研究[24-25]。黑素细胞癌变后MITF基因表达水平下降，其启动子区域的甲基化水平升高[26]，特别是TSS (transcription start site) 附近的CG碱基甲基化对基因的表达水平有显著影响[27]。北极狐MITF基因启动子区存在1个524 bp的高活性区(−510 bp/+13 bp)，该区域的突变对MITF基因表达有显著影响[28]。本研究在朝鲜鹌鹑MITF基因启动子区域发现1个346 bp的CpG岛和多个核心启动子元件，位置与北极狐MITF基因启动子的高活性区域重合，都紧邻TSS上游，说明该CpG岛上CG碱基的甲基化和去甲基化对MITF基因的表达水平影响较大。
4. 结论
北京白羽鹌鹑MITF基因表达水平显著低于朝鲜鹌鹑，这是导致羽色白化的原因之一。鹌鹑MITF基因启动子区存在1个CpG岛和多个核心启动子元件，该基因的表达受CpG岛甲基化调控，高甲基化抑制MITF基因表达。
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图 1 朝鲜鹌鹑MITF基因CDS区PCR产物的电泳检测
注：1和2是PCR扩增产物；M. DL2000 DNA Marker。
Figure 1. Electrophorogram of PCR product of MITF CDS in Korean quail
Note:1 and 2 are PCR products; M. DL2000 DNA Marker.
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图 2 MITF基因mRNA在鹌鹑胚胎发育不同阶段的相对表达水平
注：“*” 表示在0.05水平上差异显著(P<0.05)；“**” 表示在0.01水平上差异极显著(P<0.01)。
Figure 2. Relative expression of MITF gene in different developmental stages of quail embryos
Note: “*” indicates significant difference at 0.05 level (P<0.05); “**” indicates extremely significant difference at 0.01 level (P<0.01).
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图 3 MITF基因启动子区域的顺式作用元件分析
注：方框表示转录因子结合位点；下划线表示核心启动子序列。
Figure 3. Cis-elements prediction of the MITF promoter sequence
Note: The box represents the transcription factor binding site; the underline indicates the core promoter sequence.
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图 4 MITF基因启动子甲基化结果
注：黑圈代表甲基化位点，白圈代表未甲基化位点。
Figure 4. Methylation results of MITF promoter
Note: A black circle represents a methylation site, and a white circle represents an unmethylated site.
表 1 引物信息表
Table 1 The information of primers
引物名称
primer name引物序列(5′→ 3′)
primer sequence退火温度/℃
anneal temperature产物长度/bp
product length引物用途
purposeM1 ACGATGCAGGCGGAGTC 57 1581 CDS区克隆
CDS cloningAGCAGTTTATGAAAGGCGTG M2 TTGGACGGTAATAATGGATAGG 57 247 RT-qPCR CAAGTGTTTACAAAGAACGCAG M3 GCCCTATCCAAGTTGTTGCC 60 1267 启动子克隆
promoter cloningGCACCCAAAACGCAAAGC M4 TTTGTTTAGTAAAGGGGTGG 53 165 BSP分析
BSP analysisACACTACAACTAAAACCCCAC GAPDH TGCCGTCTGGAGAAACC 55 160 RT-qPCR内参
RT-qPCR internal referenceCAGCACCCGCATCAAAG 
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