樟叶越桔幼茎愈伤组织诱导和不定根的再生
Callus Induction and Adventitious Root Regeneration in Young Stem of Vaccinium dunalianum Wight
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Keywords:
- Vaccinium dunalianum Wight /
- callus /
- adventitious roots /
- induction
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5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)作为叶绿素生物合成的关键前体，在植物生长发育过程中具有重要的调控作用[1-2]。因其为天然氨基酸，且具有用量低、易降解和无残留等特性，被认为是一种新型环境友好型的植物生长调节剂，在农业生产中具有巨大的应用潜力[2]。适宜质量浓度的外源ALA能够调节植物的生长发育，尤其在促进植株叶绿素合成和光合作用、提高农产品质量和植株抗逆性等方面效果显著[3]。孙萍等[4]指出：外源 ALA可以提高草莓的株高、茎粗、叶片和花径粗；赵宝龙等[5]研究表明：叶面喷施ALA可以提高葡萄的株高和茎粗；何娟等[6]研究表明：外源ALA能显著提高香蕉叶面积、地上部鲜质量、地下部鲜质量及根冠比。此外，外源ALA可显著促进小白菜[7]、甜瓜[8]、草莓[9]和梨[10]等作物叶片的净光合速率；促进玉米[11]、番茄[12]、月季[13]和蓝莓[14]等作物的产量并改善产品品质；提高葡萄果皮的花青素、叶绿素、类胡萝卜素和可溶性糖含量以及固酸比等[15]；提高苹果果实的可溶性糖、可溶性蛋白和维生素C含量[16]；提高桃的单果质量、纵径、横径和侧径[17]；增强植株对低温弱光[18]、高温强光[19]、盐渍[5]和干旱[20]等环境胁迫的抵抗能力。目前关于ALA 促进作物生长的作用机理尚未明确，推测可能是由于促进光合作用后使作物的同化产物增多，而使作物在黑暗条件下呼吸量下降，抑制同化产物的消耗[21]；ALA能够提高果实品质可能是由于ALA具有疏花疏果的作用[22-23]。
猕猴桃是猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本水果[24]，不但含有丰富的氨基酸、矿物质、多糖和维生素C等营养成份，具有“维生素C之王”的美誉，而且肉质柔嫩，味道鲜美，深受广大消费者的喜爱[25]。目前，关于ALA对水果光合及品质的作用研究主要集中在苹果[16]、桃[17]和葡萄[15]等果树上，在猕猴桃上的应用还未见报道。因此，本研究拟从猕猴桃开花前期至膨果期(开花前期、盛花期和膨果期)对其叶面喷施不同质量浓度的ALA水溶液，探讨ALA对猕猴桃品质的影响，以期为利用ALA促进猕猴桃的生产提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2019年4月2日—9月15日在云南省昆明市寻甸县杨家湾镇昆明晟瑞果蔬有限公司进行(N25°43′，E102°56′)，平均海拔2 070 m，年平均气温14.5 ℃，年降雨量1 132 mm。选择地形一致的猕猴桃种植地块，面积约0.67 hm2，品种为翠玉，树龄3年生，株行距2.5 m×4.0 m，常规管理(架形采用棚架，树形采用1干2蔓24侧蔓，土壤为红壤土)。ALA试剂(含量10%)由中国农业科学院蔬菜花卉研究所穆鼎提供。
1.2 试验设计
采用单因子完全随机区组设计，ALA质量浓度分别为10、20、30、40和50 mg/L，以清水为对照，每处理重复3次，每重复选择5株猕猴桃，共计90株，每处理间隔1行作为保护区，每个重复四周间隔至少3株不处理的植株。分别于开花前期(4月2日)、盛花期(4月22日)和膨果期(5月12日)进行叶面喷施，每株重复喷施3次，共喷施ALA溶液约1 300 mL。
1.3 指标测定
1.3.1 叶绿素含量及光合速率的测定
(1) 叶绿素含量的测定
分别于盛花期和膨果期对猕猴桃植株叶面喷施ALA 30 d 后测定植株叶片的叶绿素含量。每株从第8~10片叶中选取6片叶，每片叶靠近主脉的1/3处为夹取部位，利用SPAD-502Plus叶绿素仪测定其叶绿素含量。每个重复选5株，每片叶重复测6次。
(2) 净光合速率的测定
膨果期喷施ALA 30 d后，于上午8： 30—11： 00使用Yaxin-1101光合仪测定叶片的净光合速率，环境温度为15~17 ℃，胞间CO2浓度为200~370 μmol/mol。
1.3.2 植株营养生长相关指标的测定
(1) 叶长、叶宽及叶片厚度的测定
膨果期喷施ALA 30 d后，每株从第8~10片叶中选取6片叶，每个重复选取5株，用游标卡尺测定其叶长和叶宽，用千分尺测量叶片厚度。
(2) 茎粗的测定
盛花期叶面喷施ALA 30 d后，每个重复选5株，每株选6个新生枝条，用游标卡尺测量枝条基部的1/3处为其茎粗。
1.3.3 果实品质的测定
果实于9月14日采收，每个处理在树堂内部采摘40个果实，当日运回实验室，待果实后熟软化后，随机抽取20个果实进行果实品质的测定。其中，用电子天平测定单果质量，用游标卡尺测量果实纵径及横径，用果实纵径与横径的比值计算其果形指数，用PAL-手持型折光仪测定可溶性固形物含量，用NaOH滴定法[26]测定可滴定酸含量，用2,6-二氯靛酚滴定法[27]测定维生素C含量。
1.4 数据统计与分析
采用Excel 2010整理数据，数据采用“平均值±标准差”表示；用DPS 9.05进行方差分析。
2. 结果与分析
2.1 叶面喷施ALA对猕猴桃光合作用的影响
2.1.1 对叶绿素含量的影响
由图1可知：在盛花期和膨果期喷施10~50 mg/L ALA溶液均可提高猕猴桃叶片的叶绿素含量，其中以30 mg/L ALA溶液处理最佳，且与对照相比达到显著水平(P<0.05)。
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图 1 叶面喷施ALA对猕猴桃叶片光合作用的影响注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。Figure 1. Effects of foliar spraying ALA on the photosynthesis of kiwi leavesNote: The different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).2.1.2 对净光合速率的影响
由图1还可知：随着ALA质量浓度的增加，猕猴桃的净光合速率总体呈现先增加后降低的趋势，在质量浓度30 mg/L时达到最佳处理效果，且与对照相比增加40.52%。
2.2 叶面喷施ALA对猕猴桃营养生长的影响
由表1可知：随着ALA质量浓度的增加，猕猴桃的叶长、叶宽、叶面积、茎粗以及叶片厚度均呈先增加后降低的趋势，其中叶宽、叶面积、叶片厚度和茎粗均在30 mg/L时达到最大值。
表 1 叶面喷施ALA对猕猴桃茎、叶的影响Table 1. Effects of foliar spraying ALA on the stem and leaf of kiwiALA质量浓度/(mg·L−1)
ALA mass concentration叶长/cm
leaf length叶宽/cm
leaf width叶面积/cm2
leaf area叶片厚度/mm
leaf thickness茎粗/cm
stem thicknessCK 7.81±0.53 bc 9.98±0.89 bc 64.73±30.08 a 0.52±0.04 c 0.49±0.06 d 10 7.90±0.95 abc 10.06±0.68 bc 65.74±30.39 a 0.52±0.04 c 0.52±0.07 cd 20 8.53±1.08 a 10.08±0.58 bc 73.18±34.65 a 0.52±0.04 c 0.59±0.11 ab 30 8.25±0.70 ab 10.91±0.92 a 73.98±35.04 a 0.58±0.05 a 0.63±0.06 a 40 7.89±0.95 abc 10.43±0.97 ab 70.62±34.66 a 0.55±0.05 b 0.55±0.03 bc 50 7.28±0.51 c 9.68±0.62 c 58.39±26.29 a 0.51±0.03 c 0.51±0.02 cd 注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05); 下同。
Note: The different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05); the same as below.2.3 叶面喷施ALA对猕猴桃果实品质的影响
2.3.1 对果实外在品质的影响
由表2可知：10~50 mg/L ALA处理对猕猴桃果实的单果质量分别比对照增加4.43%、7.32%、13.66%、6.05%和3.89%，以30 mg/L ALA处理效果最佳；此外，猕猴桃果实的纵径和果形指数均在30 mg/L ALA处理时达到最大值。
表 2 叶面喷施ALA对猕猴桃果实外在品质的影响Table 2. Effects of foliar spraying ALA on the external quality of kiwiALA质量浓度/(mg·L−1)
ALA mass concentration单果质量/g
single fruit weight纵径/cm
longitudinal diameter横径/cm
transverse diameter果形指数
fruit shape indexCK 56.89±12.73 b 5.04±0.58 b 4.51±0.36 a 1.12±0.08 ab 10 59.41±12.04 ab 5.13±0.53 ab 4.57±0.35 a 1.12±0.09 ab 20 61.05±11.09 ab 5.10±0.55 ab 4.62±0.30 a 1.10±0.09 bc 30 64.66±9.17 a 5.33±0.47 a 4.58±0.26 a 1.16±0.09 a 40 60.33±7.48 ab 4.88±0.33 b 4.62±0.29 a 1.06±0.09 c 50 59.10±11.23 ab 5.02±0.57 b 4.49±0.28 a 1.10±0.10 ab 2.3.2 对果实内在品质的影响
由表3可知：30和40 mg/L ALA处理后，猕猴桃果实的固形物含量分别比对照显著增加13.03%和10.68% (P<0.05)，维生素C含量分别比对照显著增加25.00%和18.23% (P<0.05)；50 mg/L ALA处理后，猕猴桃果实的维生素C含量比对照显著降低31.82% (P<0.05)，说明高质量浓度的外源ALA对维生素C的抑制作用较为明显。
表 3 叶面喷施ALA对猕猴桃果实内在品质的影响Table 3. Effects of foliar spraying ALA on the fruit intrinsic quality of kiwiALA质量浓度/(mg·L−1)
ALA mass
concentration可溶性固形物含量/%
soluble solids content可滴定酸含量/(g·100 g−1)
titratable acids content固酸比
solid-acid ratio维生素C含量/(mg·100g−1)
vitamin C contentCK 13.64±0.89 bc 1.00±0.01 c 13.59±0.40 ab 150.99±21.27 c 10 14.51±0.92 abc 1.04±0.03 abc 14.02±0.39 a 152.04±16.64 c 20 14.79±0.35 ab 1.05±0.01 abc 14.03±0.18 a 155.83±6.15 bc 30 15.42±1.14 a 1.08±0.01 a 14.29±0.08 a 188.74±6.53 a 40 15.10±2.36 a 1.06±0.05 ab 14.28±0.65 a 178.51±12.39 ab 50 13.42±0.67 c 1.01±0.03 bc 13.25±0.12 b 102.95±12.70 d 3. 讨论
叶绿素对植物叶片进行光合作用具有重要意义，通过外源喷施ALA促进植株叶片的叶绿素含量已在甜瓜[8]、草莓[28]、葡萄[15]和苹果[16]等作物上取得积极的效果。本研究表明：30 mg/L ALA不仅提高了猕猴桃的叶绿素含量，还促进了叶片的净光合速率，如翠玉在盛花期喷施ALA 30 d后的叶绿素含量比对照增加8.52%，净光合速率比对照增加40.52%，说明通过外源喷施ALA对促进猕猴桃叶绿素合成及光合作用从而提高其产量及品质具有巨大潜力。
ALA是植物叶绿素和动物血红素生物合成的共同关键前体，因此具有对人畜的安全性，常常在高质量浓度下用作农田除草剂[29]，低质量浓度下用作植物生长调节剂[30]。生静雅等[31]研究表明：低质量浓度的ALA可促进核桃植株的生长，而高质量浓度则抑制核桃植株的生长。本研究表明：当ALA在10~50 mg/L时，随着ALA质量浓度的增加，对翠玉猕猴桃叶面积、茎粗以及叶片厚度的影响均总体呈先增加后降低的趋势，说明猕猴桃生长对ALA质量浓度的变化响应敏感，高质量浓度ALA抑制猕猴桃植株的生长，而低质量浓度ALA则促进其生长。
果实风味品质主要由糖含量、酸度以及合适的糖酸比构成。汪良驹等[32]对苹果的研究发现：ALA 处理可明显增加苹果果实可溶性固形物含量，降低酸度，提高固酸比；申明等[22]研究发现：外源ALA处理丰水梨后可以显著提高果实的可溶性固形物和可滴定酸含量；WATANABE等[33]研究发现：葡萄经外源ALA 处理后糖含量适中，酸含量降低。本研究表明：经适宜质量浓度的外源ALA 处理后，翠玉猕猴桃果实的可溶性固形物(糖)含量增加，但可滴定酸含量基本保持不变，因此提高了猕猴桃果实的固(糖)酸比，使猕猴桃风味更佳。
4. 结论
猕猴桃在开花前期至膨果期喷施适宜质量浓度的ALA溶液，能增加猕猴桃植株叶片的叶绿素含量，提高净光合速率，促进植株的营养生长，提高果实的单果质量、固酸比、可溶性固形物和维生素C含量，改善果实外观品质，提高鲜食风味；其中，以30 mg/L ALA处理效果最佳。
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图 1 供试樟叶越桔材料的继代增殖培养
Figure 1. Subculture and multiplication culture of test Vaccinium dunalianum material
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图 3 不同质量浓度细胞分裂素下愈伤组织再分化不定根的生长 (60 d)
Figure 3. Growth of callus redifferentiation adventitious root under different concentrations of cytokinin
表 1 樟叶越桔茎段愈伤组织诱导正交试验
Table 1 The orthogonal test of callus induction hormone combination of Vaccinium dunalianum
mg/L 处理
treatment2,4-D质量浓度
mass concentration of 2,4-DTDZ质量浓度
mass concentration of TDZT1 1.0 0.1 T2 1.0 0.2 T3 1.0 0.5 T4 2.0 0.1 T5 2.0 0.2 T6 2.0 0.5 T7 3.0 0.1 T8 3.0 0.2 T9 3.0 0.5 
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表 2 愈伤组织再分化诱导激素及其质量浓度
Table 2 Hormone and its concentration induced by callus redifferentiation
mg/L 处理
treatmentZT质量浓度
mass concentration of ZTTDZ质量浓度
mass concentration of TDZT10 0 0.5 T11 0 1.0 T12 0 1.5 T13 2.0 0 T14 3.0 0 T15 4.0 0
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表 3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effects of different hormone ratio on the callus induction of stem
处理
treatment外植体数
number of explant诱导率/%
induction rate愈伤组织质地
callus texture愈伤组织量
callus quantity初愈时间/d
the time of the first callusT1 60 90.0 乳白色颗粒，鲜活，质地紧密，长势较差
milky white particles, fresh, tight texture, poor growth++ 20 T2 60 93.3 乳白色颗粒，鲜活，质地紧密，长势较差
milky white particles, fresh, tight texture, poor growth++ 20 T3 60 76.7 乳白色颗粒，鲜活，质地紧密，长势较差
milky white particles, fresh, tight texture, poor growth++ 20 T4 60 100.0 乳白色大颗粒，鲜活，质地紧密，长势最好
milky white large particles, fresh, tight texture, the best growth++++ 12 T5 60 90.0 乳白色颗粒，鲜活，质地紧密，长势较好
milky white particles, fresh, tight texture, good growth+++ 15 T6 60 73.3 乳白色颗粒，鲜活，密集，质地紧密，长势较好
milky white particles, fresh, tight texture, good growth+++ 15 T7 60 76.7 乳白色颗粒，鲜活，质地疏松，长势一般
milky white particles, fresh, loose texture, general growth++ 15 T8 60 100.0 乳白色颗粒，鲜活，质地疏松，长势一般
milky white particles, fresh, loose texture, general growth++ 15 T9 60 93.3 乳白色颗粒，鲜活，质地疏松，长势一般
milky white particles, fresh, loose texture, general growth++ 15 注：“+” “++” “+++”和“++++”分别为愈伤组织量少、一般、较多和旺盛。
Note: “+” “++” “+++” and “++++” indicate callus quantity few, general, more and exuberant, respectively.
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表 4 不同质量浓度细胞分裂素对愈伤组织再分化不定根的影响
Table 4 Effects of different mass concentrations of cytokinin on the callus redifferentiation adventitious root
处理
treatment生根愈伤组织数
number of rooting callus生根率/%
rooting rate生长情况
growth conditionT10 29 96.7 根较长，数量较多，整齐，均匀
the roots are longer, more numerous, neat and evenT11 20 66.7 根较细长，数量中等，出根不均匀
the roots are long and thin, the number is general, and the roots are not uniformT12 14 46.7 根较短，数量较少，不齐
shorter roots, fewer in number, unevenT13 11 36.7 根较短，数量较少，稀疏，出根不均匀
the roots are short, few in number, sparse and unevenT14 16 53.3 根细长，数量少，稀疏，出根不均匀
the roots are slender, few in number, sparse and unevenT15 23 76.7 根长度中等，数量多，出根不均匀
the root length is medium, the number is much, the root is uneven
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