绿米稻因叶绿素大量沉积在种皮而使糙米呈浅绿色，是宝贵的有色稻种质资源，其稻壳呈紫色或红色，富含花青素^[1-2]。绿米米质优良，富含维生素、脂肪、叶绿素、膳食纤维及大量人体必需的微量元素。郭咏梅等^[3]研究发现：绿米富含Fe (9.02 mg/kg)和Zn (12.49 mg/kg)。韩磊等^[2]认为绿米的主要特点是含硒量高 (每100 g绿米中含硒量高达23.2 mg)。硒是一种维持生命的物质，当摄入量不足时，将会出现细胞病变，造成癌症及多种疾病的发生，被科学家誉为生命之火的“奇效元素”和“抗癌防癌之王”。绿米脂肪含量高达8%~9%，胶稠度高达 85%，属于软胶类型，蒸煮后米饭晶莹透亮，不易回生变硬，咀嚼感好，感观评价和综合评分优于黑米和红米^[4-5]。在中国丰富的稻种资源中蕴藏着一些绿米品种，比如河南的南阳绿米、中国水稻研究所的绿玉、广东育成的珍珠绿米、陕西育成的绿莹香米和上海交大培育的纯合香绿米品系^{[1, 6-8]}。有关有色稻米种质资源评价、色素基因以及栽培技术等研究主要涉及常见的黑米和红米，关于绿米的研究报道极少。本研究以引进日本绿米稻品种ND4为材料，研究施氮量对绿米稻叶绿素含量、产量及光合特性的影响，为绿米稻的高产优质栽培提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料与试验设计

供试品种为从日本引进的绿米稻品种ND4，有芒，稻壳为紫色，全生育期155~158 d，成熟后大部分糙米为浅绿色，米粒大都半透明，米质优良。试验于2017—2018年在四川农业大学温江试验基地进行。供试土壤0~20 cm化学性状为：有机质含量为29.54 g/kg，全氮含量为1.76 g/kg，碱解氮含量为122.15 mg/kg，速效磷含量为66.21 mg/kg，速效钾77.24 mg/kg，pH 7.0。

试验采用单因素随机区组设计，设置施纯氮0 (N0)、90 kg/hm² (N90)、135 kg/hm² (N135)、180 kg/hm² (N180) 和225 kg/hm² (N225) 5个处理，以N0为对照，小区面积12 m²，3次重复。4月16日播种，5月26日移栽，每穴2苗，行穴距为30 cm×25 cm。氮肥为尿素，按m (基肥)∶m (蘖肥)=7∶3 施入，磷肥为过磷酸钙 (P₂O₅ 90 kg/hm²)，钾肥为氯化钾 (K₂O 180 kg/hm²)，基肥和全部磷钾肥在移栽前1 d施入，其余管理措施保持一致。

1.2   测定项目及方法

1.2.1   土壤基础肥力的测定

试验前取耕作层 (0~20 cm) 土壤样品，采用常规方法^[9]测定土壤养分含量。

1.2.2   产量的测定

成熟期 (开花后35 d) 每小区选取30株调查有效穗数；每小区按平均有效穗数选取5株，调查每穗粒数、结实率、千粒质量和理论产量等指标。

1.2.3   颖果和叶片叶绿素含量的测定

水稻始穗期 (8月22日)，在每个小区挂牌标记同日抽出的稻穗，分别于开花后10、15、20、25、30和35 d取样。每次取样于上午8：30—10：30采标记稻穗和剑叶，并以穗上部籽粒和去叶脉的叶片中部为测试材料。每次称取0.5 g颖果和0.1 g叶片，分别放入25 mL试管内，向试管内加入 [V (无水乙醇)∶V (丙酮)=5∶5] 混合浸提液20 mL，将试管置于黑暗中浸提颖果和颖壳中的叶绿素，待颖果和叶片完全褪色后，用浸提试剂定容至25 mL，以浸提试剂为空白，分别在波长663、646和470 nm处测定吸光度，并按以下公式计算：

叶绿素a质量浓度 =12.2×OD₆₆₃−2.83×OD₆₄₆；

叶绿素b质量浓度 =20.11×OD₆₄₆−5.02×OD₆₆₃；

叶绿素含量 (mg/g) =叶绿素a或b的质量浓度 (mg/L) ×提取液总量 (mL)/颖果或叶片鲜质量×1000。

1.2.4   颖果总酚含量的测定

总酚含量用福林酚法参照张玲^[10]的方法测定。

1.2.5   剑叶光合速率的测定

在水稻开花后10、15、20、25、30和35 d的上午8：30—11：00选取长势一致的5株，利用 LI-6400 型便携式光合作用测定仪测定光合速率，取5株平均值进行数据分析。

1.3   数据处理

所有数据结果均为3次重复的平均值，利用SPSS 20.0软件进行数据分析和差异显著性检验，采用最小显著性差异法 (LSD) 在P<0.05水平上做多重比较。

2.   结果与分析

2.1   施氮量对绿米颖果叶绿素含量的影响

2.1.1   施氮量对绿米颖果叶绿素a含量的影响

如图1所示：绿米颖果中叶绿素a的含量随着生育进程的推进表现出降低的趋势，其中开花后15~20 d，下降速率最快。开花后10 d，N225处理下的叶绿素a含量最高 (103.3 μg/g)，且显著高于其他处理 (P<0.05)，N135和N180处理下叶绿素a含量显著高于N90和N0 (P<0.05)；开花后15 d，N225 (81.0 μg/g)和N180 (80.6 μg/g) 处理下的叶绿素a含量显著高于其他处理 (P<0.05)；开花后20和25 d各施氮处理间叶绿素a含量差异不显著；开花后30 d (腊熟期)，N135处理下叶绿素a含量 (34.2 μg/g) 显著高于其他处理 (P<0.05)，N180 (22.3 μg/g) 和N225 (27.1 μg/g) 处理间差异不显著；开花后35 d (完熟期)，N225处理下叶绿素a含量最高 (26.4 μg/g)，各施氮处理间差异不显著，但均显著高于N0处理 (9.2 μg/g) (P<0.05)，分别比对照高186.95%、178.26%、140.22%和105.43%。表明施氮能显著提高绿米颖果叶绿素a含量。

图  1  施氮量对颖果叶绿素a、b和总酚含量的影响

注：N0、N90、N135、N180和N225分别代表施氮量0、90、135、180和225 kg/hm²。

Figure  1.  Effect of nitrogen application rates on the contents of chlorophyll a, b and total phenol in caryopsis

Note: N0, N90, N135, N180 and N225 represent the nitrogen application rates of 0, 90, 135, 180 and 225 kg/hm².

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2.1.2   施氮量对绿米颖果叶绿素b含量的影响

如图1所示：绿米颖果中叶绿素b的含量随着生育进程的推进而降低，其中开花后15~20 d下降速率最快。开花后10和15 d，叶绿素b含量随施氮量的增加而增加，N225处理下含量最高，且各处理间差异显著 (P<0.05)；开花后20 d，N135 (28.3 μg/g)、N180 (31.0 μg/g)和N225 (43.7 μg/g)处理间叶绿b含量差异显著 (P<0.05)，且显著高于N90 (21.3 μg/g)和N0 (19.5 μg/g)；开花后25 d，施氮量≥135 kg/hm²时，颖果叶绿素b的含量差异不显著，但显著高于N90和N0 (P<0.05)；开花后30 d (腊熟期)，N225处理下叶绿素b含量 (19.4 μg/g)分别比N0、N90、N135和N180高139.51%、42.65%、29.33%和16.16%；开花后35 d (完熟期)，颖果叶绿素b的含量在N135 (11.0 μg/g)、N180 (13.3 μg/g)和N225 (14.8 μg/g)处理间差异不显著，但显著高于N90 (6.0 μg/g)和N0 (5.1 μg/g) (P<0.05)。表明开花后各个生育时期氮肥对绿米稻颖果中叶绿素b含量影响较大，且随施氮量增加而增加。

2.1.3   施氮量对不同成熟期绿米颖果叶绿素含量的影响

如表1所示：颖果叶绿素含量随施氮量的增加而增加，但随成熟期的推进呈下降趋势 。其中腊熟期N135处理下叶绿素含量最高，与N225处理差异不显著；各处理下，完熟期相对腊熟期分别下降31.58%、23.38%、32.72%、0.51%和11.21%。表明高氮 (N180和N225) 处理下，随成熟期推进颖果叶绿素含量下降率更低，色素更稳定。就叶绿素含量而言，在腊熟期 (开花后30 d) 能收获叶绿素含量更高的绿米。

表  1  施氮量对不同成熟期绿米颖果叶绿素含量的影响

Table  1.  Effect of nitrogen application rates on the chlorophyll content in different maturity caryopsis μg/g

处理 treatment	腊熟期 maturity stage	完熟期 full ripening stage
N0	20.9±3.2 d	14.3±3.0 d
N90	32.5±2.5 c	24.9±2.8 c
N135	49.2±4.6 a	33.1±4.3 b
N180	39.0±3.5 b	38.8±5.2 ab
N225	46.4±1.0 a	41.2±3.5 a
注：N0、N90、N135、N180和N225分别代表施氮量0、90、135、180和225 kg/hm2；同一列不同小写字母表示各处理间差异显著 (P<0.05)；下同。 Note: N0, N90, N135, N180 and N225 represent the nitrogen application rates of 0, 90, 135, 180 and 225 kg/hm2; different lowercase letters in the same columns indicate significantly difference among treatments (P<0.05); the same as below.

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2.2   施氮量对绿米颖果总酚含量的影响

如图1所示：绿米颖果中总酚的含量随着生育进程的推进也表现出降低的趋势。颖果中总酚的含量在各施氮处理下表现为N225>N180>N135>N90>N0。开花后10、20 和30 d，N225处理下的颖果总酚含量显著高于其他处理 (P<0.05)，而N135和N180处理间差异不显著；开花后15 d，N180 (119.77 mg/g)和N225 (123.72 mg/g)处理下颖果的总酚含量显著高于其他处理(P<0.05)；开花后25 d，施氮量≥180 kg/hm²时，颖果总酚含量显著高于 N90和N0处理，且各处理间差异显著 (P<0.05)；开花后35 d各施氮处理间颖果总酚的含量分别为N225 (57.74 mg/g)>N180 (55.34 mg/g)>N135 (48.10 mg/g)>N90 (45.20 mg/g)>N0 (42.58 mg/g)。说明在绿米开花后各个生育时期氮肥对总酚的影响比较大。

2.3   施氮量对绿米剑叶光合特性的影响

2.3.1   施氮量对绿米剑叶叶绿素含量的影响

由图2所示：绿米剑叶叶绿素含量随着生育进程的推进表现出先增加后降低的趋势，在开花后20 d含量最高。开花后各时段，不同施氮处理下剑叶叶绿素含量均随施氮量的增加而增加。N180处理下开花后20 d的叶绿素的含量在整个生育期最高 (3.99 mg/g)，比对照 (N0) 高48.51%，但与N225差异不显著；开花后25 d，叶绿素含量在各处理下相对于开花后20 d分别下降9.33% (N0)、1.05% (N90)、3.16% (N135)、13.28% (N180)和10.80% (N225)；开花后30 d，叶绿素含量在各处理下相对于开花后25 d分别下降28.56% (N0)、27.20% (N90)、24.10% (N135)、8.82% (N180)和5.68% (N225)；开花后35 d，光合速率下降变缓，各处理相对开花后30 d分别下降4.67% (N0)、12.00% (N90)、12.36% (N135)、18.77% (N180)和15.81% (N225)。

图  2  施氮量对剑叶叶绿素含量和净光合速率的影响

Figure  2.  Effect of nitrogen application rates on the chlorophyll content and net photosynthetic rate (P_n) of flag leaves

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2.3.2   施氮量对绿米剑叶光合速率的影响

如图2所示：随着生育进程的推进，不同氮肥处理下的剑叶净光合速率呈先增后降的变化趋势，在开花后20 d最高；从施氮水平来看，开花后各时段均随施氮量的增加而增加。开花后20 d，各处理下净光合速率分别为N225 [29.67 mol/(m²·s)]>N180 [27.33 mol/(m²·s)]>N135 [25.85 mol/(m²·s)]>N90 [25.24 mol/(m²·s)]>N0 [20.27 mol/(m²·s)]；开花后25 d，光合速率下降缓慢，各处理相对于开花后20 d分别下降22.94% (N0)、19.69% (N90)、9.98% (N135)、11.31% (N180)和4.89% (N225)；开花后30 d，光合速率下降最快，各处理相对于开花后25 d分别下降21.93% (N0)、38.83% (N90)、42.63% (N135)、38.73% (N180)和43.70% (N225)；开花后35 d，光合速率下降变缓，各处理相对开花后30 d分别下降19.65% (N0)、18.10% (N90)、16.26% (N135)、21.48% (N180)和16.01% (N225)。

2.4   施氮量对绿米产量的影响

如表2所示：有效穗数随着施氮量的增加而增加，且各处理间差异显著 (P<0.05)；千粒质量也随施氮量增加而增加，N225处理显著高于N0和N90 (P<0.05)，其余各处理间差异不显著；穗粒数及产量随着施氮量的增加呈先增后降的变化趋势，在N180 处理下产量达到最大值，为4.66 t/hm²，当施氮量超过180 kg/hm²时产量下降。当施氮在量0~180 kg/hm²范围内，施用氮肥增加了绿米的有效穗数和穗粒数，因而产量增加，而当施氮量超过这个范围时，穗粒数、结实率和产量均降低。

表  2  施氮量对绿米稻产量构成及产量的影响

Table  2.  Effect of nitrogen application rates on the yield components and yield of green rice

处理 treatment	有效穗数×104/hm−2 effective panicle	穗粒数 spikelet number	千粒质量/g 1 000-grain weight	结实率/% seed setting rate	产量/(t·hm−2) grain yield
N0	296.44±1.83 e	65.29±1.11 e	23.41±0.51 bc	79.23±0.27 a	3.59±0.31 c
N90	315.52±1.03 d	79.45±1.20 d	23.75±0.37 bc	66.74±0.29 b	3.97±0.27 bc
N135	328.74±1.04 b	83.15±0.69 b	24.24±0.16 ab	63.08±0.31 d	4.18±0.27 ab
N180	321.87±1.00 c	91.87±0.85 a	24.43±0.19 ab	64.50±0.33 c	4.66±0.46 a
N225	337.66±1.21 a	81.08±0.54 c	24.73±0.16 a	60.85±0.15 e	4.12±0.33 b

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3.   讨论

3.1   施氮量对绿米叶绿素含量的影响

研究表明：水稻颖果在发育初期呈绿色，这是因为果皮中层细胞中含有叶绿体的缘故^[11]。柳敏^[12]对黑米的研究发现：从外观上看，黑米颖果发育早期果皮呈绿色，表明其颖果中也含有叶绿素，但随着花色素的积累，果皮逐渐呈现花色素的颜色，叶绿素颜色被花色素掩盖，其存在与否从外表上已无法辨别；利用荧光显微镜观察颖果横切面，发现颖果中的叶绿素只存在于果皮细胞中，且靠近背部维管束的部位最为丰富；颖果发育前中期，叶绿素含量较多，往后逐渐减少，开花后28 d时叶绿素含量已经很低，而开花后35 d时几乎不存在。本试验中，绿米颖果叶绿素含量和前人研究结论相似，随着绿米稻生育进程的推进，叶绿素含量逐渐降低，因此为保证绿米色泽，收获期不宜太迟。本试验结果表明：在开花后30 d (腊熟期) 收获为宜。叶绿素是含氮化合物，本试验中随施氮量的增加叶绿素含量总体呈增加的趋势，且施氮处理的叶绿素含量均显著高于不施氮，说明施氮量能提高绿米颖果叶绿素含量。

总酚包括多酚和单酚，是广泛存在于蔬菜、水果、豆类和谷物类等植物中的复杂次生代谢物^[13]。酚类化合物一般可以分为两大类：一类是多酚体，主要包括苯丙烷类和类黄酮化合物；另一类则是由多个单聚体聚集成的低聚体或多聚体，统称单宁类物质^[14]。由于绿米颖壳为紫色，推测其可能含有大量花青素及酚类等次生代谢物，而颖果却呈绿色，因此本研究测定了颖果花青素和总酚含量。但由于颖果中花青素含量低于所用方法的检测限值，所以并未测出。研究发现：水稻籽粒中绝大多数代谢物随籽粒发育呈显著下降趋势，本试验中总酚含量与叶绿素均随生育期的推进降低。不同施氮处理下，总酚含量随施氮量的增加而增加，这与前人研究结果相似。吴碧球等^[15]研究表明：水稻叶片总酚含量与施氮量呈显著正相关关系。李耀光^[16]研究发现：不同粒色小麦品种对氮磷肥配比的响应不同，豫麦49-198在高氮 (N2P1和N2P2) 处理下总酚含量较高，红麦则以N1P2处理时的总酚含量较高，黑小麦新周1号在N2P2条件下总酚含量较高。此外，本研究发现：成熟期绿米颖果叶绿素和总酚在中高氮 (N135、N180和N225) 处理下差异不显著，这是由于随生育进程推进，籽粒的发育效应大于氮素调控效应^[17]。

3.2   施氮量对绿米剑叶光合特性的影响

研究表明：增施氮素能显著提高植物叶片氮素和光合色素含量，改善植物光合性能，增强叶片生理活性^[18-19]。氮是水稻的必需元素，对水稻叶片生长及叶片的光合能力影响很大。增施氮肥可以增加叶绿素含量，延长叶片功能期，提高光合效率，但随着施氮量的增加，无效分蘖增多，氮素较多地积累在营养器官中，不利于从源到库的转化，导致抽穗后叶绿素含量降低^[20-21]。本试验结果表明：随着生育进程的推进，剑叶叶绿素含量呈先增后降的趋势，在开花后20 d最高，此时在不同的施氮水平下表现为N180>N225>N135>N90>N0。可能是由于施氮量过大导致剑叶叶面积加大，叶片变薄，叶绿素相对含量会随之下降^[22]。说明适宜的施氮量能有效提高绿米稻剑叶中叶绿素的含量，可以提高水稻后期光合作用强度，从而为生产高含量叶绿素的绿米稻产品提供了可能途径。

光合作用是作物生长发育的决定性因素，光合速率是表征光合能力的重要参数之一^[23]。本试验结果显示：开花后各时段随施氮量的增加光合速率提高；随着生育进程的推进，呈先增后降的趋势，在开花后20 d最大；在开花后20~25 d下降缓慢，开花后25~30 d下降速率最快。表明增施氮肥可提高水稻剑叶的光合速率，增强PSⅠ和PSⅡ的电子传递能力，延长叶片光合速率高值持续期，改善光合性能，增加非光化学猝灭 (NPQ)，增强生育后期叶片的PSⅡ潜在活性、PS最大光化学效率和叶片生理活性，延缓中、下部叶片的衰老，增加生育后期的光合产量^[24-25]。同时研究表明：施氮加快后期碳氮代谢的速率，光合强度增加，可以提高后期叶片的光化学猝灭，提高叶片净光合速率^[26]。

3.3   施氮量对绿米产量的影响

研究表明：当氮素施用水平由低逐渐增高时，产量随氮素用量的增加相应的提高，但是当氮素用量达到一定水平时，再增加氮素，产量提高并不显著，甚至造成减产^[27-28]。关于水稻适宜施氮量的研究较多，由于试验品种、方法及条件的不同，结果也有差异^[29-31]。从夕汉等^[32]认为：施氮量为120~270 kg/hm²时，水稻籽粒产量增幅最大，超过270 kg/hm²时则下降。张桂莲等^[33]研究表明：适宜的施氮量能增加穗粒数和结实率，但不能超过150 kg/hm²。卢浩宇等^[34]研究表明：随施氮量增加，紫米稻分蘖增加、成穗率提高、叶面积增大、物质积累增多以及产量显著提高。本试验结果表明：产量随氮肥用量的增加而呈先增后降的趋势，并以N180处理时达到最高。在0~180 kg/hm²范围内，穗粒数和千粒质量均随着施氮量的增加而增加；但当施氮量超过180 kg/hm²，穗粒数和结实率均降低导致产量降低；这可能是过高的施氮量导致水稻贪青晚熟，植株干物质积累过多，但向穗部转移少，空瘪粒增加^[35]。因此，适宜的施氮量才能强化光合产物向穗部转移，以此达到充实的目的，提高氮素偏生产力，进而提高产量。

4.   结论

绿米颖果中叶绿素及总酚的含量均随着生育进程的推进表现出降低的趋势；开花后各个生育时期绿米颖果中叶绿素及总酚含量随施氮量增加而增加。此外，高氮 (N180、N225) 处理下，随成熟期推进颖果色泽更稳定。绿米剑叶叶绿素含量及净光合速率随着生育进程的推进表现出先增加后降低的趋势，在开花后20 d达到峰值；开花后各时段随施氮量的增加而增加。产量在N180 (180 kg/hm²) 处理下达到最大值 (4.66 t/hm²)，当超过180 kg/hm²时产量下降；产量构成因子中，有效穗数和千粒质量随施氮量增加而增加，穗粒数和结实率随着施氮量的增加呈先增后降的变化趋势。因此，本试验条件下绿米高产栽培条件为N180 (180 kg/hm²) 处理，且在腊熟期 (开花后30 d)能收获叶绿素含量更高的绿米。