海南省番茄晚疫病菌对甲霜灵的敏感性及有效药剂筛选
Sensitivity to Metalaxyl and Screening of the Effective Fungicides of Phytophthora infestans in Hainan Province
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通关藤(Marsdenia tenacissima)为萝藦科牛奶菜属植物的干燥藤茎，具有清热解毒、止咳平喘及散结止痛等功效[1]。消癌平注射液和消癌平片就是以通关藤为原料的抗癌药，市场前景广阔。评价通关藤药材品质的主要指标有通关藤苷H、总皂苷、绿原酸及总酚酸 [2-4]。干燥是药材采后加工的重要环节之一，药材品质与干燥过程密切相关。干燥方法不当会使中药材组织结构破坏，药味药性发生改变，有效成分损失严重[5]。人们普遍认为中药材活性成分含量在干燥过程中逐渐下降[6-7]；也有学者认为植物次生代谢物一般是环境胁迫的产物[8-9]，干燥过程是其质量再塑的重要环节，随着含水量的变化，不断地合成次生代谢物[10]。因此，选择恰当的干燥方法有利于提高中药材的品质。有文献报道：总酚酸、绿原酸和总皂苷等化合物的含量受干燥温度的影响很大，干燥温度过高对香菇多酚有破坏作用[11]；冷冻干燥的金银花[12]和丹参[13]中的多酚损失最小；炒制后的苍耳子总酚酸含量低[14]；40 ℃烘干可使人参花和西洋参花中原有人参皂苷量保持在最高水平，而高温处理则可使其转化为其他稀有皂苷[15]。目前关于通关藤采后干燥的方法未见报道，传统的干燥方式是自然阴干或晒干，导致药材质量参差不齐。因此，本研究在前人研究的基础上，重点围绕不同干燥温度及干燥方式对通关藤中4个药效成分含量的影响展开研究，为通关藤的干燥方法提供科学指导。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
种植于云南省蒙自市水田乡示范基地三年生通关藤的茎。
1.2 试验方法
1.2.1 试验处理
从云南信通植物药业有限公司水田乡种植基地随机选取三年生通关藤植株50株，采收距离植株基部0.2~1.0 m的茎段作为样品混匀。将混合样品平均分成5份，做不同的干燥方式试验，分别是阴干、阴干10 d+50 ℃烘干、30 ℃烘干、50 ℃烘干、105 ℃杀青30 min+80 ℃烘干。将各处理后至恒重的通关藤打粉，过80目筛密封保存备用。
1.2.2 通关藤苷H的测定[16]
采用色谱柱型号为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)、检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)的Waters e2695 HPLC仪检测通关藤苷H的含量。检测条件：柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，流动相为V(乙腈)∶V(水)=50∶50。
标准品溶液的制备：精确称取通关藤苷H标准品(中国食品药品鉴定研究院)，加甲醇配制成每1 mL含0.3 mg的溶液。供试品溶液的制备：取通关藤粉末(过80目筛) 0.5 g，置具塞锥形瓶中，精确加甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(KQ-500DA型，功率240W，频率40KHz) 45 min，取出放至冷却，再称定重量，用甲醇补足重量，摇匀，过滤。精确量取滤液25 mL，采用旋转蒸发仪蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中，加甲醇定容。
1.2.3 通关藤总酚酸含量的测定
精确称取绿原酸标准品，加乙醇配制成每1 mL含80 μg的母溶液。分别精确吸取对照品溶液母液0.5、1、2.5、4和5 mL置于10 mL试管中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成不同质量浓度的对照品溶液。绘制的标准曲线方程为：y=5.851 1x−0.011 5 (R2=0.999 9)。
供试品溶液的制备及测定方法参照孟衡玲等[17]的方法。称取本品粉末(过80目筛)1 g，3次重复，分别置于具塞锥形瓶中，按料液比1∶16 (g∶mL)加入70%乙醇16 mL，50 ℃下水浴浸提1 h，过滤后用70%乙醇冲洗残渣3次，定容至50 mL。采用铁氰化钾—三氯化铁法测定通关藤总酚酸含量。
1.2.4 通关藤绿原酸含量的测定
绿原酸标准品溶液制备：取绿原酸标准品适量，精确称取置于棕色瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。分别精确吸取对照品贮备液1、2、4、5、6和7 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇配制成不同质量浓度的标准品溶液。采用HPLC法测定绿原酸的含量，C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/mim，流动相为乙腈−0.05%磷酸(9∶91，体积比)，进样量3 μL，在327 nm紫外波长下测定。以峰面积为横坐标，绿原酸含量为纵坐标，绘制标准曲线：y=63 912x−10 573 (R2=0.999 95)。
供试品溶液的制备：精确称取通关藤药材细粉2 g，置于具塞锥形瓶中，精确量取并加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理(功率240 W，频率40 KHz) 30 min，取出放至冷却，再称定重量，用50%甲醇补足重量，摇匀，滤过。
供试品绿原酸含量的测定：精确吸取供试品溶液20 μL，按照标准品的色谱条件测定峰面积，带入标准曲线计算各处理下绿原酸的含量。
1.2.5 通关藤总皂苷含量的测定
标准曲线的制备：精确称取通光散苷A标准品15 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.15 mg/mL的母液。精确量取对照品溶液1、2、3、4和5 mL分别置于10 mL具塞试管中，精确加入新制的5%香草醛—冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.6 mL，摇匀，置于70 ℃水浴中放置30 min后取出，置冰浴中放置5 min，加冰醋酸10 mL，摇匀，在469 nm波长处测定吸光度。绘制的标准曲线为：y=0.037x−0.04 (R2=0.999 1)
供试品溶液的制备：精确称取过80目筛的通关藤粉末1.000 g，置于具塞锥形瓶中，精确加95%乙醇50 mL，超声处理(功率120 W，频率40 KHz)30 min，过滤，定容至50 mL。精确量取1 mL供试样品，测定方法参照1.2.5节中通关藤总皂苷含量的测定。
1.3 数据统计与分析
采用SPSS 21.0软件单因素Duncan法进行方差分析。
2. 结果与分析
2.1 不同干燥方式对通关藤总酚酸含量的影响
由图1可知：5种干燥方式中，阴干处理的总酚酸含量显著高于其他4种干燥方式(P<0.05)，其含量为30 ℃烘干、阴干10 d+50 ℃烘干及80 ℃烘干的1.5倍左右。50 ℃烘干的通关藤总酚酸含量次之，其余3种干燥方式总酚酸含量最低且三者间无显著性差异。
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图 1 不同干燥方式下通关藤总酚酸的含量注：小写字母表示在5%水平下的显著性差异性；下同。Figure 1. The content of total phenolic acid in M. tenacissima under different drying methodsNote: Different letters mean significant differences at 5%; the same as below.2.2 不同干燥方式对通关藤中总皂苷含量的影响
由图2可知：阴干和阴干10 d+50 ℃烘干处理下的总皂苷含量最高，二者间无显著差异；50 ℃烘干和30 ℃烘干的总皂苷含量次之，二者间也无显著性差异，而在80 ℃烘干时总皂苷含量最低。说明阴干最适宜通关藤总皂苷的保留，而高温能加速总皂苷的分解。
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图 2 不同干燥方式下通关藤总皂苷的含量Figure 2. The content of total saponins in M. tenacissima under different drying methods2.3 不同干燥方式对通关藤苷H含量的影响
由图3可知：低温干燥的3个处理(阴干、30 ℃烘干、阴干10 d+50 ℃烘干)的通关藤苷H含量最低，且三者间无显著差异；随着干燥温度的增加，通关藤苷H的含量急剧增加，在80 ℃烘干时达到最高。说明在高温干燥条件下，可能有其他物质转化合成通关藤苷H。
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图 3 不同干燥方式下通关藤苷H的含量Figure 3. The content of tenacissoside H in M. tenacissima under different drying methods2.4 不同干燥方式对绿原酸含量的影响
由图4可知：阴干10 d+50 ℃烘干下绿原酸的含量最高，是80 ℃烘干条件下绿原酸含量的8倍；50 ℃和80 ℃烘干的绿原酸含量极低，表明高温下绿原酸不稳定，极易分解。
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图 4 不同干燥方式下通关藤中绿原酸的含量Figure 4. The content of chlorogenic acid in M. tenacissima under different drying methods3. 讨论
本研究发现：较低干燥温度下的总酚酸和绿原酸含量较高，但二者的最适宜干燥温度也不完全一致，绿原酸在阴干10 d+50 ℃烘干时含量显著提高，但总酚酸在该处理下的含量却是最低，阴干处理下含量最高。前人在薄荷研究中也得到了相似的结果：总酚酸含量在50~60 ℃干燥时达低谷，其根本原因在于此时PPO酶活性最高，催化大量的酚酸类物质分解，因而绿原酸的含量大大增加，经微波杀青使PPO酶失活后，总酚酸含量增加[18]；同样地，在菊苣中采用水浴、烫漂等方法钝化PPO酶活后，绿原酸的含量增加[19]。本研究也发现：在80℃的高温下，总酚酸和绿原酸的含量均较低，其根本原因在于总酚酸和绿原酸含有多个酚羟基，有热不稳定的特性，在高温下容易分解[20-21]。丹参中的丹酚酸B在70 ℃时易分解[22]；在香菇干燥过程中也发现，干燥温度过高，对多酚成分有破坏作用[11]。但也有不同的研究结果，在金银花中，烘干[23]或微波干燥[24]有利于总酚酸和绿原酸的保留；100 ℃热风干燥处理促使橙皮中总酚酸含量显著增加[25]。因此，采用何种干燥方法进行干燥，应依植物本身特性而定。
同样，干燥温度对通关藤中总皂苷和通关藤苷H含量的影响也较大，阴干和阴干10 d+50 ℃烘干时的总皂苷含量最高，二者无显著性差异，在80 ℃高温下烘干，总皂苷含量最低；通关藤苷H的含量与总皂苷的变化却正好相反，通关藤苷H在80 ℃烘干时含量急剧增加，表现出随着干燥温度的增加含量随之增加的趋势。人参花和西洋参花在40 ℃烘干时可使原有人参皂苷量保持在最高水平，而高温处理则可使其转化为其他稀有皂苷[15]；35 ℃烘干处理滇重楼总皂苷含量最高，而在70 ℃和100 ℃下干燥的总皂苷含量却很低[26]；干燥温度为42~65 ℃时，柴胡、川麦冬皂苷损失率都较小，若温度高，则皂苷容易在高温下分解[27-29]。前人的研究结果与本研究的基本一致。因此，推测在高温烘干下促使总皂苷向通关藤苷H转化。
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表 1 供试药剂及毒力测定质量浓度 (ρ)
Table 1 Tested fungicides and toxicity test mass concentration (ρ)
序号 No. 药剂名称 fungicides name 制造商 manufacturers ρ/(μg·mL−1) 1 96% 噁霜灵原药
oxadixyl 96% original pesticide瑞士先正达作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 2 87% 唑胺菌酯原药
pyrametostrobin 87% original pesticide沈阳化工研究院 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 3 98% 霜脲氰原药
cymoxanil 98% original pesticide利民化学有限责任公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 4 95% 氟吗啉原药
flumorph 95% original pesticide沈阳科创化学品有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 5 97% 甲霜灵原药
metalaxyl 97% original pesticide一帆生物科技集团有限公司 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 6 96% 烯酰吗啉原药
dimethomorph 96% original pesticide江苏耕耘化学有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 7 90% 百菌清原药
chlorothalonil 90% original pesticide江阴苏利化学股份有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 8 95% 嘧菌酯原药
azoxystrobin 95% original pesticide南京红太阳股份有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 9 85% 代森锰锌原药
mancozeb 85% original pesticide河北贺森化工有限公司 40、20、10、5、2.5、1.25 10 96% 苯氧菌酯原药
kresoxim-methyl 96% original pesticide江苏耕耘化学有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 11 68% 精甲霜灵·代森锰锌 WG
metalaxyl-M·mancozeb 68% WG瑞士先正达作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 12 687.5 g/L 霜霉威盐酸盐·氟吡菌胺 SC
fluopicolide·propamocarb·hydrochloride 687.5 g/L SC拜耳作物科学 (中国) 有限公司 40、20、10、5、2.5、1.25 13 69% 烯酰吗啉·代森锰锌 WP
dimethomorph·mancozeb 69% WP山东汤普乐作物科学有限公司 40、20、10、5、2.5、1.25 14 250 g/L 嘧菌酯 SC
azoxystrobin 250 g/L SC先正达南通作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 15 80% 代森锰锌 WP
mancozeb 80% WP美国陶氏益农公司 40、20、10、5、2.5、1.25 16 75% 百菌清 WP
chlorothalonil 75% WP先正达 (苏州) 作物保护有限公司 40、20、10、5、2.5、1.25 17 50% 烯酰吗啉 WP
dimethomorph 50% WP巴斯夫欧洲公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 18 72% 霜脲氰·代森锰锌 WP
cymoxanil·mancozeb 72% WP美国杜邦公司 40、20、10、5、2.5、1.25 19 10% 氰霜唑 SC
cyazofamid 10% SC日本石原产业株式会社 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 20 53.8% 氢氧化铜 WG
cupric hydroxide 53.8% WG美国杜邦公司 1000、500、250、125、62.5、31.25 21 250 g/L 吡唑醚菌酯 EC
pyraclostrobin 250 g/L EC巴斯夫欧洲公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 22 64% 噁霜灵·代森锰锌 WP
oxadixyl·mancozeb 64% WP先正达 (苏州) 作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 23 20% 唑胺菌酯 SC
pyrametostrobin 20% SC沈阳化工研究院 40、20、10、5、2.5、1.25 24 23.4% 双炔酰菌胺 SC
mandipropamid 23.4% SC先正达南通作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 25 60% 吡唑醚菌酯·代森联 WG
pyraclostrobin·methyram 60% WG巴斯夫欧洲公司 40、20、10、5、2.5、1.25 26 440 g/L 精甲霜灵·百菌清 SC
metalaxyl-M·chlorothalonil 440 g/L SC先正达南通作物保护有限公司 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 
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表 2 10种杀菌剂原药对番茄晚疫病菌的抑菌活性
Table 2 Inhibitory activity of 10 originals against P. infestans
药剂 fungicides 毒力回归方程 toxic regression equations EC50/(μg·mL−1) 相关系数(R2) correlation coefficient 甲霜灵 metalaxyl y=4.7877x+7.2114 0.35±0.11 a 0.9536 嘧菌酯 azoxystrobin y=2.9194x+4.9493 1.04±0.28 b 0.9721 烯酰吗啉 dimethomorph y=3.5818x+4.5281 1.35±0.19 b 0.9565 百菌清 chlorothalonil y=3.7896x+4.0560 1.77±0.22 bc 0.9488 唑胺菌酯 pyrametostrobin y=3.5999x+4.0263 1.86±0.29 c 0.9185 噁霜灵 oxadixyl y=1.8612x+3.7902 4.47±0.18 d 0.9425 霜脲氰 cymoxanil y=5.2259x+0.5677 7.05±0.94 e 0.9742 苯氧菌酯 kresoxim-methyl y=4.9246x+0.4835 8.26±0.61 e 0.9813 氟吗啉 flumorph y=2.3835x+2.7717 8.61±0.81 e 0.9727 代森锰锌 mancozeb y=5.5758x−1.9746 17.82±1.94 f 0.9435 注：根据 Fisher’s LSD 分析，同列数据后带相同小写字母表示数据间无显著差异 (P=0.05)；下同。
Note: Data with the same letter in the same column are not significantly different at P=0.05, according to Fisher’s LSD multiple range tests; the same as below.
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表 3 16种杀菌剂制剂对番茄晚疫病菌的抑菌活性
Table 3 Inhibitory activity of 16 formulations of fungicides against P. infestans
药剂
fungicides毒力回归方程
toxic regression equationsEC50/
(μg·mL−1)相关系数(R2)
correlation coefficient440 g/L 精甲霜灵·百菌清 SC metalaxyl-M·chlorothalonil 440 g/L SC y=3.6668x+4.8211 1.05±0.19 a 0.9515 64% 噁霜灵·代森锰锌 WP oxadixyl·mancozeb 64% WP y=3.7874x+4.5969 1.28±0.21 a 0.9678 23.4% 双炔酰菌胺 SC mandipropamid 23.4% SC y=3.4527x+4.3914 1.50±0.31 a 0.9852 10% 氰霜唑 SC cyazofamid 10% SC y=4.5258x+3.3812 2.28±0.29 b 0.9873 250 g/L 吡唑醚菌酯 EC pyraclostrobin 250 g/L EC y=3.0034x+3.6174 2.89±0.33 b 0.9896 250 g/L 嘧菌酯 SC azoxystrobin 250 g/L SC y=5.8981x+1.1360 4.52±0.29 c 0.9805 68% 精甲霜灵·代森锰锌 WG metalaxyl-M·mancozeb 68% WG y=5.8688x+0.9024 4.99±0.42 c 0.9732 50% 烯酰吗啉 WP dimethomorph 50% WP y=5.4751x−0.0152 8.24±0.55 d 0.9757 75% 百菌清 WP chlorothalonil 75% WP y=4.4420x−0.0497 13.70±2.71 e 0.9494 20% 唑胺菌酯 SC pyrametostrobin 20% SC y=4.2630x−0.1252 15.93±1.89 ef 0.9835 69% 烯酰吗啉·代森锰锌 WP dimethomorph·mancozeb 69% WP y=5.8970x−2.1315 16.19±2.44 ef 0.9768 80% 代森锰锌 WP mancozeb 80% WP y=5.8535x−2.0990 16.32±2.89 ef 0.9748 687.5 g/L 霜霉威盐酸盐·氟吡菌胺 SC
fluopicolide·propamocarb·hydrochloride 687.5 g/L SCy=5.7528x−2.5855 20.82±2.57 fg 0.9653 60% 吡唑醚菌酯·代森联 WG pyraclostrobin·methyram 60% WG y=3.2899x+0.5482 22.55±2.49 g 0.9912 72% 霜脲氰·代森锰锌 WP cymoxanil·mancozeb 72% WP y=4.0173x−0.5693 24.34±2.99 g 0.9404 53.8% 氢氧化铜 WG cupric hydroxide 53.8% WG y=3.2148x−3.4168 415.11±3.77 h 0.9994
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表 4 9种杀菌剂制剂对番茄晚疫病的田间防治效果
Table 4 9 fungicide formulations in controlling tomato late blight in the field
药剂
fungicides施用量/
[mL·(667m2)−1]
application rate3次药后 7 d (2018)
7 d after 3rd spraying (2018)3次药后 7 d (2019)
7 d after 3rd spraying (2019)病叶率/%
rate of
diseased leaves病情指数
disease
index防效/%
control
efficacy病叶率/%
rate of
diseased leaves病情指数
disease
index防效/%
control
efficacy440 g/L 精甲霜灵·百菌清 SC
metalaxyl-M·chlorothalonil 440 g/L SC120 10.19 1.16 88.12 a 6.70 0.78 92.02 a 64% 噁霜灵·代森锰锌 WP
oxadixyl·mancozeb 64% WP200 13.39 1.55 84.10 b 8.31 0.99 89.88 a 68% 精甲霜灵·代森锰锌 WG
metalaxyl-M·mancozeb 68% WG120 11.53 1.61 83.64 b 7.79 1.48 84.86 b 23.4% 双炔酰菌胺 SC
mandipropamid 23.4% SC40 11.76 1.62 83.48 b 10.86 1.82 81.40 b 50% 烯酰吗啉 WP
dimethomorph 50% WP40 13.55 1.90 80.57 bc 11.42 1.82 81.51 b 250 g/L 嘧菌酯 SC
azoxystrobin 250 g/L SC80 17.49 2.41 75.37 c 16.12 2.51 74.38 c 250 g/L 吡唑醚菌酯 EC
pyraclostrobin 250 g/L EC40 18.05 2.89 70.46 d 13.56 2.80 71.43 cd 10% 氰霜唑 SC
cyazofamid 10% SC60 16.41 2.93 70.07 d 15.00 2.89 70.46 d 75% 百菌清 WP
chlorothalonil 75% WP160 20.03 3.60 62.81 e 16.27 3.35 65.68 e 对照 CK — 44.03 9.82 — 42.96 9.80 —
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