水杨酸和茉莉酸甲酯对盐胁迫下月季品种月月粉生理特性的影响
Effects of Exogenous Salicylic Acid and Methyl Jasmonate on the Physiological Characteristics of Rosa chinensis ‘Old Blush’ under Salt Stress
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当前，在家禽养殖中为了降低禽类被病原菌感染的发病率，抗生素被广泛使用。长期使用抗生素容易导致家禽体内抗生素残留和细菌耐药性增强等问题，并通过食物链直接危害人类身体健康[1]。鉴于此，抗生素替代现已成为研究热点。
禽β-防御素(avian β-defensins，AvBDs) 是一类在禽体内广泛分布的内源性阳离子短肽，具有广泛的杀菌活性、细胞毒性和免疫趋化作用。因禽类异噬性细胞缺乏氧化机制，故AvBDs构成的非氧化机制在禽类机体的天然免疫系统中发挥着重要作用[2-4]。AvBDs的抗菌原理[5-6]与抗生素不同，不易产生耐药性；其具有分子量小、热稳定性及水溶性较好、动物采食后不会在体内造成药物残留等优势，被作为绿色饲料添加剂及新型抗菌药物的开发价值也逐渐被关注。AvBDs的制备途径有多种，如从鸡体内提取、化学方法合成、原核表达[7]及真核表达[8]；其中，体内提取和化学合成过程繁杂、效率低且成本高，真核表达产量较少，而原核表达系统因其操作简单、成本低和产量高等优点，被用于生产AvBDs，为解决以上难题提供了一种简易可行的手段。
AvBD6和AvBD9均在鸡的消化道、肝脏、嗉囊和肾脏气管等组织器官大量表达。本研究在前人研究的基础上，用PCR扩增了AvBD6和AvBD9的基因，并将基因连接至pGEX-6P-1载体，对其进行诱导表达，并对其表达产物进行活性分析及安全性检测，为AvBD6和AvBD9的生物活性研究及安全性评价提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试剂材料
DH5α感受态细胞和BL21(DE3)pLysS感受态细胞购自北京擎科新业生物技术有限公司；禽致病性大肠杆菌 AE17、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、表达载体pGEX-6P-1、AvBD6及AvBD9鼠源抗体均由兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)中收录的鸡AvBD6的基因序列(序列号NM_001001193)和鸡AvBD9的基因序列(序列号NM_001001611)，依据大肠杆菌的密码子偏好性对成熟肽基因序列进行优化(表1)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成；根据人工合成的AvBD6和AvBD9优化基因序列以及引物设计原则，利用Primer 5.0分别设计AvBD6的扩增引物P1、P2和AvBD9的扩增引物P3、P4 (表2)，下划线为酶切位点。
表 1 优化后AvBD6和AvBD9成熟肽基因序列Table 1. Optimized AvBD6 and AvBD9 mature peptide gene sequences合成基因
synthetic gene成熟肽基因序列(5'→3')
gene sequenceAvBD6 AGCCCGATTCATGCATGTCGTTATCAGCGTGGTGTTTGTATTCCGGGTCCGTGTCGTTGGCCGTATTATCGTGTTGGTAGCTGTGGTAGCGGTCTGAAAAGCTGTTGTGTTCGTAATCGTTGGGCC AvBD9 GCAGATACCCTGGCATGTCGTCAGAGCCATGGTAGCTGTAGCTTTGTTGCATGTCGTGCACCGAGCGTTGATATTGGTACCTGTCGTGGTGGTAAACTGAAATGTTGTAAATGGGCACCGAGCAGC 表 2 根据 AvBD6和AvBD9成熟肽基因设计引物Table 2. Primers designed according to AvBD6 and AvBD9 mature peptide genes合成基因synthetic gene 引物序列(5'→3')
primer sequence酶切位点
enzyme siteAvBD6 P1：CGCGGATCCAGCCCGATTCATGCATGTC
P2：CCGGAATTCTAAGGCCCAACGATTACGAACABamH I
EcoR IAvBD9 P3：CGCGGATCCGCAGATACCCTGGCATG
P4：CCGGAATTCTAAGCTGCTCGGTGCCCATTBamH I
EcoR I1.2.2 重组表达载体的构建
以AvBD6和AvBD9成熟肽cDNA为模板，用1.2.1节中合成的引物进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用柱式DNA 胶回收试剂盒进行胶回收。用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ[购自宝生物工程(大连)有限公司]分别对目的片段和载体pGEX-6P-1进行双酶切，后经电泳鉴定及胶回收纯化。将胶回收后的目的片段AvBD6 和AvBD9分别与载体pGEX-6P-1按以下体系16 ℃作用12 h：AvBD6 或AvBD9各7.5 μL、载体0.5 μL、T4连接酶和T4 buffer各1 μL。将连接产物分别转化至DH5α感受态细胞，并涂布于有氨苄西林(Amp)抗性的固体LB板，置于37 ℃培养12 h，挑取单克隆进行PCR鉴定，并将阳性菌送至上海生工生物工程技术有限公司测序，测序正确质粒命名为pGEX-6P-1-AvBD6和pGEX-6P-1-AvBD9。
1.2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化
将重组质粒分别转化至表达菌BL21 (DE3)pLysS中，挑取单克隆并鉴定。将阳性克隆接种于含有Amp的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养至OD600达到0.4~0.6 时，加入终浓度为 0.5 mmol/L IPTG，在16 ℃ 条件下诱导表达16 h。将诱导表达后的菌液5000 r/min离心10 min，收集菌体，置于冰上超声破碎(110 HZ超声裂解细菌细胞，工作时间3 s，间歇5 s，超声时间15 min)，10000 r/min离心10 min后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白存在形式。按照GST标签蛋白纯化试剂盒说明书纯化重组蛋白，并用BCA蛋白检测试剂盒测纯化后重组蛋白的含量。
1.2.4 重组蛋白Western-blot验证
纯化后的蛋白经过12.5% SDS-PAGE分离，100 mA、60 min湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h，加入用封闭液1∶500稀释的AvBD6和AvBD9鼠源抗体，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤3次，每次10 min；加1∶2000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，室温下孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，后用ECL显色观察。
1.2.5 重组蛋白对指示菌最低抑菌质量浓度(MIC)的测定
将待测指示菌禽致病性大肠杆菌AE17和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)分别培养至OD600值为1.0，稀释至1×105 CFU/mL。分别将2种蛋白倍比稀释5个质量浓度(300.0、150.0、75.0、37.5和18.8 μg/mL)，后各取50 μL加入96孔板中，每孔中加入150 μL稀释后的菌液。空白组为150 μL LB培养基和50μL的PBS，对照组为150 μL菌液和50 μL PBS。将96孔板放入37 ℃培养箱内静置培养，测量OD600值，每组试验均重复3次并统计分析。
1.2.6 透射电镜观察抑菌效果
纯化后的 AvBD6和AvBD9分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在28 ℃培养箱过夜共培，离心后用PBS洗涤3次，将沉淀样品置于2.5%的戊二醛中固定，再用1%OsO4固定，然后通过脱水、包埋、超薄切片、铀和铝染色制备样品。对照组用PBS代替重组蛋白后做相同处理。对制备的样品使用扫描电镜观察并拍照。
1.2.7 重组蛋白溶血试验
为了验证重组蛋白对鸡血红细胞是否具有溶血性，以期为重组蛋白应用于临床鸡体内试验奠定基础，也为其安全性评价提供参考，本研究进行重组蛋白溶血试验。将新鲜鸡血加入枸橼酸盐溶液中，冰中静置使其分层后取下层鸡血红细胞，用0.9%灭菌生理盐水将鸡血红细胞稀释至2%，并用灭菌生理盐水将3种重组蛋白稀释至终质量浓度为50、150和300 mg/L。每种质量浓度的蛋白各取20 μL分别加入不同的无菌离心管中，用0.9%无菌生理盐水作阴性对照，0.2% Triton-100作为阳性对照；分别向每管加入180 μL稀释的鸡血红细胞。每组设置3个重复，37 ℃孵育1 h，1000 r/min 离心10 min后取上清，测OD560值，每个样品做3个平行测定，并按以下公式计算其溶血率，取平均值。
溶血率=(OD重组蛋白−ODTriton)/(OD生理盐水−ODTriton)×100%。
2. 结果与分析
2.1 AvBD6和AvBD9基因扩增
由图1可知：以AvBD6和AvBD9成熟肽cDNA为模板，均扩增出大小约125 bp的片段，与预期大小相符。
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图 1 鸡AvBD6和AvBD9基因PCR产物电泳检测注：M. DNA分子量标准；1和3. 阴性对照；2. AvBD6 PCR产物；4. AvBD9 PCR产物。Figure 1. Identification of PCR products of chicken AvBD6 and AvBD9 gene by electrophoresisNote: M. DNA molecular weight standard; 1 and 3. negative controls; 2. AvBD6 PCR product; 4. AvBD9 PCR product.2.2 双酶切鉴定
由图2可知：重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，PCR扩增产物与酶切后目的片段大小一致，均约为125 bp。测序结果表明：AvBD6和AvBD9基因均未发生碱基突变或缺失，说明pGEX-6p-1-AvBD6和pGEX-6p-1-AvBD9重组表达质粒构建成功。
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图 2 重组质粒pGEX-6p-1-AvBD6和pGEX-6p-1-AvBD9的双酶切后电泳检测注：M. DNA分子量标准；1. 阴性对照；2. 重组质粒pGEX-6p-1-AvBD6双酶切产物；3. 重组质粒pGEX-6p-1-AvBD9双酶切产物。Figure 2. Electrophoresis detection of recombinant plasmid pGEX-6p-1-AvBD6 and pGEX-6p-1-AvBD9 after double enzyme digestionNote: M. DNA molecular weight standard; 1. negative control; 2. recombinant plasmid pGEX-6p-1-AvBD6 double enzyme products; 3. recombinant plasmid pGEX-6p-1-AvBD9 double enzyme products.2.3 AvBD6和AvBD9融合蛋白的诱导表达及纯化
经SDS-PAGE电泳鉴定，重组质粒pGEX-6P-1-AvBD6和pGEX-6P-1-AvBD9表达的融合蛋白大小约为30 ku，符合预期大小，且2种融合蛋白均以可溶形式表达(图3)。对重组蛋白的上清液纯化，得到纯度较高的目的蛋白(图4)。
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图 3 重组蛋白的SDS-PAGE分析注：M. 蛋白分子质量标准；1和6. 诱导空载体；2. 诱导后的AvBD6表达产物；3. 未诱导的AvBD6表达产物；4. AvBD6 的上清表达产物；5. AvBD6的包涵体表达产物；7. 诱导后的AvBD9表达产物；8. 未诱导的AvBD9表达产物；9. AvBD9的上清表达产物；10. AvBD9的包涵体表达产物。Figure 3. SDS-PAGE analysis of recombinant proteinsNote: M. protein molecular weight standard; 1 and 6. induced empty vector; 2. induced AvBD6 expression product; 3. uninduced AvBD6 expression product; 4. supernatant expression product of AvBD6; 5. inclusion body expression product of AvBD6; 7. induced AvBD9 expression product; 8. uninduced AvBD9 expression product; 9. supernatant expression product of AvBD9; 10. inclusion expression products of AvBD9.![]()
图 4 重组蛋白的纯化结果注：M. 蛋白分子质量标准；1~7. 重组AvBD6第1~7次洗脱后结果；8~13. 重组AvBD9第1~7次洗脱后结果。Figure 4. Recombinant protein purification resultsNote: M. protein molecular weight standard; 1-7. results after 1 to 7 times eluting of recombinant AvBD6; 8-13. results after 1 to 7 times eluting of recombinant AvBD9.2.4 重组蛋白Western-blot验证
Western-blot结果显示：2种重组蛋白均出现特异性条带，而空载体未见反应(图5)。
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图 5 重组蛋白Western-blot分析注：1和3. 空载体；2. pGEX-6p-1-AvBD6重组菌的表达；4. pGEX-6p-1-AvBD9重组菌的表达。Figure 5. Western-blot analysis of recombinant proteinNote: 1 and 3. empty vector; 2. expression of pGEX-6p-1-AvBD6 recombinant bacteria; 4. expression of pGEX-6p-1-AvBD9 recombinant bacteria.2.5 重组蛋白对多种指示菌最低抑菌质量浓度(MIC)的测定
由图6可知：重组蛋白AvBD6和AvBD9均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。与阳性对照相比，重组蛋白AvBD6和AvBD9质量浓度为150.0 mg/L时，对指示菌大肠杆菌具有明显的抑制作用；当质量浓度为75.0 mg/L时，对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。
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图 6 最小抑菌质量浓度测定注：a)和b) 重组AvBD6分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性；c)和d) 重组AvBD9分别对大肠和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。Figure 6. Determination of the minimum inhibitory mass concentrationNote: a) and b) antibacterial activity of recombinant AvBD6 against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively; c) and d) antibacterial activity of recombinant AvBD9 against E. coli and S. aureus, respectively.2.6 抑菌效果的电镜观察
透射电镜观察(图7)发现：对照组的菌体完整，外观饱满圆润，表面光滑平直，未见菌体细胞膜穿破皱缩以及内容物外泄的现象；试验组的菌体出现了明显的皱缩且伴有细胞壁表面凹陷及内容物外泄等明显症状。说明2种重组蛋白都能破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体的完整性，从而直观地表现出其具有明显的杀菌效果。
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图 7 透射电镜观察抑菌结果注：a) 对照组大肠杆菌菌体形态；b) AvBD6与大肠杆菌共培养后的菌体形态；c) AvBD9与大肠杆菌共培养后的菌体形态；d) 对照组金黄色葡萄球菌菌体形态；e) AvBD6与金黄色葡萄球菌共培养后的菌体形态；f) AvBD9与金黄色葡萄球菌共培养后的菌体形态。Figure 7. Transmission electron microscope observation of the bacteriostasisNote: a) morphology of E. coli in control group; b) morphology of E. coli after co-culture of AvBD6; c) morphology of E. coli after co-culture of AvBD9; d) morphology of S. aureus in control group; e) morphology of S. aureus after co-culture of AvBD6; f) morphology of S. aureus after co-culture of AvBD9.2.7 重组蛋白溶血试验
由图8、9可知：重组AvBD 6和AvBD 9在50、150和300 mg/L下均未引起鸡红细胞破裂溶解的现象，而阴性对照组出现明显的红细胞溶解现象，说明2种重组蛋白的溶血活性极低。
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图 8 重组蛋白溶血试验结果注：1~3. AvBD6 50、150和300 mg/L；4~6. AvBD9 50、150和300 mg/L；7. 0.9%生理盐水；8. Triton-100。Figure 8. Results of the recombinant protein hemolysis testNote: 1-3. AvBD6 50, 150, 300 mg/L; 4-6. AvBD9 50, 150, 300 mg/L; 7. normal saline (0.9% NaCl); 8. Triton-100.3. 讨论
禽β-防御素在体内分布广泛，是鸡体抵御外界病原微生物入侵的第一道屏障，在机体的先天免疫防御系统中发挥着十分重要的作用[9-11]。随着养禽业中抗生素的滥用，导致病菌耐药性增加，人们开始迫切的寻求一种新的有效的绿色抗生素替代品。禽β-防御素因其自身具有广谱抑菌、抗病毒、不易产生耐药、参与机体重要的免疫调节和无毒副作用等众多优势使其有望成为一种新型高效的绿色添加剂。研究表明：禽β-防御素具有很强的杀菌活性[12-13]，然而防御素分子质量很小，且在机体内含量非常少，分离提纯困难，因此化学合成和基因工程技术成为主要获得手段[14]。但化学合成成本高，不利于大量生产，所以基因工程方法相较而言更具有优势。目前已经有很多禽β-防御素通过原核表达系统大量表达的研究[15-17]。韩宗玺等[18]对AvBD6进行诱导表达，但大部分重组蛋白存在于包涵体中；许兰娇等[7]和冯培祥等[19]分别对AvBD9的研究也发现其主要表达于包涵体中，本研究的AvBD6和AvBD9均在上清表达，比前人研究更具优势。
本研究按照大肠杆菌密码子偏好性，对AvBD6和AvBD9成熟肽基因序列进行了优化，后续采用原核表达载体pGEX-6P-1对禽AvBD6和AvBD9进行重组表达。由于防御素对宿主菌具有毒害作用，故本研究选择BL21(DE3)pLysS 感受态细胞为其宿主菌株。BL21(DE3)pLysS感受态细胞携带pLysS质粒，pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可以更为严谨控制T7聚合酶的表达。T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，降低T7启动子后面的目的基因的表达背景，但是不影响IPTG诱导产生的蛋白表达水平，适合表达毒性蛋白。由于受宿主菌的影响，温度对于目的蛋白的表达具有重要影响[20]，摸索温度条件后采用低温、低转速和低浓度的IPTG对2种重组蛋白诱导；其中，AvBD6在上清液具有一定的表达，AvBD9全部表达于上清液中。后续抑菌试验证明2种重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有良好的抑菌效果，重组蛋白AvBD6和AvBD9对指示菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度均分别为150.0和75.0 mg/L。本研究在透射电镜下可直观地看到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体被重组蛋白破坏，更加佐证了防御素的杀菌效果，但其杀菌机理还有待后续研究。
当前养殖业面临的抗生素滥用问题突出，不仅导致耐药菌产生，而且畜产品抗生素的残留会经过食物链影响人类的生命健康。鉴于此，动物性食品安全是事关公共健康的重大问题，减少抗生素使用，降低畜禽药物残留有利于提高食品安全水平。自2020年起，中国正式开始全面实行“禁抗、限抗、无抗”政策，因此，寻求绿色有效的抗生素替代品，已成为目前畜禽生产经营者和科学研究工作者共同关注的热点问题。本研究结果为抗生素替代的研究提供了数据支撑，为防御素的抗菌机理研究和绿色健康养殖的拓展奠定了基础。
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图 1 不同处理下月月粉的生长状态
注：CK. 对照；S. 盐处理；SA. 水杨酸处理；MeJA. 茉莉酸甲酯处理；S+SA. 盐与水杨酸共处理；S+MeJA. 盐与茉莉酸甲酯共处理；下同。
Figure 1. The growth status of ‘Old Blush’ with different treatments
Note: CK. control; S. salt stress; SA. salicylic acid treatment; MeJA. methyl jasmonate treatment; S+SA. salt stress and salicylic acid treatment; S+MeJA. salt stress and methyl jasmonate treatment; the same as below.
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图 2 不同处理下月月粉不同组织抗氧化酶活性(鲜重)
注：柱形图上方不同小写字母表示相同组织不同处理间差异显著(P<0.05)。
Figure 2. Activity of antioxidant enzymes (FW) in different tissues of ‘Old Blush’ under different treatments
Note: Different lowercase letters at the top of the bar charts indicate significant difference among treatments in the same tissue at P<0.05.
表 1 不同处理下月月粉叶片叶绿素含量 (鲜重)
Table 1 Chlorophyll content (fresh weight, FW) of leaves in ‘Old Blush’ under different treatments
mg/g 处理
treatment叶绿素a含量
chlorophyll a content叶绿素b含量
chlorophyll b content总叶绿素含量
total chlorophyll contentCK 7.81±0.03 d 6.38±0.05 d 14.19±0.03 d S 3.92±0.02 f 3.70±0.03 f 7.62±0.03 f SA 17.14±0.03 b 10.25±0.03 b 27.39±0.03 b MeJA 18.49±0.03 a 10.82±0.06 a 29.31±0.06 a S+SA 9.27±0.02 c 5.82±0.04 e 15.09±0.02 c S+MeJA 7.06±0.02 e 6.66±0.04 c 13.72±0.04 e 注：CK. 对照；S. 盐处理；SA. 水杨酸处理；MeJA. 茉莉酸甲酯处理；S+SA. 盐与水杨酸共处理；S+MeJA. 盐与茉莉酸甲酯共处理；同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，所有数据均为均值±标准差；下同。
Note: CK. control; S. salt stress; SA. salicylic acid treatment; MeJA. methyl jasmonate treatment; S+SA. salt stress and salicylic acid treatment; S+MeJA. salt stress and methyl jasmonate treatment; data within the same column followed by no same letters indicate significant difference between treatments at P<0.05, the data is mean±SD; the same as below.
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表 2 不同处理下月月粉不同组织脯氨酸含量 (鲜重)
Table 2 The contents of proline (FW) in different tissues of ‘Old Blush’ under different treatments
μg/g 处理组
treatment叶片脯氨酸含量
proline content
in leaves根系脯氨酸含量
proline content
in rootsCK 18.97±0.38 e 18.82±0.39 f S 32.24±0.65 d 31.05±0.28 e SA 73.53±0.56 a 53.50±0.64 c MeJA 75.35±0.95 a 69.14±0.49 a S+SA 50.69±0.59 b 48.67±0.60 d S+MeJA 48.27±0.73 c 58.78±0.46 b
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表 3 不同处理下月月粉不同组织丙二醛含量(鲜重)
Table 3 The contents of malondialdehyde (FW) in different tissues of ‘Old Blush’ under different treatments
μg/g 处理组
treatment叶片丙二醛含量
MDA content
in leaves根系丙二醛含量
MDA content
in rootsCK 63.35±3.44 c 5.68±0.12 c S 90.25±1.98 a 25.58±1.44 a SA 42.88±2.51 d 5.62±0.66 c MeJA 60.19±1.28 c 8.63±0.78 c S+SA 63.25±2.27 c 18.26±0.22 b S+MeJA 75.10±2.76 b 20.33±1.02 b
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