施用有机肥对烤烟根际土壤细菌群落多样性的影响
Effect of Organic Fertilizer Application on Bacterial Community Diversity in Rhizosphere Soil of Flue-cured Tobacco
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金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种常见的条件性致病菌，它广泛地存在于人和动物体内[1]。当宿主的非特异性免疫系统出现缺陷时，金葡菌可以感染宿主，引起多种疾病，给人和动物的健康造成严重的威胁[2]。其中最典型的疾病就是金葡菌肺炎，具有高发病率、高致死率的特点。目前常采用抗生素治疗金葡菌肺炎，但是抗生素在使用过程中会对金葡菌的生长造成巨大的选择性压力，使菌群中耐药菌的比例上升，甚至出现多重耐药株，使得临床治疗效果下降甚至无效。因此，我们迫切需要新的药物或治疗策略来防治细菌感染尤其是耐药菌的感染。
抗毒力因子治疗策略是抑制细菌毒力因子的表达或其活性的一种治疗策略[3]。这些毒力因子通常是细菌生长的非必需蛋白，以此为目标进行特异性干预，不会对细菌的生存带来选择性压力，因而不易产生耐药性而受到广泛关注[4]。α-溶血素(Hla)是金葡菌的一种重要的毒力因子，在金葡菌感染肺部的过程中起着关键性作用[5-7]。因此，Hla可以作为一种新的抗金葡菌肺炎的潜在靶标[8]。
百里香酚(thymol)又名麝香草酚，是一种主要从唇形科植物中提取的单萜酚，为伞花烃的衍生物，与香芹酚互为同分异构体。百里香酚具有多种药理活性，如抗氧化[9]、抗寄生虫[10]、抗菌[11]、调节免疫[12]和促生长等[13]。我们通过体外溶血实验模型筛选药物时，发现百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用。本研究首先进行MIC和生长曲线的测定，然后通过蛋白免疫印迹和荧光定量PCR试验来探讨百里香酚对金葡菌Hla的作用机制，再通过细胞毒性试验研究百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549损伤的保护作用，为百里香酚治疗金葡菌肺炎提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和细胞株
金葡菌菌株USA300和人肺癌上皮细胞A549(ATCC CCL 185)购于美国模式培养物集存库(ATCC)。
1.1.2 主要试剂
百里香酚(HPLC 98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；TSB培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)；α-溶血素多克隆抗体和溶葡萄球菌素(Sigma公司)；羊抗兔二抗(Solarbio公司)；PVDF膜(Pall公司)；Super ECL Plus超敏发光液(Thermo fisher公司)；Qiagen RNeasy Maxi column (Qiagen公司)；反转录试剂Takara RNA PCR kit(AMV) Ver.3.0和荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex Taq TM (Takara公司)；Cytotoxicity Detection Kit (LDH，Roche公司)；live/dead (green/red) reagent(Invitrogen公司)。
1.2 方法
1.2.1 百里香酚对金葡菌最小抑菌质量浓度(MIC)的测定
按照临床与实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的倍比稀释法测定百里香酚对金葡菌的最小抑菌质量浓度，苯唑西林作为对照组。
1.2.2 百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌USA300的生长曲线的测定
将金葡菌USA300过夜培养后，进行扩大培养，待金葡菌生长到OD600 nm=0.3时，加入不同量的百里香酚使其质量浓度分别达到0、4、8、16和32 μg/mL，隔一段时间测定菌液OD600 nm值。
1.2.3 百里香酚对金葡菌上清液溶血能力的影响
将金葡菌培养至OD600 nm=0.3，加入百里香酚使其质量浓度分别达到0、4、8、16和32 μg/mL，培养至稳定期，离心(4 500 r/min，5 min)取菌上清100 μL，加入到880 μL PBS中，再加入20 μL脱纤维兔血，混匀，37 ℃培养30 min，离心(4 500 r/min，2 min)取上清，在543 nm波长处测定吸光值，以不加药组为100%溶血。
1.2.4 蛋白免疫印迹分析
取1.2.3节中稳定期菌液，离心吸取细菌上清液80 μL与20 μL 5×Loading buffer混匀，100 ℃处理5 min，进行SDS-PAGE后，将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，与α-溶血素抗体(1∶5 000)孵育，4 ℃过夜，TBST洗涤3次每次5 min，再用HRP标记的二抗(1∶8 000)孵育1 h，再用TBST洗涤3次，加ECL暗室孵育2 min后，用全功能成像仪进行成像。
1.2.5 荧光定量PCR试验
取1.2.3节中稳定期的菌液，参照SAMBANTHAMOORTHY等[14]的方法提取总RNA。离心(4 500 r/min，5 min，4 ℃)，弃去上清液，收集菌体，重悬于含100 μg/mL 溶葡萄球菌酶的TES缓冲液中，37 ℃静置10 min。于波长为260 nm处测样品的吸光值，检查RNA的质量、完整性和浓度。按照试剂盒说明书，将RNA反转录成为cDNA。荧光定量PCR所用引物见表1。在Real-Time PCR扩增仪中进行扩增。反应体系为25 μL，循环参数为：95 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环。采用ΔΔCt法分析基因的相对表达水平。
表 1 荧光定量PCR引物Table 1. Primers used for real-time RT-PCR基因gene 引物primers 序列sequences 16S rRNA 16S rRNA sense 5′-GCTGCCCTTTGTATTGTC-3′ 16S rRNA antisense 5′-AGATGTTGGGTTAAGTCCC-3′ hla hla sense 5′-TTGGTGCAAATGTTTC-3′ hla antisense 5′-TCACTTTCCAGCCTACT-3′ RNAIII RNAIII sense 5′-TTCACTGTGTCGATAATCCA-3′ RNAIII antisense 5′-CGGAAGGAGTGATTTCAATGG-3′ 1.2.6 细胞毒性试验
参照文献[14]的方法培养人肺癌上皮癌细胞A549，用无菌PBS缓冲液冲洗涤细胞3次，然后用培养基调整细胞密度为2.0×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，37 ℃培养12~24 h。移除细胞培养基，然后加入含有不同浓度百里香酚的USA300细菌混悬液(USA300混悬于无双抗的DMEM培养基中)，每孔100 μL，37 ℃培养6 h。Live/Dead试验：按照说明书加入Live/Dead试剂将细胞染色，再使用激光共聚焦显微镜进行染色并拍照。LDH试验：按照说明书加入Cytotoxicity Detection Kit试剂进行孵育，在波长为490 nm处检测吸光值，计算LDH的释放量。
1.2.7 统计分析
每个试验均单独重复3次，数据以“mean±SD”表示；用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间进行Student’s t-test检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 百里香酚对金葡菌的抗菌活性
百里香酚和苯唑西林对金葡菌USA300的MIC分别为256 μg/mL和64 μg/mL，表明百里香酚对耐药性金葡菌有一定的抗菌活性。
2.2 百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌USA300生长的影响
在金葡菌USA300和百里香酚共培养体系中，百里香酚的质量浓度分别为0、4、8、16和32 μg/mL，并测试了对金葡菌生长的影响。结果表明：百里香酚在这些质量浓度下对金葡菌USA300的生长没有影响(图1)。
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图 1 不同质量浓度的百里香酚对金葡菌USA300的生长曲线Figure 1. Growth curve for S. aureus USA300 cultured under different mass concentrations of thymol2.3 百里香酚对金葡菌Hla的影响
金葡菌USA300在稳定期能够产生Hla并分泌至培养液中，Hla对兔红细胞敏感，从而发生溶血现象。若细菌培养液的溶血能力下降，则说明Hla的含量减少或者生物活性受到抑制。本试验以不加百里香酚组的溶血能力为100%，当百里香酚质量浓度为16 μg/mL和32 μg/mL时，溶血能力分别下降至51.9%±3.7%和34.8%±2.6%，差异极显著(P<0.01)(图2a)。接着通过蛋白免疫印迹试验考察溶血能力下降的原因，结果显示：随着百里香酚质量浓度的增加，Hla蛋白条带的颜色明显减弱，说明Hla的含量减少(图2b)。Hla的编码基因为hla，RNAⅢ的转录与Hla表达呈正相关关系。RT-PCR结果表明：不同质量浓度的百里香酚对USA300的hla和RNAⅢ的转录水平与蛋白免疫印迹的结果基本一致，随着药物质量浓度的增加，hla和RNAⅢ的转录水平都降低。当百里香酚质量浓度为32 μg/mL时，与对照组相比hla和RNAⅢ的转录水平分别下降至5.5%±3.0%和10.5%±2.1%，差异极显著(P<0.01)(图2c)。
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图 2 百里香酚对金葡菌Hla的影响注：a)不同质量浓度百里香酚与金葡菌培养上清液对兔红细胞的溶血作用；b)不同质量浓度百里香酚对金葡菌USA300 Hla表达影响的免疫印迹结果；c)不同浓度的百里香酚对金葡菌USA300的hla和RNAⅢ相对基因表达量的影响。*. P<0.05，**. P<0.01；下同。Figure 2. The effects of thymol on S. aureus HlaNote: a) hemolytic activity of S. aureus culture supernatants grown in the presence of increasing mass concentrations of thymol; b) Western blot of α-hemolysin produced by S. aureus USA300 co-cultured with different mass concentrations of thymol; c) relative expression of hla and RNAIII in S. aureus strain USA300 after growth with various mass concentrations of thymol. *. P<0.05 and **. P<0.01; the same as below.2.4 百里香酚对金葡菌USA300 α-溶血素介导的人肺癌上皮细胞A549损伤的保护作用
通过Live/Dead试剂盒染色，在激光共聚焦显微镜下可观察到绿色荧光的为活细胞，红色荧光的为死细胞。试验结果表明：百里香酚可以提高由金葡菌Hla介导的A549细胞损伤的保护率(图3a~d)，随着百里香酚质量浓度的增加，死细胞数量减少，活细胞数量增加。
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图 3 不同质量浓度百里香酚对金葡菌USA300介导的A549细胞损伤的保护作用注：a)未处理组；b)感染金葡菌USA300 组；c)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其质量浓度为8 μg/mL；d)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其质量浓度32 μg/mL；e)加入不同质量浓度百里香酚的金葡菌USA300与A549共培养体系的LDH释放率。Figure 3. Thymol alleviates A549 cell injury caused by S. aureus strain USA300Note: a) Uninfected A549 cells; b) A549 cells infected by USA300 without thymol; c) A549 cells infected by USA300 with 8 μg/mL thymol; d) A549 cells infected by USA300 with 32 μg/mL thymol; e) LDH release level in cultural medium co-cultured with USA300 and different mass concentrations of thymol (40μm).乳酸脱氢酶(LDH)是胞内酶，在细胞坏死破裂后释放到细胞外。本研究通过检测细胞培养基上清液中LDH的释放量，定量分析百里香酚对α-溶血素介导的A549细胞的保护作用。随着百里香酚质量浓度的增加，LDH的释放量降低，在质量浓度为4、8、16和32 μg/mL时LDH的释放量分别为80.8%±4.8%、43.3%±5.0%、26.8%±4.0%和4.8%±2.5% (图3e)。以上结果说明百里香酚具有保护金葡菌Hla介导的A549细胞损伤的作用，且与药物质量浓度呈正相关关系。
3. 讨论
α-溶血素(Hla)是细菌生长后期所分泌的一种外毒素，大小约为33 ku，多种细胞(红细胞、单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞)的细胞膜对Hla敏感。Hla可在敏感细胞的细胞膜上形成中空的七聚体圆柱体，贯穿细胞膜形成孔道，破坏其完整性，从而破坏细胞内物质的平衡，最终导致细胞裂解引起多种疾病。已有文献报道Hla在金葡菌肺炎的致病过程中起非常关键性的作用[5-7]。因此，可将Hla作为抗金葡菌肺炎的新靶点。众所周知，传统的抗生素主要是通过阻碍细菌的生长和增殖达到抗菌效果，如抑制细胞壁的合成、破坏细胞膜、阻断DNA复制、干扰细菌代谢以及抑制蛋白质的合成等。传统抗生素能有效地治疗细菌感染，但是其对细菌产生选择性压力，使细菌产生耐药性[15]。使用抗生素治疗金葡菌感染极易产生耐药性。而Hla是细菌生长的非必需物质，抑制其表达或者生物活性不会给细菌的生长造成选择性压力，因而不易产生耐药性，在抗生素耐药性如此严重的今天具有重要意义。
本研究中，百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌的生长没有影响，但是却能通过下调hla和RNAIII的转录水平使Hla的表达量下降，是一种潜在的抗Hla的药物。目前抗Hla药物还处于试验研究阶段，抗生素仍然是治疗金葡菌肺炎的主流。可以考虑与抗生素联用增加效果，这一联用思路主要是抗生素抑菌或者杀菌，抗Hla药物抑制Hla可能会有更好的效果。另外，某些抗生素(如β-内酰胺和氟喹诺酮类抗生素)在亚抑菌浓度下会增加Hla的表达，该类抗生素与抗Hla药物联用后可以弥补抗生素的不足[16-17]。Hla的表达量增加还会增加其他细菌(尤其是革兰阴性菌)的生长繁殖，加重肺炎感染的症状[18]。因此，抗生素与抗Hla药物联用在未来是一个非常受关注的热点。
4. 结论
百里香酚通过下调金葡菌的hla和RNAIII的转录水平降低Hla的表达，并对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549的损伤具有保护作用，这提示抑制Hla的表达对治疗金葡菌肺炎具有潜在的效果，至于效果如何还有待进一步研究。本研究尚未对百里香酚的安全性进行评价，这将是接下来要研究的内容。USA300菌株为MRSA菌株，本研究结果发现百里香酚对该菌株也有抑菌效果，但对其他耐药菌株是否同样有效果还需进一步研究。百里香酚与β-内酰胺和氟喹诺酮类抗生素联用增加治疗效果还有待于深入研究。
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图 1 烤烟根际土壤细菌OTUs丰度稀释曲线
Figure 1. Dilution curve of bacteria OTUs abundance in flue-cured tobacco rhizosphere soil
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图 2 烤烟根际土壤细菌OTUs分布韦恩图
Figure 2. Venn graph of bacteria OTUs distribution in rhizosphere soil of flue-cured tobacco
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图 3 施用有机肥对烤烟根际土壤优势细菌门结构组成和相对丰度的影响
Figure 3. Effects of organic fertilizer application on the composition and relative abundance of dominant bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco at phylum level
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图 4 各处理烤烟根际土壤细菌群落在门水平上的PCA分析
Figure 4. PCA analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level
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图 5 各处理烤烟根际土壤细菌群落在门水平上的UPGMA聚类分析
Figure 5. UPGMA cluster analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level
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图 6 基于FAPROTAX工具的细菌群落功能预测结果
注：各行不同颜色代表功能细菌群落相对丰度，颜色越深代表相对丰度越大。
Figure 6. Prediction results of bacterial community function based on FAPROTAX
Note: The different colors represent the relative abundance of functional bacterial community; the darker the color, the greater the relative abundance.
表 1 烤烟根际土壤样品测序结果
Table 1 Sequencing results of flue-cured tobacco rhizosphere soil samples
处理
treatment原始序列数
raw reads有效序列数
clean reads有效序列占比/%
percentage of clean readsOTUs数量
OTUs numberOTUs包含的序列数
number of reads contained in OTUsCK 82529 80229 97.21 3394 71491 T1 82659 80177 97.00 3676 71595 T2 83298 80117 96.18 3882 69998 T3 102813 99828 97.10 3871 88314 
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表 2 施用有机肥对烤烟根际土壤细菌群落α多样性指数的影响
Table 2 Effects of organic fertilizer application on the α diversity index of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco
处理
treatmentShannon指数
Shannon indexChao 1指数
Chao 1 indexACE指数
ACE index样品文库
覆盖率/%
goods coverageCK 8.97 2832.83 2882.28 99.69 T1 9.01 3095.52 3142.34 99.67 T2 9.36 3351.69 3400.04 99.81 T3 9.21 3235.45 3300.91 99.66
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表 3 施用有机肥对烤烟根际土壤优势细菌相对丰度的影响
Table 3 Effects of organic fertilizer application on the relative abundance of dominant bacteria in flue-cured tobacco rhizosphere soil
% 处理
treatments变形菌门
Proteobacteria
鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas放线菌门
Actinobacteria
其他属
other genus拟杆菌门
Bacteroidetes
黄色土源菌属
Flavisolibacter酸杆菌门
Acidobacteria
Bryobacter芽单胞菌门
Gemmatimonadetes
芽单胞菌属
GemmatimonasCK 14.87 4.00 0.84 0.69 1.27 T1 20.60 2.35 1.38 0.92 2.30 T2 19.11 1.71 1.20 0.70 1.88 T3 20.39 1.53 1.30 0.82 2.13
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