土壤细菌是土壤微生物区系的重要组成部分，在土壤中参与有机质分解、腐殖质形成及养分循环过程，是土壤物质转化的驱动力，其多样性和丰富度是衡量土壤健康状况及肥力水平的生物指标之一^[1-2]。但目前烤烟生产上随着复种指数的增加及化肥的长期施用，土壤环境发生了巨大变化，有机质含量逐渐降低，供肥能力逐渐减弱，有益微生物减少，限制了烟叶质量的提升^[3]。研究表明：6年定位施用化肥植烟土壤有机质含量较原始土壤下降6.09%^[4]；12年定位施用化肥植烟土壤自生固氮菌和无机磷细菌数量分别较不施肥土壤降低56.69%和41.30%^[5]；16年定位施用化肥植烟土壤有机质含量下降20.56%，真菌种群数量增加，病原微生物相对占比增大^[6]。可见，长期单施化肥不利于土壤的可持续利用和培肥土壤。改变施肥模式，增加有机肥的施用可对土壤微生物产生重要影响^[7]。前人通过平板计数法、Biolog法和高通量测序技术对植烟土壤微生物的研究表明：施用有机肥较单施化肥可提高植烟土壤中的细菌多样性和丰富度^[8]，提高烤烟根际土壤细菌数量和微生物总量^[9]，增加土壤中氮素转化相关微生物数量^[10]，提高碳源利用能力^[11]。针对连作植烟土壤，施用有机肥也可提高细菌多样性、丰度及进化距离指数，促进细菌群落进化^[12]。因此，研究施用有机肥对土壤微生物变化的影响，对科学施肥、改善烟区土壤状况及烟区的可持续发展具有重要意义。

不同种类的有机肥对土壤微生物的作用存在一定差异。赵文超^[13]对6种有机肥的研究表明：不同有机肥处理土壤细菌种群结构相似度为73.45%，但不同处理间在信号转导、碳素循环及代谢等方面仍存在差异。施娴等^[14]对4种有机肥的研究表明：施用有机肥可增加土壤微生物数量，但不同有机肥处理间表现不同。因此，本研究以玉溪烟区3种组分差异较大的常用商品有机肥为材料，利用IonS5^TMXL高通量测序平台研究施用不同有机肥对烤烟根际土壤细菌群落多样性的影响，并对其进行功能预测分析，为烟区土壤改良修复及可持续发展提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   试验地概况及试验材料

试验于2018年4—9月在云南省玉溪市峨山县塔甸镇瓦哨宗村(N24.28°，E102.11°)进行，土壤类型为红壤，前作为油菜，土壤理化性质为：pH 6.5，有机质含量33.26 g/kg，全氮含量1.85 g/kg，碱解氮含量114.52 mg/kg，有效磷含量43.27 mg/kg，速效钾含量231.46 mg/kg。供试烤烟品种为K326。

1.2   试验方法

试验共设置4个处理，(1) CK：烟草专用复合肥[m(N)∶m(P)∶m(K)=12∶6∶24] 600 kg/hm²；(2) T₁处理：CK+烟草专用有机肥1.5 t/hm² (pH 6.3，有机质含量55.04%，全氮含量1.67%，C/N=19.12，成分主要为菜籽粕、作物秸秆和腐殖酸等)；(3) T₂处理：CK+生物有机肥1.5 t/hm² (pH 7.1，有机质含量90.8%，全氮含量0.90%，C/N=58.52，成分主要为腐殖酸和生物菌等)；(4) T₃处理：CK+精制有机肥1.5 t/hm² (pH 7.42，有机质含量89.71%，全氮含量2.96%，C/N=17.58，成分主要为菜叶渣和油枯等)。各有机肥均为商品有机肥。试验采用完全随机区组设计，3次重复，每个小区面积55.56 m²，烤烟种植行株距为120×50 cm，2018年4月26日开始移栽，9月10日采收结束。施肥方式为基肥：30%烟草专用复合肥加全部有机肥在烤烟移栽时拌塘施用；追肥：70%复合肥在移栽后30 d内分2次追施。其他生产技术措施按照烤烟常规栽培技术操作。

1.3   土壤样品采集

根际土壤样品于烤烟移栽后55 d利用抖土法^[15]采集。每个小区按五点取样法采集土壤样品，将各处理不同重复土壤样品混匀后进行四分法留取，将得到的4个处理样本放入−80 ℃超低温冰箱冷冻保存，待测。

1.4   测定方法

1.4.1   土壤微生物基因组DNA的提取

用MO-BIO PowerSoil^®DNA Isolation Kit对各处理土壤样品微生物基因组DNA进行提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和含量，用无菌水稀释至1 ng/μL。

1.4.2   PCR扩增及测序

将带标签序列的16S rDNA V4区特异引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACＨVGGGTWTCTAAT-3′用Phusion^®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer进行PCR，将PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用GeneJET凝胶回收试剂盒回收PCR产物。构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher公司的Ion S5^TMXL测序平台进行上机测序。该过程由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.4.3   数据处理

将截去标签序列和引物序列初步质控得到的原始序列通过UCHIME软件^[16]与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并去除其中的嵌合体序列^[17]，得到最终的有效序列。利用Uparse软件^[18]以97%的一致性将所有样品的全部有效序列聚类成为OTUs。用Mothur方法^[19]与SILVA的SSUrRNA数据库^[20]进行物种注释分析，以样品中数据量最少的样本为标准，对各样品数据均一化处理后进行后续数据分析。使用Qiime V1.9.1计算细菌群落α多样性指数和unifrac距离(分析细菌群落β多样性)，并构建UPGMA样品聚类树。α多样性指数中，Shannon指数为菌群多样性指数，Chao 1指数和ACE指数为菌群丰度指数，指数值越大表示细菌群落多样性越高、种类越丰富。使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线、PCA图(分析细菌群落β多样性)和韦恩图。使用FAPROTAX^[21]工具进行细菌群落功能预测。

2.   结果与分析

2.1   测序质量

由表1可知：4个处理样本测序后经初步质控得到的原始序列数为351299条，去除嵌合体后得到的有效序列数为340351条，占原始序列数的96.88%，按97%一致性共聚类为5655个OTUs，注释到3界37门50纲114目211科500属(含未明确细菌)。由图1可知：随着测序数量的不断增加，细菌OTUs丰度的稀释曲线斜率逐渐减小后趋于平坦，表明测序数据量合理，能够反映出不同处理烤烟根际土壤细菌群落结构组成，而更多的数据量只会产生少量新的物种。

表  1  烤烟根际土壤样品测序结果

Table  1.  Sequencing results of flue-cured tobacco rhizosphere soil samples

处理 treatment	原始序列数 raw reads	有效序列数 clean reads	有效序列占比/% percentage of clean reads	OTUs数量 OTUs number	OTUs包含的序列数 number of reads contained in OTUs
CK	82529	80229	97.21	3394	71491
T1	82659	80177	97.00	3676	71595
T2	83298	80117	96.18	3882	69998
T3	102813	99828	97.10	3871	88314

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  1  烤烟根际土壤细菌OTUs丰度稀释曲线

Figure  1.  Dilution curve of bacteria OTUs abundance in flue-cured tobacco rhizosphere soil

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   细菌群落α多样性分析

由表2可知：测序深度指数样品文库覆盖率为99.66%~99.81%，表明制备文库覆盖了烤烟根际土壤样品中99.66%以上的细菌类群，库存容量足够反映样品中细菌群落的真实组成。各处理细菌Shannon指数、Chao 1指数和ACE指数排序均为T₂>T₃>T₁>CK，表明增施有机肥均有利于提高烤烟根际土壤细菌群落多样性和丰富度。

表  2  施用有机肥对烤烟根际土壤细菌群落α多样性指数的影响

Table  2.  Effects of organic fertilizer application on the α diversity index of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco

处理 treatment	Shannon指数 Shannon index		Chao 1指数 Chao 1 index	ACE指数 ACE index		样品文库 覆盖率/% goods coverage
CK	8.97		2832.83	2882.28		99.69
T1	9.01		3095.52	3142.34		99.67
T2	9.36		3351.69	3400.04		99.81
T3	9.21		3235.45	3300.91		99.66

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   细菌OTUs分布

由图2可知：CK、T₁、T₂和T₃处理烤烟根际土壤样本中共有的细菌OTUs数为1 716，每个处理均有数量不等的其他样品没有出现的OTUs，各处理按特有OTUs数量排序为T₂>T₃>T₁>CK。可见，施用有机肥可提高烤烟根际土壤特有细菌菌种数量。

图  2  烤烟根际土壤细菌OTUs分布韦恩图

Figure  2.  Venn graph of bacteria OTUs distribution in rhizosphere soil of flue-cured tobacco

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   细菌群落结构组成及相对丰度

对不同处理根际土壤中优势细菌门相对丰度的分析(图3)表明：各处理根际土壤中相对丰度排名前10的优势细菌门分别为：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、未明确细菌、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和厚壁菌门(Firmicutes)，总相对丰度达到95.12%~96.46%。各有机肥处理变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和浮霉菌门相对丰度较CK均有所增加，但放线菌门的相对丰度有所下降，其中T₁和T₂处理酸杆菌门、绿弯菌门及浮霉菌门相对丰度均高于T₃处理，T₃处理变形菌门相对更为丰富，芽单胞菌门相对丰度以T₁处理最高。

图  3  施用有机肥对烤烟根际土壤优势细菌门结构组成和相对丰度的影响

Figure  3.  Effects of organic fertilizer application on the composition and relative abundance of dominant bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco at phylum level

下载: 全尺寸图片 幻灯片

对排名前5的优势细菌门中包含序列数最多的OTUs所代表的细菌属相对丰度进行对比分析。结果(表3)表明：T₁、T₂与T₃处理烤烟根际土壤中变形菌门鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、拟杆菌门黄色土源菌属(Flavisolibacter)、酸杆菌门Bryobacter、芽单胞菌门芽单胞菌属(Gemmatimonas)的相对丰度较CK均有所增加，且以T₁处理最高，但放线菌门未明确细菌属的相对丰度均低于CK。

表  3  施用有机肥对烤烟根际土壤优势细菌相对丰度的影响

Table  3.  Effects of organic fertilizer application on the relative abundance of dominant bacteria in flue-cured tobacco rhizosphere soil %

处理 treatments	变形菌门 Proteobacteria 鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas	放线菌门 Actinobacteria 其他属 other genus	拟杆菌门 Bacteroidetes 黄色土源菌属 Flavisolibacter	酸杆菌门 Acidobacteria Bryobacter	芽单胞菌门 Gemmatimonadetes 芽单胞菌属 Gemmatimonas
CK	14.87	4.00	0.84	0.69	1.27
T1	20.60	2.35	1.38	0.92	2.30
T2	19.11	1.71	1.20	0.70	1.88
T3	20.39	1.53	1.30	0.82	2.13

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.5   细菌群落β多样性分析

PCA结果(图4)表明：第1主成分(PC1)可以解释47.15%的细菌群落组成成分，第2主成分(PC2)可以解释29.05%的细菌群落组成成分，合计解释度为76.20%。施用有机肥处理位于第二和第三象限，其中T₁和T₂处理处于第三象限，T₃处理处于第二象限，CK处理处于第四象限。在第1主成分上，T₁、T₂和T₃处理具有相似性，且与CK有较大差异。表明施用不同有机肥后细菌群落物种相对丰度较单施化肥均发生了明显变化。

图  4  各处理烤烟根际土壤细菌群落在门水平上的PCA分析

Figure  4.  PCA analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level

下载: 全尺寸图片 幻灯片

由图5可知：当unifrac距离为0.025时，各处理烤烟根际土壤细菌群落在门水平上可聚为2类，施用有机肥处理为1类，单施化肥处理为1类；当unifrac距离为0.0375~0.0500时可聚为3类，T₁和T₂处理为1类，T₃处理与CK分别单独为1类。表明施用有机肥处理细菌群落组成及相对丰度与单施化肥处理均有明显差异，其中T₁与T₂处理相似度较高。

图  5  各处理烤烟根际土壤细菌群落在门水平上的UPGMA聚类分析

Figure  5.  UPGMA cluster analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.6   细菌群落功能分析

根据16S序列分类注释结果，利用FAPROTAX工具对细菌群落功能进行注释预测，总共获得56个功能分组；相对丰度排名前10的细菌群落功能分组信息及聚类结果见图6。结果表明：各有机肥处理烤烟根际土壤中化能异养、几丁质分解、光养、光异养、硝化和发酵等功能的细菌群落相对丰度均高于单施化肥处理，而芳香化合物降解功能的细菌群落相对丰度低于单施化肥处理。T₁处理发酵和捕食性功能的细菌群落相对丰度高于其他处理；T₂处理硝酸盐还原功能的细菌群落相对丰度高于其他处理，其硝化功能的细菌群落相对丰度(1.07%)与T₁处理(1.04%)水平相当且高于CK和T₃处理；T₃处理化能异养、光养和光异养等功能的细菌群落相对丰度高于其他处理。

图  6  基于FAPROTAX工具的细菌群落功能预测结果

注：各行不同颜色代表功能细菌群落相对丰度，颜色越深代表相对丰度越大。

Figure  6.  Prediction results of bacterial community function based on FAPROTAX

Note: The different colors represent the relative abundance of functional bacterial community; the darker the color, the greater the relative abundance.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

有机肥施用作为烤烟生产的重要措施之一，其种类、数量对土壤微生物群落结构及多样性均会产生一定的影响。刘昌等^[22]研究表明：有机肥和无机肥配施可以提高土壤细菌多样性指数；樊俊等^[23]研究发现：施用腐熟有机肥可提高土壤微生物OTUs总量及群落多样性和丰富度指数。本研究中，各有机肥处理根际土壤中细菌OTUs数量、Shannon指数和Chao1指数较单施化肥均有所增加，说明增施有机肥有利于提高烤烟根际土壤细菌群落多样性和丰富度，这与刘昌等^[22]及樊俊等^[23]的研究结果一致。其中，生物有机肥处理的细菌群落多样性和丰富度高于其他处理，可能有以下两方面的原因：一是生物有机肥的施入将细菌带入土壤中；二是高C/N有机肥为土壤提供了更多的有机碳含量，从而提高了土壤细菌对碳源的利用能力，促进细菌生长繁殖而增加其数量。王军等^[24]研究表明：施用C/N越高的有机肥导致土壤有机质和水溶性碳含量相应增加；焦晓光等^[25]研究表明：土壤微生物量碳、基础呼吸和细菌数量随土壤有机质含量的增加而增加。但是过高的C/N容易导致微生物与作物竞争土壤中氮素^[26]，因此在施用该生物有机肥时需适当调整氮肥用量。

高通量测序技术作为研究微生物多样性的分子生物学手段，可检测到更多低丰度的遗传信息，能更深层次地揭示微生物群落结构组成^[27]。本研究利用高通量测序技术对烤烟根际土壤优势细菌门、属的分析发现：各处理均以变形菌门相对丰度最高，这与陈泽斌等^[28]的研究结果一致。本研究发现：各增施有机肥处理根际土壤样品鞘氨醇单胞菌属、Bryobacter及芽单胞菌属均有所增加，变形菌门中鞘氨醇单胞菌属对芳香化合物具有高代谢能力^[29]，酸杆菌门Bryobacter具有促进土壤碳循环的作用^[30]，芽单胞菌门芽单胞菌属具有降解复杂的大分子有机化合物的作用^[31]，这说明施用有机肥有利于土壤中鞘氨醇单胞菌属、Bryobacter及芽单胞菌属等碳循环功能细菌群落的富集。从PCA和UPGMA聚类结果也可看出：有机肥处理的根际土壤细菌群落组成及相对丰度在门水平上相似性较高，与单施化肥有较大差异。这可能是因为施用有机肥均可提高土壤中有机物质的含量，进而促进有机物降解功能细菌数量增加。各有机肥处理土壤样品中放线菌门相对丰度较单施化肥处理有所降低，这与刘昌等^[22]的研究结果一致，但与施河丽等^[32]的研究结果不一致，这可能是由于有机肥施用改变了土壤的pH、氮素形态及养分含量，进而影响土壤放线菌数量的变化。有研究表明：放线菌是一类喜中性偏碱环境的微生物，且数量与土壤中氮素形态及养分含量密切相关^[33-34]，但有机肥施用对放线菌的具体影响机制还有待进一步研究。

FAPROTAX是LOUCA等^[21]为解析微生物群落功能于2016年创建的基于原核微生物分类的功能注释数据库。本研究发现：施用有机肥后，烤烟根际土壤中硝化功能的细菌群落相对丰度高于单施化肥处理，这与刘娟娟^[35]的研究结果一致；其中，烟草专用有机肥与生物有机肥处理硝化功能的细菌群落相对丰度高于其他处理，这可能是因为这2种有机肥原料中含有活性较高的矿物源腐殖酸。有研究表明：褐煤和风化煤等矿物源腐殖酸对土壤硝化作用具有明显的促进作用^[36]。此外，烟草专用有机肥处理土壤发酵功能的细菌群落相对丰度、生物有机肥处理硝酸盐还原功能的细菌群落相对丰度以及精制有机肥处理化能异养、光养和光异养功能的细菌群落相对丰度均高于其他处理，表明烟草专用有机肥处理更有利于促进土壤碳氮代谢，生物有机肥处理更有利于促进氮代谢，精制有机肥处理更有利于促进碳代谢。基于FAPROTAX工具可以预测土壤中已知功能细菌群落的相对丰度，而土壤中还有大量细菌功能未知，今后有必要继续深入研究。

4.   结论

本研究施用的生物有机肥、精制有机肥和烟草专用有机肥均有利于提高烤烟根际土壤细菌群落多样性及特有细菌菌种数量。在土壤细菌群落结构组成方面，烟草专用有机肥处理根际土壤细菌群落结构组成及相对丰度与生物有机肥处理相似，均表现为酸杆菌门、绿弯菌门及浮霉菌门更丰富，而精制有机肥处理以变形菌门更丰富；有机肥处理鞘氨醇单胞菌属、黄色土源菌属、Bryobacter和芽单胞菌属等为主要优势细菌门的主要细菌属，且均以烟草专用有机肥处理更丰富。在土壤细菌功能性方面，施用有机肥均有利于提高根际土壤中化能异养、发酵、硝化、光养和光异养等功能性细菌群落的相对丰度，其中，施用烟草专用有机肥处理发酵功能的细菌群落相对更丰富，施用生物有机肥处理硝酸盐还原功能的细菌群落相对更丰富，施用精制有机肥处理化能异养及光养功能的细菌群落相对更丰富。整体而言，以施用烟草专用有机肥对烤烟根际土壤细菌群落多样性的影响更为突出，有利于提升土壤细菌群落多样性，促进土壤碳氮代谢。