猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种具有高度传播性的消化系统疾病，临床上主要表现有急性肠炎、呕吐和水样腹泻等症状^[1]。该病可感染各年龄的猪，秋冬季节为疾病的高发期^[2-3]，常引起仔猪高病死率^[4]。临床上，PEDV可与猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PRV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)等其他病毒混合感染^[5]，流行范围极广。猪在潜伏期与发病期排泄的粪便、乳汁中都携带大量病毒，对周围环境造成严重污染，给各国养猪业造成了巨大的经济损失^[6-8]。

S基因是PEDV主要的抗原决定基因，由4 152 nt构成。编码形成的S蛋白属于Ⅰ型糖蛋白，由1 383个氨基酸组成^[9][S1区(1~789 aa)和S2区(790~1383 aa)]，是PEDV主要致病蛋白。具有促进病毒膜融合、与细胞受体互作、信号传导、固定支撑、诱导自然宿主产生中和抗体等作用^[10-11]。S1区含多个抗原表位和受体结合域，是S蛋白主要的功能区；S2区为跨膜区域，该区域促进病毒与宿主细胞膜融合且相对较保守，影响了病毒的侵染能力^[12]。本研究前期已对PEDV分离株做了全基因组测序(GenBank登录号：MK 702008)，发现S1区碱基发生了多次插入与缺失，这可能会大大影响与受体结合的效率。通过对S蛋白进行分析，截取S蛋白抗原决定簇和免疫优势区2个抗原性较高的片段进行蛋白表达，并以之为包被抗原，建立特异性强、重复性高、结果准确的间接ELISA抗体检测方法，成功解决了抗原制备的问题同时丰富了PEDV诊断方法。

1.   材料与方法

1.1   毒株、质粒及血清

PEDV毒株、克隆载体pMD-19T (simple)、表达载体pET-32a (+)、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)均由四川农业大学动检实验室保存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和PEDV阳性血清均由四川农业大学动检实验室保存。

1.2   主要试剂

质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit购自Omega公司；DNA Marker、反转录试剂盒、蛋白质Marker(20~120 ku)、T4 DNA连接酶和IPTG均购自大连宝生物工程有限公司；ECL发光试剂盒购自美国Thermo公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗猪IgG和小牛血清购自上海生工生物工程有限公司；猪流行性腹泻快速检测试剂盒购自深圳市绿诗源生物技术有限公司。

1.3   引物设计及合成

截取 S1与S2区之间抗原决定簇区域进行载体构建。设计1对分别插入限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的引物并引入保护碱基，送至上海生工生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

表  1  引物序列

Table  1.  The primer sequences

引物 primer	引物序列 (5′→3′) sequence (5′→3′)	产物大小/bp products size
			SNJ-F	CGGGATCCGTTTATTCTGTCACGCCA	315
SNJ-R	CCGGTCGAGCTGTAAATATTCTGTTCTAATACTC
注：下划线为酶切位点。 Note: The underlines represent the restriction sites.

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1.4   目的基因SJ的扩增鉴定及重组质粒pET-32a (+)-SJ的构建

提取分离株SNJ-P的RNA，转录为cDNA，以cDNA为模板使用引物(SNJ-F和SNJ-R)进行PCR扩增，获得SJ基因。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，34个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物回收纯化后与pMD-19T (simple)载体16 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α中。提取质粒经BamH I和Hind Ⅲ酶切鉴定后，取50 μL酶切产物添加至0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分离，纯化得到SJ目的基因片段，克隆至表达载体pET-32a (+)，构建重组质粒pET-32a (+)-SJ。

1.5   重组蛋白的表达、纯化及鉴定

将鉴定正确的重组表达质粒pET-32a (+)-SJ与pET-32a (+)空载分别转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，培养至菌液OD_{600 nm}值在0.6~0.8左右时，添加终浓度为0.4~1.2 mmol/L 的IPTG，继续诱导表达2~7 h (所有变量按棋盘法进行优化)。目的蛋白SJ用Ni-Agarose-Resin层析柱纯化，经SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜，以猪PEDV阳性血清为一抗，辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗猪抗体为二抗，进行Western-blot分析鉴定。使用BCA蛋白定量检测试剂盒测定纯化的重组蛋白质量浓度。

1.6   间接ELISA抗体检测方法的建立及反应条件的优化

采用棋盘法进行测定。将纯化的PEDV SJ蛋白、阴阳性血清按梯度倍比稀释，确定最佳抗原包被质量浓度、最佳血清稀释度和最佳酶标抗体稀释度。纯化的PEDV SJ蛋白分别作1∶1000、1∶500、1∶250、1∶125和1∶62.5稀释；PEDV阳性血清和阴性血清分别作 1∶100、1∶80、1∶40、1∶20和1∶10稀释，酶标抗体按1∶4000、1∶3000、1∶2000和1∶1000稀释。按常规ELISA方法操作，测定记录OD_{450 nm}值，计算P/N值，选定最佳稀释度，并且对包被条件、封闭液及时间、显色时间进行逐一优化，确定最优反应条件。

1.7   标准临界值的确定

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1.8   特异性试验、重复性试验和符合率试验

用已建立的间接ELISA抗体检测方法，检测实验室保存的PPV、PRV、TGEV、PRRSV、PCV和CSFV阳性血清。每份血清做3个重复，并设立PEDV阴性血清和阳性血清作为对照。测定OD_{450 nm}值，计算平均值，判定血清阴阳性用以确定方法的特异性。

批内重复：选取3份PEDV不同抗体水平的猪血清，在同一时间进行间接ELISA抗体检测试验，每份血清重复3次，测定OD_{450 nm}值，分别计算3份血清OD_{450 nm}值的平均值、标准方差及变异系数；批间重复：选取3个不同时间包被的酶标板，3份PEDV不同抗体水平的猪血清，在不同时间测定OD_{450 nm}值，分别计算3份血清平均值、标准方差及变异系数。

随机选取30份血清，分别用建立的ELISA方法与绿诗源猪流行性腹泻快速检测试剂盒同时进行检测，比较两者符合率。

1.9   临床应用

为评价该方法在临床上的应用价值，采集四川6个猪场120份血清进行检测，测定OD_{450 nm}值，统计阳性检出率。

2.   结果与分析

2.1   SJ基因的扩增及重组表达质粒的鉴定

以分离株SNJ-P的cDNA作为模板扩增获得目的基因SJ，片段大小为315 bp (图1a)。回收目的条带，构建重组质粒pMD-19T-SJ，使用快切酶 BamH I和Hind Ⅲ进行酶切鉴定(图1b)得到2 692与315 bp 2条片段，与预期相符。将酶切产物克隆至表达载体构建重组质粒pET-32a (+)-SJ，用相同2种快切酶鉴定得到6 196和315 bp2条条带与预期结果相符。重组质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果分析表明重组质粒成功构建。

图  1  SJ基因片段扩增及pMD-19T-SJ双酶切鉴定电泳图

注：M1. Marker DL 2000；1. SJ基因扩增片段；2. 阴性对照；M2. Marker DL4500；3. 重组质粒双酶切鉴定。

Figure  1.  Amplification of SJ gene fragment and pMD-19T-SJ double enzyme digestion identification

Note: M1. Marker DL 2000; 1. the amplification fragment of SJ gene; 2. negative control; M2. Marker DL 4500; 3. double enzyme digestion of recombinant plasmid.

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2.2   重组蛋白的鉴定及表达纯化

pMD-19T-SJ和空载菌经IPTG诱导表达后，用SDS-PAGE进行鉴定，结果显示：重组菌和空载菌分别在35和24.8 ku出现了特异性蛋白条带(图2a)，与预期相符，表明成功表达SJ基因。采用Ni-Agarose-Resin层析柱纯化蛋白，Western-blot结果显示：诱导表达的重组蛋白可以与PEDV阳性血清发生特异性反应，表明重组蛋白具有良好的反应原性(图2b)，并测得重组蛋白质量浓度为1.145 mg/mL。

图  2  重组SJ蛋白SDS-PAGE检测及Western-blot分析

注：a) SDS-PAGE：M. 预染蛋白Marker (20~120 ku)；1. 空载诱导；2. 空载未诱导；3. 重组蛋白诱导；4. 重组蛋白未诱导；5、6. 蛋白穿流液；7. 蛋白洗涤液；8. 纯化蛋白；b) Western-blot：9. 重组蛋白诱导；10. 空载诱导。

Figure  2.  Expression of the target protein and Western-blot

Note: a). SDS-PAGE: M. protein molecular weight Marker (20-120 ku); 1. the induced empty vector; 2. the uninduced empty vector; 3. the induced connection vector; 4. the uninduced connection vector; 5, 6. protein in fluid flow; 7. protein washing liquid; 8. protein elution; b) Western-blot: 9. the induced target protein; 10. the induced empty vector.

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2.3   PEDV S蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

2.3.1   最佳反应条件确定

采用棋盘法优化各参数后，确定了最佳反应条件：抗原稀释倍数为1∶125 (9.16 μg/mL)，每孔100 μL 4 ℃过夜37 ℃孵育1 h进行包被，用5% BSA加0.1%的吐温−20 37 ℃封闭75 min，最佳血清稀释倍数为1∶40，1∶1000酶标抗体孵育45 min，底物显色时间为10 min，能有最优反应结果。

2.3.2   间接ELISA抗体检测方法临界值的确定

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2.3.3   特异性试验

用建立的间接ELISA抗体检测方法，检测试验室保存的PPV、PRV、TGEV、PRRSV、PCV和CSFV阳性血清，并设立PEDV阴性血清和阳性血清作为对照。试验结果如表2所示：除PEDV阳性血清外，OD_{450 nm}值均小于0.324，判定为阴性。试验证明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性良好。

表  2  特异性试验结果

Table  2.  Specificity of indirect ELISA

项目 item	PPV	PRV	TGEV	PRRSV	PCV	CSFV	阳性 positive control	阴性 negative control
OD450 nm	0.013	0.125	0.21	0.147	0.16	0.147	1.317	0.144
判定结果 result	−	−	−	−	−	−	+	−

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2.3.4   重复性试验

选取3份PEDV不同抗体水平的猪血清，进行重复试验，批内与批间重复试验变异系数在1.23%~5.84%之间(表3)。试验证明建立的间接ELISA抗体检测方法重复性良好。

表  3  批内重复性试验结果

Table  3.  The results of intra-assay repeat tests

项目名称 item	批内重复 intra-batch repeat				批间重复 inter-batch repeat
	#1	#2	#3		#1	#2	#3
平均值 average value	1.867	0.137	0.557		1.822	0.140	0.565
标准方差 standard deviation	0.023	0.005	0.028		0.106	0.008	0.033
变异系数/% coefficient of variation	1.23	3.65	5.03		5.81	5.71	5.84

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2.3.5   符合性试验

随机选取30份血清，分别用建立的ELISA方法与市售PEDV抗体检测试剂盒同时进行检测，计算符合率为96.67%，试验证明建立的间接ELISA抗体检测方法结果可靠。

2.3.6   临床血清检测结果

采集四川6个猪场120份血清进行检测，测定OD_{450 nm}值，结果显示哺乳仔猪血清阳性率为72% (36/50)，妊娠母猪血清阳性率为87.14% (61/70)，试验证明有较好的利用范围和检测效率。

3.   讨论

PED主要在欧洲和亚洲大规模暴发^[13-15]，给全球养猪业造成了巨大的损失。国内外研发了许多预防该病的疫苗，大多以灭活苗与活疫苗为主^[16]，如马思奇等^[17-18]首先报道了氢氧化铝组织灭活苗，使用后免疫效果达85%以上；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研发的“猪传染性胃肠炎—猪流行性腹泻—猪轮状病毒”三联活疫苗^[19]，虽然使用后能在一定时间内降低猪群PED的感染率，但预防效果都在疫苗接种一段时间后降低，这可能是由PEDV变异导致疫苗无法起到很好的保护作用，使得疫情难以控制^[20]。对免疫猪群抗体水平的检测是PED有效防控的关键，建立一种快捷、方便和准确的PEDV检测方法十分迫切。现已有很多关于PEDV的ELISA检测方法，但大多以双抗夹心ELISA为主^[21-23]，单克隆抗体制备花费时间长、效率低且对技术要求高，不是特别适用于规模化生产及检测。目前市场上只有少量PEDV抗体检测试剂盒售卖，抗原大都包被的是全病毒^[24-26]，易出现假阳性，间接ELISA抗体检测方法相比较而言，操作更简便、成本更低、特异性更强以及具有更高的利用价值。此外还有许多检测手段，RT-qPCR^[27]虽然特异性好、灵敏性高，但依赖于仪器设备；胶体金^[28]虽然成本低、检测快速，但只能对病毒定性不能定量；PEDV相比于其他冠状病毒分离培养的难度大很多，且存在病毒传代的过程中丢失毒株的风险，导致很难大量制备抗原。以具有抗原性的重组蛋白作为ELISA包被抗原，可以很好地解决这一难题。

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4.   结论

近年来，流行毒株的不断变异导致现有疫苗不能提供足够保护，加之更多的猪源性传染病可以与该病混合感染导致PED疫情更加复杂，难以防控治疗。因此高效精确地诊断PEDV对有效实施疾病的控制措施至关重要，这些措施有助于降低病毒进一步传播的风险^[32]，也为后续治疗争取宝贵的时间。本研究对PEDV 强度株SNJ-P的部分S基因进行原核表达，初步建立了PEDV抗体间接ELISA抗体检测方法。该诊断方法具有快捷、方便、准确等优点，可以成为临床上对PEDV抗体水平的监控方法，为以后诊断试剂盒的研制提供理论指导。