玫瑰花青素对小鼠抗疲劳及抗氧化研究
Study on Anti-fatigue and Anti-oxidation Effects of Rose Anthocyanin in Mice
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Keywords:
- rose anthocyanins /
- anti-fatigue /
- anti-oxidation /
- mice
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随着社会的发展，人们对健康长寿的需求日益增长，因此，研发抗氧化、抗疲劳食品及保健品等已成为国内外的研究热点[1-2]。花青素是一类分布在自然界中的高色素类黄酮，是一种天然强抗氧化剂，它除了可以赋予鲜花、水果和蔬菜红色、紫色和蓝色外，还可以促进机体健康[3]。已有研究表明：紫山药花青素具有抗肿瘤活性[4]，黑豆皮[5]和紫薯[6]花青素具有降血脂及抗氧化效果，黑枸杞花青素具有抗疲劳功能[7-8]，野葛花[9]、蓝莓[10]和葡萄籽[11]花青素对小鼠具有抗疲劳及体内抗氧化作用，蓝莓花青素还可诱导细胞凋亡[12-13]。
玫瑰(Rosa rugosa)，又称刺玫花、刺客、穿心玫瑰，为蔷薇科蔷薇属多年生灌木。云南气候温和，适宜药用玫瑰生长发育，其产量高、品质好、花期长，已成为中国药用玫瑰主产区。玫瑰花瓣中不仅富含维生素C和维生素E等多种维生素以及柠檬酸和苹果酸等有机酸，而且还富含花青素，但鲜有关于药用玫瑰花青素的研究报道。鉴于此，本研究通过给小鼠灌服玫瑰花青素提取物后，测定小鼠负重游泳时间及抗疲劳和抗氧化相关指标，探讨玫瑰花青素抗疲劳和抗氧化的功效，旨在为云南药用玫瑰花青素功效的深入研究及系列产品的研发和应用提供一定的科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
玫瑰花青素：由云南农业大学农学与生物技术学院实验室自制。试验动物：SPF级，健康雄性昆明种小白鼠40只，体质量 (20±2) g，购自昆明医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK (滇)K2015-0002。
1.2 试剂
尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血乳酸(blood lactic acid，BLA) 、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxide dismutase，GSH-Px)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 方法
1.3.1 试验动物分组及灌胃
将适应7 d后的40只健康雄性昆明小鼠随机分为4组，每组10只，即对照组(蒸馏水，20 mL/kg)、玫瑰花青素低剂量组(100 mg/kg)、中剂量组(150 mg/kg)和高剂量组(200 mg/kg)。每天定时灌胃1次，连续灌胃30 d。小鼠饲养环境：温度20~22 ℃，相对湿度50%~60%。试验期间小鼠自由采食和饮水。
1.3.2 负重游泳时间测定
末次给予玫瑰花青素灌胃30 min 后，小鼠尾根负荷5%体质量的铅皮，然后置小鼠于游泳箱中，水温(25±0.5) ℃，水深大于25 cm，记录小鼠从开始游泳至沉于水面下10 s后不能浮出水面的时间，即为力竭时间[14]，以客观地反映其运动疲劳的程度[15]。
1.3.3 抗疲劳和抗氧化生化指标测定
在小鼠负重游泳休息30 min后，摘除眼球采血。血液在4 ℃下3 000 r/min离心20 min，分离血清，−80 ℃以下保存备用；将采血后的小鼠立即处死，摘取肝脏，用冰生理盐水将肝脏制成10%的匀浆，在4 ℃下5 000 r/min离心10 min，收集上清液，−80 ℃以下保存备用。按照各试剂盒说明书测定BUN、BLA和MDA的含量、LDH、T-SOD和GSH-Px的活性以及T-AOC等指标。
1.3.4 抗氧化与抗疲劳的相关性分析
以低、中、高3个剂量组小鼠血清中的T-AOC为横坐标，分别以LDH活性以及BUN和BLA含量为纵坐标，绘制T-AOC与LDH、BUN、BLA之间的关系图，以分析抗氧化与抗疲劳的相关性。
1.4 数据处理
数据采用Excel和SPSS 17.0软件进行处理分析，结果均用“平均值±标准差”表示。将3个不同剂量组分别与对照组进行独立样本的t检验，P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有极显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 玫瑰花青素对小鼠负重游泳时间的影响
由表1可知：与对照组相比，低、中、高剂量组的小鼠负重游泳时间都极显著增加(P<0.01)；与低剂量组相比，中、高剂量组的小鼠负重游泳时间极显著增加(P<0.01)；与中剂量组相比，高剂量组的小鼠负重游泳时间显著增加(P<0.05)。说明玫瑰花青素能显著延长小鼠负重游泳时间，有效缓解运动疲劳；在一定范围内，小鼠负重游泳时间与玫瑰花青素摄入量呈剂量依赖关系。
表 1 玫瑰花青素对小鼠负重游泳时间的影响Table 1. Effects of rose anthocyanin on the swimming time with load in mice组别
groups负重游泳时间/min
weight-bearing swimming time负重游泳时间延长率/%
prolongation rate of weight-bearing swimming对照组
control group8.97±3.33 Cd — 低剂量组
low dose group35.27±3.84 Bc 293.20 中剂量组
middle dose group44.48±3.44 Ab 395.88 高剂量组
high dose group49.23±3.38 Aa 448.83 注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Note: In the same column, different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level, different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level; the same as below.2.2 玫瑰花青素对小鼠血液中BLA和BUN含量及LDH活性的影响
由表2可知：与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血液中BLA含量均极显著降低(P<0.01)，分别降低17.25%、28.11%和41.44%；且随着玫瑰花青素剂量的增加，BLA含量极显著降低 (P<0.01)。与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血液中的BUN含量分别显著降低11.84%、21.32%和33.96% (P<0.01或P<0.05)；且随着玫瑰花青素剂量的增加，BUN含量降低。与对照组相比，低、中、高剂量组LDH活性均极显著升高(P<0.01)，分别升高13.24%、42.34%和68.87%；且随着玫瑰花青素剂量的增加，LDH活性极显著升高(P<0.01)。表明玫瑰花青素降低了小鼠运动后血液中BLA和BUN含量，增加LDH活性，可有效缓解运动时的疲劳。
表 2 玫瑰花青素对小鼠血液中BLA和BUN含量及LDH活性的影响Table 2. Effects of rose anthocyanin on the contents of BLA and BUN, and the activity of LDH in blood of mice组别
groupsBLA含量/(mmol·L−1)
BLA contentBUN含量/(mmol·L−1)
BUN contentLDH活性/(U·L−1)
LDH activity对照组 control group 14.55±0.94 Aa 14.87±1.92 Aa 3678.42±187.11 Dd 低剂量组 low dose group 12.04±1.00 Bb 13.11±1.62 ABb 4165.62±241.55 Cc 中剂量组 middle dose group 10.46±0.96 Cc 11.70±2.09 BCb 5235.79±349.10 Bb 高剂量组 high dose group 8.52±0.73 Dd 9.82±0.61 Cc 6211.58±279.87 Aa 2.3 玫瑰花青素对小鼠血清和肝脏中MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性及T-AOC的影响
2.3.1 对小鼠血清中相关指标的影响
由表3可知：与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中的MDA含量分别降低9.67%、15.31%和15.65%，其中，中、高剂量组与对照组差异极显著(P<0.01)；与低剂量组相比，中、高剂量组MDA含量显著降低(P<0.05)。与对照组相比，低、中剂量组小鼠血清中的T-AOC水平显著增加(P<0.05)，高剂量组T-AOC水平极显著增加(P<0.01)；与低剂量组相比，高剂量组T-AOC水平显著增加(P<0.05)。与对照组相比，低剂量组小鼠血清中的GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，中、高剂量组GSH-Px活性极显著升高(P<0.01)；与低剂量组相比，中、高剂量组GSH-Px活性极显著升高(P<0.01)。与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中的T-SOD活性极显著升高(P<0.01)；与低剂量组相比，中、高剂量组的T-SOD活性极显著升高(P<0.01)。
表 3 玫瑰花青素对小鼠血液和肝脏中部分生化指标的影响Table 3. Effects of rose anthocyanin on some biochemistry indexes in serum and liver of mice组别
groups丙二醛含量/(nmol·mL−1)
MDA contentT-AOC/(U·mL−1) GSH-Px活性/(U·mL−1)
GSH-Px activityT-SOD活性/(U·mL−1)
T-SOD activity血清 serum 对照组 control group 23.38±3.51 Aa 6.85±1.25 Bc 239.84±7.31 Bc 107.32±5.21 Cc 低剂量组 low dose group 21.12±2.08 ABa 7.67±2.15 ABb 286.28±8.21 Bb 168.92±6.65 Bb 中剂量组 middle dose group 19.80±1.58 Bb 7.92±4.37 ABab 551.06±7.49 Aa 193 21±5.53 Aa 高剂量组 high dose group 19.72±1.31 Bb 8.10±3.16 Aa 595.72±6.77 Aa 199.52±4.13 Aa 肝脏 liver 对照组 control group 2.54±0.26 Aa 1.47±3.08 Bd 18.72±0.61 Bc 195.12±1.73 Dd 低剂量组 low dose group 1.66±0.20 Bb 1.63±3.01 Bc 39.49±1.03 ABb 232.08±1.63 Cc 中剂量组 middle dose group 1.33±0.16 Bb 1.82±1.17 Bb 40.76±1.85 ABb 305.98±2.71 Bb 高剂量组 high dose group 0.67±0.11 Cc 2.21±4.44 Aa 59.28±1.34 Aa 326.99±4.49 Aa 2.3.2 对小鼠肝脏中相关指标的影响
由表3还可知：与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠肝脏中的MDA含量均极显著降低(P<0.01)，且高剂量组的MDA含量均极显著低于低、中剂量组(P<0.01)。与对照组相比，低、中剂量组小鼠肝脏中T-AOC水平显著升高(P<0.05)；且随着玫瑰花青素剂量的增加，T-AOC水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比，低、中剂量组小鼠肝脏中的GSH-Px活性显著增加(P<0.05)，高剂量组的GSH-Px活性极显著增加(P<0.01)；高剂量组的GSH-Px活性显著高于低、中剂量组(P<0.05)；但低、中剂量组的GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠肝脏中T-SOD活性均极显著增加(P<0.01)；且随着玫瑰花青素剂量的增加，T-SOD活性极显著升高(P<0.01)。
以上结果说明：玫瑰花青素能有效降低小鼠运动后血清和肝脏中的MDA含量、增加GSH-Px和T-SOD活性，总抗氧化力提高，清除过氧化物的能力增强；抗氧化能力与玫瑰花青素灌胃剂量存在依赖关系。
2.4 抗疲劳与抗氧化的相关性分析
由图1可知：小鼠血液中LDH活性随T-AOC水平的提升而增加，二者之间成正比关系 (y=488.02x+1 096.330，R2=0.217)；BUN和BLA含量随T-AOC水平的提升而降低，即成反比关系 (y=−0.477x+16.020，R2=0.037；y=−0.946x+18.617，R2=0.152)。可见，灌胃玫瑰花青素小鼠血液中T-AOC越强，小鼠运动过程中产生并累积的BUN和BLA越少，说明玫瑰花青素可以有效地缓解运动疲劳。
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图 1 T-AOC与LDH活性及BUN和BLA含量的相关性Figure 1. Correlations between T-AOC and LDH activity, and the content of BUN and BLA3. 讨论
当机体生理过程不能维持或其机能在某一特定的水平不能维持预定的运动强度时即为疲劳。抗疲劳包括延缓疲劳的产生和/或加速疲劳的消除[16]。机体运动时，体内糖类分解供能加速，供氧不足导致糖无氧酵解产生乳酸，血液中乳酸(BLA)含量升高，使肌肉中H+浓度上升，pH值下降，运动能力下降，产生疲劳[17]；机体能量代谢降低时，蛋白质及氨基酸的分解代谢加强，尿素生成增多，使血清尿素氮(BUN)含量升高[18]，运动耐力下降。本研究通过灌胃玫瑰花青素小鼠负重游泳试验，发现玫瑰花青素能延长小鼠游泳时间，提高运动耐力，增强血液中LDH活性，加快乳酸分解，降低血液中BUN和BLA含量，延缓疲劳。刘协等[11]研究发现：葡萄籽提取物原花青素能降低小鼠运动后产生的乳酸；刘岱琳等[19]发现：复方低聚原花青素能有效减少尿素氮含量；王紫玉等[20]研究发现：蓝莓花青素能有效延长小鼠负重游泳时间；傅科其[21]研究发现原花青素能延长小鼠游泳时间。本试验结果与上述研究结论基本一致，说明玫瑰花青素具有抗疲劳功效。
超氧阴离子自由基产生和血浆脂质过氧化物增加是运动性疲劳产生的重要原因[22-23]。运动时体内产生过量的自由基会攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸产生丙二醛，并破坏生物膜正常的生理功能，若不及时消除，将会影响物质代谢和酶促反应过程[24]。因此，从体外补给具有抗氧化功效的物质，可以提高机体抗氧化酶的活力，及时清除过量的超氧阴离子自由基，达到抗疲劳的效果。玫瑰花中含有丰富的花青素，不仅具有明显的清除自由基能力，还对体内各种抗氧化酶具有促进和激活作用[25]。本研究表明：灌服玫瑰花青素后，小鼠血清和肝脏中抗氧化酶T-SOD和GSH-Px活性增加，MDA含量降低，T-AOC增大，说明玫瑰花青素具有显著的抗氧化和抗疲劳作用。通过抗氧化性与抗疲劳性相关性的分析可知：抗氧化能力与抗疲劳效果呈正相关关系。姚翠育[26]采用DPPH法测定纯化得到的玫瑰花原花青素产品抗氧化活性，表明原花青素的抗氧化能力强于维生素C；李鹏飞[27]提取甘肃苦水玫瑰花抗氧化成分进行体外抗氧化能力分析，表明苦水玫瑰干花瓣抗氧化物质具有良好的DPPH·和羟自由基的清除效果，且随着苦水玫瑰花瓣提取物添加量的增加，猪油自动氧化被逐渐抑制；高璐等[28]研究发现：葡萄籽原花青素提取物对衰老模型小鼠具有抗氧化作用；张卓睿等[10]通过灌胃小鼠蓝莓花青素提取物研究其对小鼠抗疲劳及抗氧化功效，结果表明其抗疲劳和抗氧化作用显著；罗文娟[29]研究发现：黑果枸杞原花青素能够抑制紫外照射联合皮下注射D-半乳糖对小鼠皮肤的氧化损伤，并下调半胱氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸蛋白酶-9表达，抑制细胞凋亡，延缓皮肤衰老。本研究体内抗氧化试验结果与上述研究结果基本一致，但抗氧化和抗疲劳的生理生化机制还有待进一步深入研究。本研究为阐释玫瑰花青素抗疲劳和抗氧化功效提供理论依据，也为药用玫瑰花系列产品的开发和应用提供试验数据支撑。
4. 结论
玫瑰花青素能有效延长小鼠负重游泳时间，使小鼠体内的乳酸脱氢酶、总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性增强，总抗氧化能力提升，使丙二醛、尿素氮和血乳酸的含量降低，具有抗疲劳和抗氧化功效；抗疲劳和抗氧化功效与玫瑰花青素灌胃剂量存在依赖关系。
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图 1 T-AOC与LDH活性及BUN和BLA含量的相关性
Figure 1. Correlations between T-AOC and LDH activity, and the content of BUN and BLA
表 1 玫瑰花青素对小鼠负重游泳时间的影响
Table 1 Effects of rose anthocyanin on the swimming time with load in mice
组别
groups负重游泳时间/min
weight-bearing swimming time负重游泳时间延长率/%
prolongation rate of weight-bearing swimming对照组
control group8.97±3.33 Cd — 低剂量组
low dose group35.27±3.84 Bc 293.20 中剂量组
middle dose group44.48±3.44 Ab 395.88 高剂量组
high dose group49.23±3.38 Aa 448.83 注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Note: In the same column, different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level, different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level; the same as below.
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表 2 玫瑰花青素对小鼠血液中BLA和BUN含量及LDH活性的影响
Table 2 Effects of rose anthocyanin on the contents of BLA and BUN, and the activity of LDH in blood of mice
组别
groupsBLA含量/(mmol·L−1)
BLA contentBUN含量/(mmol·L−1)
BUN contentLDH活性/(U·L−1)
LDH activity对照组 control group 14.55±0.94 Aa 14.87±1.92 Aa 3678.42±187.11 Dd 低剂量组 low dose group 12.04±1.00 Bb 13.11±1.62 ABb 4165.62±241.55 Cc 中剂量组 middle dose group 10.46±0.96 Cc 11.70±2.09 BCb 5235.79±349.10 Bb 高剂量组 high dose group 8.52±0.73 Dd 9.82±0.61 Cc 6211.58±279.87 Aa
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表 3 玫瑰花青素对小鼠血液和肝脏中部分生化指标的影响
Table 3 Effects of rose anthocyanin on some biochemistry indexes in serum and liver of mice
组别
groups丙二醛含量/(nmol·mL−1)
MDA contentT-AOC/(U·mL−1) GSH-Px活性/(U·mL−1)
GSH-Px activityT-SOD活性/(U·mL−1)
T-SOD activity血清 serum 对照组 control group 23.38±3.51 Aa 6.85±1.25 Bc 239.84±7.31 Bc 107.32±5.21 Cc 低剂量组 low dose group 21.12±2.08 ABa 7.67±2.15 ABb 286.28±8.21 Bb 168.92±6.65 Bb 中剂量组 middle dose group 19.80±1.58 Bb 7.92±4.37 ABab 551.06±7.49 Aa 193 21±5.53 Aa 高剂量组 high dose group 19.72±1.31 Bb 8.10±3.16 Aa 595.72±6.77 Aa 199.52±4.13 Aa 肝脏 liver 对照组 control group 2.54±0.26 Aa 1.47±3.08 Bd 18.72±0.61 Bc 195.12±1.73 Dd 低剂量组 low dose group 1.66±0.20 Bb 1.63±3.01 Bc 39.49±1.03 ABb 232.08±1.63 Cc 中剂量组 middle dose group 1.33±0.16 Bb 1.82±1.17 Bb 40.76±1.85 ABb 305.98±2.71 Bb 高剂量组 high dose group 0.67±0.11 Cc 2.21±4.44 Aa 59.28±1.34 Aa 326.99±4.49 Aa
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