植物根际作为植物生态系统与土壤生态系统相交叉形成的特殊区域^[1]，被认为是植物的第二基因组^[2]。在植物根际中含有众多种类的微生物，如细菌中的固氮螺菌属(Azospirillum)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和真菌中的木霉菌属(Trichoderma)等，已被证实对植物生长有显著的促进作用^[3]。此外，部分微生物既可以通过养分竞争、拮抗作用和诱导系统抗性等机制抑制土壤中病原菌而促进植物生长^[4]，也可以通过病原菌的累积而导致植株大量死亡^[5]。根际微生物群落结构以及多样性不仅受种植品种的影响，不同的种植模式和种植密度也会对其产生影响^[6]。根际微生物是植物根系与外界环境的直接参与者，因此研究间作体系中根际有益微生物与植物根的相互作用对改良间作土壤结构、增加养分利用和提高抗病性等优势具有重要作用。

间套作种植模式在中国有悠久的历史，适宜的间套作模式对缓解用地矛盾、增加土地产能、降低病虫害、维持土壤生态系统稳定性以及促进土地可持续利用具有重要作用。前人已报道利用玉米与魔芋间作^[7]、玉米与大豆或马铃薯间作^[8]可显著增加玉米产量、预防和控制病害发生。间套作模式能改变根际土壤细菌种群结构，增加土壤微生物多样性指数^[9-10]。宋亚娜等^[11]利用PCR-DGGE技术研究玉米与蚕豆、玉米与小麦间作对作物根际细菌群落结构的差异，结果显示：间作能够提高作物根际微生物多样性，改变根际细菌的结构组成。覃潇敏等^[12]利用Biolog技术研究了玉米马铃薯间作对根际微生物群落结构和功能多样性的影响，结果表明：间作处理改变了玉米和马铃薯根际微生物群落组成，提高了根际微生物群落功能多样性。涂勇等^[13]研究指出：烤烟与大豆带状套作可以显著增加根际土中细菌数量，同时可提高与土壤氮元素代谢相关的氨化细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌和自生固氮菌的数量，能降低主要土传病害的发生。目前，研究玉米大豆间作对根际微生物影响的主要方法是传统微生物分离和普通PCR技术等，尚未有利用高通量测序技术进行的研究报道。本研究基于高通量测序平台^[14]，通过构建细菌16S rDNA和真菌ITS1基因文库^[15]，研究玉米大豆间作系统中玉米病害、产量与玉米根际微生物群落变化之间关系，旨在探明多样性种植技术减轻病害发生和提高产量的作用机制，为玉米大豆间作模式的优化和推广提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试玉米品种为嘉佳荣2号，供试大豆品种为辽豆29，均由曲靖市农技中心提供。

1.2   试验方法

1.2.1   小区设计

大田试验在云南省曲靖市沾益区进行单因素随机区组试验，设置玉米与大豆间作、玉米单作2个处理，每处理重复3次，共6个小区，每个小区长20 m×宽8 m。每个间作小区有4条玉米∶大豆为2∶2的间作带，玉米株距50 cm、行距50 cm，大豆株距30 cm、行距35 cm，玉米与大豆行距为50 cm。每个单作小区有16行玉米，株距30 cm、行距40 cm。试验田四周设置1 m的保护行。试验于2018年5月10日播种，玉米每穴2~3粒，大豆3~4粒。播种前施复合肥200 kg/hm²和农家肥1000 kg/hm²作为基肥，播种后分别在苗期和喇叭期追肥1次，每次追肥施尿素160 kg/hm²。

1.2.2   病害和农艺性状调查

在玉米灌浆期(9月5日)，每个小区随机调查3个点，每个点调查15株玉米并记录玉米锈病、大斑病、小斑病和灰斑病病害发生情况，病害分级标准参照文献[16]，计算病情指数和防效。

病情指数(DI)=Σ(病级数值×各级病叶数)/(调查总叶数×病级最高级数值)×100；

相对防效(CE)=(对照病情指数−试验病情指数)/(对照病情指数) ×100%。

玉米成熟后(10月15日)调查玉米穗粗、穗长、籽粒数、百粒质量和小区产量等指标，调查方法参考文献[8]。

1.2.3   玉米根际土壤细菌和真菌多样性分析

已有研究表明：在玉米抽穗期微生物功能多样性的间作效应最明显^[9]，故于8月15日分别采集间作和单作的玉米根际土。每个小区随机选取5株玉米，连根拔起，抖去根表松散的泥土，剪取玉米须根混匀后作为1个小区的样品，放入冰盒带回实验室；然后将样品放于通风处稍微晾干水分，轻微抖去根围土，再用毛笔尖端刷下根上约1 mm厚度的土即为根际土，每个小区取根际土15~20 g，置于−80 ℃低温冰箱保存备用。

采用土壤DNA提取试剂盒(美国MOBIO Laboratories，Inc)取5 g根际土提取土壤DNA。用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外分光光度计检测 DNA 的质量和浓度。当DNA的质量和浓度符合公司测序标准后，委托上海欧易生物医学科技有限公司测序。使用细菌16S rDNA V3~V4区引物(343F：5′- TACGGRAGGCAGCAG -3′；798R：5′- AGGGTATCTAATCCT-3′)鉴定玉米根际土壤细菌多样性，真菌ITS引物(ITS1F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R：5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)鉴定真菌多样性。

1.3   数据分析

1.3.1   测序数据处理

将测序得到的原始FASTQ文件使用Trimmomatic^[17]软件质控，过滤掉低质量或模糊的碱基，剔除长度小于50 bp的序列。然后使用FLASH^[18]双末端拼接，同时去除Barcode和引物序列，去除长度小于 200 bp的序列，得到clean tags序列。最后使用 UCHIME^[19]软件去除clean tags中的嵌合体，得到最终用于划分OTU的valid tags。OTU聚类和物种注释使用QIIME^[20]软件完成。首先对得到的valid tags序列按照97%的相似度进行OTU分类，并选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列，然后采用 BLAST算法对代表序列与数据库进行比对注释得到每个OTU的物种信息，最后根据每个OTU在各个样本中的序列数，以数据量最少的样本为标准进行均一化处理，构建OTU在各个样本中的丰度矩阵文件，并计算α多样性指数。α多样性指数也被称为生境内的多样性，主要指局域均匀生境下的物种数量，使用Observed_species指数、Chao1指数和Shannon指数来表示。细菌和真菌β多样性以及差异OTUs分析使用R语言(Version 3.5.5)软件中的vegan包和edgeR包(统计方法为Wilcoxon秩和检验)完成。各样品根际微生物细菌的功能注释预测使用FAPROTAX^[15]在线数据库(http://www. zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX)进行，真菌功能预测使用FUNGuild^[21]在线数据库(http://www.stbates.org/guilds/app.php)进行。

1.3.2   数据统计与分析

试验数据采用SPSS 21和Excel 2010软件分析。

2.   结果与分析

2.1   玉米大豆间作对玉米产量指标的影响

由表1可知：玉米大豆间作的玉米穗粗、穗长、百粒质量、小区产量和产量均显著高于玉米单作(P<0.05)。

表  1  玉米大豆间作对玉米产量的影响

Table  1.  Effect of maize/soybean intercropping on the yield of maize

指标 index	MSI	MM
穗粗/cm ear diameter	19.9±0.32 a	17.88±0.9 b
穗长/cm ear length	25.93±1.32 a	22.04±2.07 b
籽粒数 number of seeds	942.33±73.04 a	713.83±80.68 a
百粒质量/g 100-grain weight	47.17±0.65 a	45.73±4.14 b
小区产量/(kg·plot−1) plot yield	224.35±20.14 a	190.31±50.23 b
产量/(kg·hm−2) yield	14 022.22±560.91 a	11 894.44±790.09 b
注：MSI. 玉米大豆间作；MM. 玉米单作；小区面积160 m2。同行数据后不同小写字母表示差异显著(LSD，P<0.05)；下同。 Note: MSI. maize and soybean intercropping; MM. maize monocropping; the area per plot was 160 m2 ; different lowercase letters after the same row data indicate significant difference (LSD, P<0.05); the same as below.

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2.2   玉米大豆间作对玉米病害的影响

由表2可知：玉米大豆间作的玉米锈病、灰斑病、小斑病和大斑病的病情指数均显著低于玉米单作(P<0.05)，计算其防效可知：玉米间作处理对玉米锈病、玉米灰斑病、玉米小斑病和玉米大斑病的病防效分别是25.59%、23.07%、23.13%和19.67%。

表  2  玉米大豆间作对玉米病害的影响

Table  2.  Effect of maize/soybean intercropping on maize diseases

病害 disease	病情指数 disease index		防效/% control efficacy
	MSI	MM
玉米锈病 corn rust	23.85±2.37 b	32.05±5.46 a	25.59
玉米灰斑病 corn gray leaf spot	19.5±0.65 b	25.35±3.21 a	23.07
玉米小斑病 corn southern leaf blight	13.32±2.55 b	17.33±0.25 a	23.13
玉米大斑病 corn northern leaf blight	9.8±0.45 b	12.2±0.36 a	19.67

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2.3   玉米大豆间作对玉米根际微生物α多样性的影响

由表3可知：测序得到的细菌和真菌的有效序列分别为11.07万和10.15万条。按照序列相似性≥97%可分为1个 OTU 分类单元的原则，分别得到细菌和真菌OUT分类单元3331和847个。玉米大豆间作的细菌和真菌序列利用率均低于玉米单作处理。玉米大豆间作的细菌α多样性指数显著大于玉米单作，表明玉米大豆间作能显著提高玉米根际土壤细菌多样性(P<0.05)，且两者的平均Shannon指数均大于7，说明土壤细菌群落多样性水平较高。真菌的α多样性也有类似的规律。说明玉米与大豆间作后使得玉米根际土中细菌与真菌α多样性显著升高，增加了根际微生物群落的种类。

表  3  玉米大豆间作对玉米根际微生物α多样性的影响

Table  3.  Effect of maize/soybean intercropping on α diversity of maize rhizosphere microorganisms

多样性指标 diversity index	细菌 bacteria			真菌 fungi
	MM	MSI		MM	MSI
有效 reads 数 valid reads	48 983 b	61 771 a		50 547 b	50 926 a
reads 利用率/% read utilization	72.7	71.35		96.19	96.03
OTU 总数 total OTUs	3 331	3 331		847	847
Observed _ species 指数 Observed_ species index	2 063.40 b	2 251.30 a		412.50 b	530.40 a
Chao1 指数 Chao1 index	2 579.97 b	2 669.11 a		532.50 b	641.88 a
Shannon 指数 Shannon index	8.50 b	9.39 a		5.52 b	6.50 a

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2.4   玉米大豆间作对玉米根际微生物β多样性的影响

由图1可知：真菌和细菌在第1主成分(PCo1)上分开，细菌聚集在第1主成分的左边，真菌聚集在其右边。细菌组和真菌组均表现为玉米大豆间作远离玉米单作，说明玉米与大豆间作使得玉米根际细菌和真菌群落发生巨大改变。

图  1  基于真菌和细菌群落欧式距离的主成分分析

Figure  1.  Principal component analysis based on Euclidean distance between fungal and bacterial communities

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2.5   玉米大豆间作与玉米单作的细菌、真菌差异OTUs

由图2可知：在发现的3331个细菌OTUs中，276个OTUs在玉米大豆间作玉米中显著富集(P<0.05)，属于玉米大豆间作处理特有部分；251个OTUs在单作玉米中显著富集(P<0.05)。根据OTUs的注释分类结果发现：玉米大豆间作处理显著富集OTUs主要分布在线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)以及低丰度的绿菌门(Chlorobi)、纤维素杆菌门(Fibrobacteres)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。相反，在玉米单作中显著富集OTUs主要分布在变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)。

图  2  玉米根际细菌差异OTUs分析

注：enriched. 玉米大豆间作显著富集的OTUs；depleted. 玉米单作显著富集的OTUs；nosig. 两者共有的OTUs；lnP. P值自然对数转换；logCPM. OTU相对丰度的大小；下同。

Figure  2.  Analysis of differential OTUs rhizosphere bacteria in maize

Note: enriched. maize/soybean intercropping significantly enriched OTUs; depleted. maize monoculture significantly enriched OTUs; nosig. the two shared OTUs; lnP. natureal logarithrn conversion of P value; logCPM. relative abundancehe; the same as below.

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由图3可知：共发现847个真菌OTUs，146个在玉米大豆间作中显著富集，141个在玉米单作中显著富集(P<0.05)。其中，玉米大豆间作中富集的OTUs主要分布在子囊菌门粪壳菌纲(Sordariomycetes)、担子菌门伞菌纲(Agaricomycetes)、壶菌门壶菌纲(Chytridiomycetes)、被孢霉门被孢霉纲(Mortierellomycotina)和担子菌门银耳纲(Tremellomycetes)；在玉米单作中富集的OTUs主要分布在子囊菌门虫囊菌纲(Lecanoromycetes)、子囊菌门座囊菌纲(Dothideomycetes)和子囊菌门散囊菌纲(Eurotiomycetes)。

图  3  玉米根际真菌差异OTUs分析

Figure  3.  Analysis of differential OTUs rhizosphere fungi in maize

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2.6   玉米大豆间作与玉米单作根际细菌和真菌差异菌属

对丰度前15位的属进行差异分析，结果(表4)显示：细菌中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽单孢菌属(Gemmatimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、溶杆菌属(Lysobacter)、硝化螺菌属(Nitrospira)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞杆菌属(Pseudomonas)在玉米大豆间作中的丰度显著高于玉米单作，而伯壳氏菌属(Burkholderia)、Bryobacter、鞘脂菌属(Sphingobium)和酸杆菌属(Acidibacter)的丰度显著低于玉米单作；真菌中被孢霉属(Mortierella)、壶菌属(Spizellomyces)、丝孢菌属(Scedosporium)、柄孢壳菌属(Podospora)和木霉菌属(Trichoderma)在玉米大豆间作中的丰度显著高于玉米单作，而镰刀菌属(Fusarium)、梭杆菌属(Monographella)和Solicoccozyma的丰度显著低于玉米单作。

表  4  玉米大豆间作与玉米单作属水平差异

Table  4.  Differences between maize/soybean intercropping and maize monocropping at genera level

细菌属水平分类 bacterial genera level	MM/%	MSI/%		真菌属水平分类 fung genera level	MM/%	MSI/%
鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas	1.72 b	2.03 a		未分类 unidentified	20.76 a	17.01 b
芽单孢菌属 Gemmatimonas	0.79 b	1.29 a		镰刀菌属 Fusarium	8.03 a	6.71 b
黄杆菌属 Flavobacterium	0.78 b	1.17 a		被孢霉属 Mortierella	0.72 b	4.97 a
Bryobacter	0.70 a	0.38 b		外瓶霉属 Exophiala	1.14 a	1.07 a
伯壳氏菌属 Burkholderia	3.82 a	0.01 b		梭杆菌属 Monographella	0.17 a	0.09 b
鞘脂菌属 Sphingobium	2.53 a	0.66 b		壶菌属 Spizellomyces	0.06 b	0.13 a
Rhizomicrobium	0.09 a	0.10 a		Solicoccozyma	0.03 a	0.00 b
溶杆菌属 Lysobacter	0.07 b	0.31 a		亚隔孢壳属 Didymella	0.28 a	0.23 a
Flavisolibacter	0.38 a	0.36 a		丝孢菌属 Scedosporium	0.01 b	1.15 a
硝化螺菌属 Nitrospira	0.32 b	0.64 a		毛壳菌属 Chaetomium	0.07 a	0.02 a
芽孢杆菌属 Bacillus	0.07 b	0.15 a		Humicola	0.00 a	0.01 a
酸杆菌属 Acidibacter	0.60 a	0.31 b		柄孢壳菌属 Podospora	0.05 b	0.67 a
假单胞杆菌属 Pseudomonas	0.24 b	0.37 a		木霉菌属 Trichoderma	0.01 b	0.05 a

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2.7   功能预测分析

使用FAPROTAX软件预测得到各样品根际微生物细菌的功能注释，结果(图4)显示：注释到参与土壤营养元素循环途径(如尿素降解、硝化作用、固氮作用、硝酸氨化和亚硝酸盐氨化和铁呼吸)的细菌OTU数量表现为玉米大豆间作处理高于玉米单作；注释到参与有机物降解途径(如木聚糖降解、纤维素降解和木质素降解)的细菌OTU数量也是如此，但几丁质降解途径相反。此外，注释到植物病原菌的细菌OTU数量表现为玉米单作高于玉米大豆间作处理。另一方面，注释到化能异养型和好氧化能异养型途径的细菌OTU数量表现为玉米大豆间作处理高于玉米单作，而厌氧自养型却相反，说明玉米大豆间作增加了根际微生物中好养型细菌比例，而厌氧型细菌比例降低，预示着玉米大豆间作可能对改良土壤结构和抑制土壤板结有较好的作用。

图  4  玉米根际细菌功能预测

Figure  4.  Function prediction of the rhizosphere bacteria in maize

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真菌GUNGuild数据库注释结果(图5)显示：注释到植物病原菌、内生植物病原菌和腐生植物病原菌的真菌OTU数量表现为玉米大豆间作低于玉米单作；而注释到木质腐生型、粪便腐生型、未定义腐生型、内生菌和从枝菌菌根真菌的真菌OTU数量表现为玉米大豆间作高于玉米单作。说明玉米与大豆间作能减少土壤中有害真菌如植物病原菌的含量，同时能增加有益真菌的含量。

图  5  玉米根际细菌真菌功能预测

Figure  5.  Function prediction of the rhizosphere fungi in maize

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3.   讨论

本研究通过高通量测序技术研究了玉米大豆间作对玉米根际微生物种群数量和结构的影响；微生物群落欧式距离的主成分分析结果显示：玉米大豆间作处理均改变了玉米根际细菌和真菌群落的组成和数量；玉米根际微生物多样性指数也说明玉米大豆间作与玉米单作相比能显著提高玉米根际微生物多样性指数。徐强等^[10]研究表明：玉米与线辣椒套作后可显著提高线辣椒根际微生物多样性指数，进而增强土壤微生物对单一碳源的利用能力。刘丽等^[9]利用实时荧光定量技术研究玉米大豆间作对玉米根际氨氧化微生物数量和结构的影响，结果显示：间作玉米根际中的总细菌丰度显著高于单作玉米根际，与本研究结果一致。玉米大豆间作导致玉米根际微生物多样性指数增加的原因可能是：豆科植物拥有天然的固氮系统，增加了土壤中的养分含量，从而提高了根际微生物的多样性。此外有研究表明：植物根际分泌的次生代谢产物对根际微生物群落结构具有选择塑造作用^[22]，玉米大豆间作后由于大豆根系分泌物对玉米根际微生物产生了影响，从而导致间作系统中玉米根际微生物多样性的增加。具体是哪种原因导致根际微生物多样性的提高还需进一步设置试验验证。

玉米大豆间作模式改变了土壤中微生物的数量组成，从而影响玉米的养分吸收和病虫害发生。有研究指出：烤烟花生间作与烤烟单作处理相比益生菌的丰度增加，烟草黑胫病病原菌数量降低^[23]。在本研究中，玉米大豆间作与玉米单作相比，玉米锈病、玉米灰斑病、玉米大斑病和玉米小斑病的病情指数显著降低。根际微生物细菌注释结果显示：在玉米大豆间作中变形菌门溶杆菌属、厚壁菌门芽孢杆菌属和假单胞菌门的数量与玉米单作相比显著增加。文献报道：溶杆菌^[24]和假单胞菌^[25]会产生吩嗪类抗生素次生代谢产物，对大多数病原细菌和真菌有很强的抑制作用；芽胞杆菌^[26]也可作为生防资源用来控制病害的发生。真菌注释结果显示：玉米间作处理后，引起玉米土传病害的镰刀菌属的丰度显著低于玉米单作处理。有研究表明：镰刀菌属是引起玉米茎腐病和穗腐病的病原菌^[27]。注释到木霉菌属的丰度间作处理显著高于玉米单作处理。木霉菌是一种应用悠久防治土传病害的生防真菌，已有报道可用于防治玉米茎腐病和玉米小斑病等土传病害^[28-30]。此外，本研究还发现：引起玉米小斑病的平脐蠕孢属在玉米间作中的相对丰度显著小于玉米单作，引起玉米灰斑病的尾孢菌属在玉米间作中的相对丰度显著低于玉米单作，而引起玉米大斑病的突脐蠕孢属则未检测到。但由于在本次试验中检测到这几个菌属的丰度均较低，误差较大，所以还需进一步设计这几个菌属的特异性引物来确认结果。细菌和真菌功能注释结果也显示：玉米大豆间作中注释到病原菌的OTU数量要低于玉米单作处理。

有研究已证实：间作模式能显著影响土壤养分含量，禾本科与豆科作物间作由于解除了氮抑制因而能提高豆科作物固氮能力，增加土壤氮素含量^[31]。在本研究中，玉米大豆间作产量为14022 kg/hm²，与单作相比增产2127.56 kg/hm²，产量显著提高。影响作物根际营养元素吸收的因素较多。一方面玉米大豆间作能增加一些直接参与养分循环的微生物丰度，如参与氮元素循环的硝化螺旋菌属和根瘤菌属微生物，功能注释也显示出玉米大豆间作与玉米单作相比拥有更高参与氮循环的丰度；另一方面，玉米大豆间作能增加一些具有分解能力的微生物。许多动植物死亡后遗体便留在土壤中，这些残体是地球营养元素循环的重要组成部分，植物想要利用这部分营养离不开土壤微生物的分解作用。本研究发现：玉米大豆间作中木聚糖降解、纤维素降解、木质素降解以及腐生型真菌功能的丰度要高于单作，说明玉米大豆间作后玉米根际微生物分解能力提高了，导致玉米产量也随之提高。

本试验所采用的玉米大豆间作行比为2∶2，刘朝茂等^[8]通过设置不同的玉米大豆行比(2∶2、2∶3和2∶4)发现2∶3的玉米大豆行比效果最好。但由于不同海拔、气候和品种都会对间作条件下玉米产量造成影响，因此，筛选最适合在云南山地推广种植的间作品种和间作方式将会是下一步研究重点。此外，本次试验根际微生物注释仅采用16S DNA进行，由于技术本身的局限性以及微生物组的复杂性可能会出现注释有误的情况，如同种菌属中不同菌种的功能并非完全一致，以及同属同菌种在不同寄主上发挥的功能也不同。为了避免这种情况的发生，下一步将采用宏基因组学技术一次获得样品中所有微生物基因组信息，以深入研究玉米大豆间作后根际微生物的功能变化。