鰤诺卡菌(Nocardia seriolae)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性丝状杆菌，以腐生为主，是一种兼性胞内病原菌^[1]。自1968年KARIYA等^[2]首次从日本鰤鱼上分离出鰤诺卡菌以来，发现其可感染日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)^[3]、鲐鱼(Scomber japonicus)^[4]、黑鲈(Lateolabrax japonicus)^[5]、鲶科鱼(Epinephelus spp.)^[6]、布氏鲳鰺(Trachinotus blochii)^[7]和银金鼓鱼(Scatophagus argus Linn.)^[8]等多种鱼类。近年来，在中国已有高体革鯻(Scortum barcoo)^[9]、乌鳢(Ophiocephalus argus Cantor)^[10]、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)^[11]、丝足鲈(Osphronemus goramy)^[12]和加州鲈^[13]等感染鰤诺卡菌，造成严重的经济损失，对中国水产养殖业造成较大威胁。

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是一种具有重要经济价值的淡水鱼类。自1983年引进中国以来，其养殖得以快速发展，2018年中国大口黑鲈年产量达49万t，已成为中国重要的淡水养殖鱼类之一。近年来，四川养殖大口黑鲈中流行一种以体表出血、溃烂和内脏多器官出现白色结节为病变特征的疫病，该疾病病情持续时间长，累计死亡率高达20%~30%，给养殖户带来严重损失。本研究从发病鱼体内分离到3株G⁺杆菌，通过表型特征测定、16S rDNA与hsp65基因序列分析鉴定3株分离菌均为鰤诺卡菌，并进行了病理损伤观察，以期为该疾病的诊断与防控提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

患病鱼采自四川大口黑鲈养殖场，体质量250~400 g；健康大口黑鲈，体质量(320±12.4) g，购自四川蒲江某大口黑鲈养殖场。

1.2   病原菌的分离与形态特性观察

对患病大口黑鲈进行剖检与观察，取具有明显结节的肝、脾、肾等组织进行涂片，革兰氏染色并观察。无菌条件下，从病鱼肝、脾、肾取样于BHIA划线接种，28 ℃恒温培养5 d，挑取优势菌落纯化培养，进行革兰氏染色与抗酸染色，观察菌体形态。

1.3   回归感染试验

将纯化得到的优势菌在脑心浸液培养基(BHI)培养后离心，菌体用无菌生理盐水分别洗涤3次，麦氏比浊法将细菌密度调整为1.0×10⁸CFU/mL，菌悬液的具体制备方法参考文献[14]。健康大口黑鲈于28 ℃水温暂养7 d后，分为感染组与对照组，每组10尾鱼。感染组每尾注射菌液0.2 mL，对照组注射等量生理盐水。接种后每天观察大口黑鲈的发病与死亡情况，连续观察21 d，对死亡鱼及时进行剖检和病原菌的再次分离与鉴定。

1.4   分离菌株表型特征与药物敏感性检测

使用细菌生化微量鉴定管，参照《常见细菌系统鉴定手册》^[15]对分离株进行生理生化特性的测定。药敏试验参照文献[14]测定，检测分离株对多西环素、红霉素、庆大霉素、青霉素、头孢噻呋、恩诺沙星、氧氟沙星与复方新诺明等8种药物的最小抑菌浓度(MIC)，并根据CLSI^[16]标准获得相应敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)的结果。

1.5   分离菌16S rRNA与hsp65基因序列测定与系统发育分析

参照文献[17-18]的方法，采用引物16S rRNA(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-TAGGCTACCTTGTTACGAC-3′)与hsp65 (F：5′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′；R：5′- CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′) PCR扩增分离菌16S rRNA和hsp65基因分别约1 500和400 bp的目的片段。PCR扩增产物，纯化回收，送上海生工生物工程有限公司测序。采用DNAstar软件的Multiple Sequence Aligment程序进行多序列比对，用MEGAX Neighbor-Joining法构建系统发育进化树。

1.6   组织病理学观察与电镜观察

取患病鱼的心、肝、脾、肾、头肾、肌肉和鳃等组织，用10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，分别进行革兰氏染色和HE染色，中性树脂胶封片，光学显微镜观察。电镜观察参照文献[17]。

2.   结果与分析

2.1   临床表现与剖检变化

患病大口黑鲈游动迟缓，上浮于水面，摄食量减少甚至不摄食，发病后每天均有不同数量的病鱼死亡，持续周期长达5~6个月，累积死亡率高达20%~30%。病鱼体表溃烂、出血(图1a、b)，鳍条充血、出血。剖检发现：心、肝、脾、肾和头肾等组织表面出现数量、大小不等的白色结节(图1c、d)。

图  1  病鱼的大体病变

注：a) 体表溃疡灶；b) 体表出血；c) 肝脏及脂肪上点状结节；d) 心脏表面出现白色结节。

Figure  1.  Gross lesions of diseased M. salmoides

Note: a) ulcer focus in surface; b) body surface hemorrhage; c) punctate nodules on liver and fat; d) white nodules appear on the surface of the heart.

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2.2   病原菌的分离与形态观察

病鱼肝、脾、肾涂片，革兰氏染色镜检发现其内有G⁺杆菌(图2a)。无菌条件下，分别从来自3个不同养殖区具有明显临床症状的大口黑鲈的内脏组织中分离得到3株优势菌株(DY01、XJ01和PJ01)。3株分离株生长形态相似，在BHI平板上形成淡黄色或白色、表面粗糙易碎、干燥、边缘不整齐的菌落(图2b)。染色镜检发现3株分离菌均为G⁺菌，菌体呈长杆状或球杆状，或细长分枝状，具有弱抗酸性(图2c)。

图  2  病原菌形态学观察

注：a) 肾脏结节涂片可见大量革兰氏阳性分枝状杆菌；b) 分离菌在固体培养基上的菌落形态；c) 细菌抗酸染色形态，具有弱抗酸性。

Figure  2.  Morphological observation of the pathogen

Note: a) renal nodule smears revealed bacterial filament masses stained; b) colony morphology of isolated bacteria on solid medium; c) micrograph of bacteria in acid fast staining, weak acid resistance.

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2.3   回归感染试验

3个注射感染组大口黑鲈在接种感染第3天表现为游动缓慢、反应迟缓，在接种感染第11天开始出现死亡，感染组鱼在18 d内全部死亡(图3)。病鱼表现出体表发红、鱼体上浮，部分鱼体鳍条充血，病鱼内脏见白色结节与自然发病鱼相似。空白对照组无任何异常。从人工感染发病死亡的大口黑鲈体内再次分离细菌，获得与感染接种菌形态、理化特性与16S rDNA基因序列一致的菌株。

图  3  大口黑鲈存活数统计

Figure  3.  Survival number of M. salmoides

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2.4   分离菌株的表型特征与药物敏感性检测

分离菌株的生理生化特性具体见表1。3株分离株与鰤诺卡菌ATCC43993的生理生化特性^[9]基本一致。由表2可知：3株分离菌株对多西环素和红霉素和庆大霉素均敏感，对青霉素和头孢噻呋均耐药，但在对恩诺沙星、氧氟沙星与复方新诺明的敏感性上存在一定差异。

表  1  从自然发病鱼分离的3株菌株的生理生化特性

Table  1.  Biochemical and physiological characteristics of 3 isolated strains from diseased M. salmoides

项目items		菌株strains					项目items		菌株strains
		N. seriolae ATCC43993	DY01	XJ01	PJ01				N. seriolae ATCC43993	DY01	XJ01	PJ01
生长温度/ ℃	25	+	+	+	+		酶活性 enzymatic activity	过氧化氢酶 catalase	−	−	−	−
	37	+	+	+	+			氧化酶 oxidase	−	−	−	−
	45	−	−	−	−			脲酶 urease	−	−	−	−
水解活性 hydroly activity	腺嘌呤 adenine	+	+	+	+		唯一碳源 sole carbon sources	柠檬酸盐 citrate	−	−	−	−
	七叶灵 aesculin	−	−	−	−			甘露醇 mannitol	+	+	+	+
	酪蛋白 casein	−	−	−	−			山梨醇 sorbitol	−	−	−	−
	弹性蛋白 elastin	−	−	−	−			麦芽糖 maltose	−	−	−	−
	明胶 gelatin	+	+	+	+			鼠李糖 rhamnose	−	−	−	−
	黄嘌呤 xanthine	−	−	−	−			海藻糖 trehalose	−	−	−	−
	淀粉 starch	−	−	−	−
	酪氨酸 tyrosine	−	−	−	−
注：“+”表示阳性；“−”表示阴性。 Note:“+” indicates positive; “−” indicates negative.

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表  2  8种抗生素对分离菌株的最小抑菌质量浓度

Table  2.  The results of minimal inhibitory mass concentration of 8 antibiotics

药物antibiotic	菌株质量浓度 (µg·mL−1) strain mass concentration				药物antibiotic	菌株质量浓度 (µg·mL−1) strain mass concentration
	DY01	XJ01	PJ01			DY01	XJ01	PJ01
多西环素 doxycvcline	4(S)	0.5(S)	4(S)		头孢噻呋 ceftiofur	256(R)	16(R)	16(R)
红霉素 erythromycin	0.12(S)	0.12(S)	0.12(S)		恩诺沙星 enrofloxacin	8(R)	1(I)	2(I)
庆大霉素 gentamicin	1(S)	4(S)	2(S)		氧氟沙星 ofloxacin	32(R)	4(I)	8(R)
青霉素 penicillin	128(R)	16(R)	32(R)		复方新诺明 trimethoprim/ sulfemethoxazole	0.5/9.5(S)	4/76(R)	0.25/4.8(S)
注：R. 抗性；S. 敏感。 Note: R. resistance; S. susceptible.

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2.5   分离菌16S rDNA与hsp65基因序列测定与系统发育分析

3株菌的16S rRNA基因与hsp65基因经PCR扩增获得预期大小分别约为1500和400 bp的片段，纯化回收产物送生工生物工程(上海)有限公司测序。获得的所有序列经编辑上传至GenBank获得基因登录号，分别为MK045217、MK045209、MK045204、MH973629、MH973625和MH920599。将3株菌的16S rDNA、hsp65基因序列分别与GenBank已知核酸序列进行BLAST比对分析，结果显示：3株分离菌株均与GenBank上鰤诺卡菌的对应基因序列的同源性最高。在以3株分离菌和诺卡菌属其他模式菌株的16S rDNA序列与hsp65序列分别构建的统发育树上，3株分离菌均与鰤诺卡菌(N. seriolae)聚为一族(图4、5)。

图  4  基于16S rDNA基因序列构建的3株分离菌与相关菌株的系统发育树

Figure  4.  Phylogenetic tree of 3 strains 16S rRNA gene sequence and its relatives

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图  5  基于hsp65基因序列构建的3株分离菌与相关菌株的系统发育树

Figure  5.  Phylogenetic tree of 3 strains hsp65 gene sequence and its relatives

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2.6   组织病理学观察与电镜观察

鰤诺卡菌自然感染大口黑鲈的组织病理学主要表现为全身多组织器官内出现慢性肉芽肿结节，并伴随着出血、变性、坏死和炎症反应等多种病理变化。各组织的主要病理变化如下。

心：病鱼心肌纤维肿胀，颗粒变性、水泡变性，甚至坏死、断裂、溶解(图6a)，坏死区大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，上皮样细胞聚集，部分区域形成1成熟的肉芽肿，心外膜增厚，并伴有大量淋巴细胞浸润(图6b)。

图  6  大口黑鲈感染鰤诺卡菌的病理组织学观察结果

注：a) 上皮样细胞聚集形成结节(↑)，心肌纤维溶解(★)；b) 心外膜增厚，淋巴细胞浸润(★)；c) 肝细胞灶性坏死溶解，中性粒细胞与巨噬细胞浸润(↑)；d) 肝小叶中肉芽肿结节；e) 脾窦淤血，坏死区上皮样细胞聚集；f) 肾实质中的肉芽肿结节(↑)，肾小管上皮坏死，增生的结缔组织取代肾单位；g) 头肾实质细胞坏死、溶解(★)；h) 鳃小片形成的结节(★)；i) 肌纤维溶解，炎症细胞浸润，肌间结缔组织增生。

Figure  6.  Histopathological lesions of M. salmoides infected by N. seriolae

Note: a) aggregation of epithelioid cell (↑), myocardial fibrinolysis (★); b) epicardial thickening and lymphocyte infiltration (★); c) hepatocyte necrosis, infiltration of neutrophils and macrophages; d) typical granuloma with necrotic center found in the liver; e) hemorrhage of splenic sinus and infiltration of epithelioid cells in necrotic area; f) granuloma in the kidney (↑), necrosis of renal tubular epithelium and renal unit replaced by proliferated fibrous tissue; g) necrosis and lysis of parenchymal cells in the head kidney(★); h) necrotic nodules in gill lamella (★); i) dissolution of muscle fibers, inflammatory cell infiltration and fibrous connective tissue proliferation between muscle fibers.

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肝：肝淤血，肝细胞变性、水泡变性、坏死，坏死溶解区及周围大量中性粒细胞、巨噬细胞浸润(图6c)，肝小叶内可见大量肉芽肿结节形成(图6d)，血管周围中性粒细胞与巨噬细胞浸润。

脾：脾窦淤血、出血，坏死区上皮样细胞聚集(图6e)，严重病例脾实质细胞(包括淋巴细胞和网状细胞)大量崩解、坏死，数量明显减少，坏死区中性粒细胞浸润，巨噬细胞大量增生，多个肉芽肿结节形成甚至融合在一起。

肾：肾间质造血组织坏死、溶解，大量巨噬细胞与中性粒细胞浸润；肾小球间质系膜细胞增生，系膜区增宽，肾小管上皮细胞广泛性颗粒变性、坏死，肾组织中可见多个肉芽肿结节形成，肉芽肿周围大量纤维结缔组织增生取代肾单位(图6f)。

头肾：头肾淋巴组织坏死，淋巴索排列紊乱，血窦淤血，坏死区及周围大量上皮样细胞、巨噬细胞和中性粒细胞增生，形成大量结节(图6g)。

鳃：鳃丝毛细血管扩张，充血，鳃小片上皮细胞水肿、增生，使相邻的鳃小片或鳃丝发生粘连，同时有大量的中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润，鳃丝或鳃小片上可见肉芽肿的形成(图6h)，鳃弓处有坏死结节，中性粒细胞和淋巴细胞浸润。

肌肉：肌纤维疏松、水肿、变性、横纹消失，有的甚至断裂溶解，呈絮状(图6i)，皮下和肌纤维间有肉芽肿形成，纤维结缔组织增生，淋巴细胞浸润。

组织切片经革兰氏染色后，观察发现在肝、脾、肾、心等组织的肉芽肿结节中分布着大量形态相似，呈革兰氏阳性、分枝杆状的菌体(图7a)。对感染鰤诺卡菌大口黑鲈的肝、脾、肾、鳃等组织进行透射电镜观察，在肝、脾、肾等组织中观察到大量杆状细菌，脾脏中多个菌体形成囊状结构(图7b)，肝细胞凋亡，形成凋亡小体(图7c)。

图  7  组织切片革兰氏染色与电镜观察

注：a) 肝脏肉芽肿中分枝状革兰氏阳性杆菌；b) 脾脏中菌体形成的囊状结构；c) 肝细胞凋亡，形成凋亡小体。

Figure  7.  Gram staining of tissue sections and electron microscopic observation

Note: a) branched Gram-positive bacteria in hepatic granuloma; b) bacteria in necrotic cells of spleen; c) hepatocyte apoptosis and apoptotic bodies.

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3.   讨论

现有研究表明：引起鱼类出现内脏结节状病变的原因包括寄生虫^[19]、立克次体^[20]、某些真菌和卵菌^[21]，以及分支杆菌^[22]、鲑肾杆菌^[23]和诺卡菌^[24]等，其中诺卡菌属的鰤诺卡氏菌(N. seriolae)、星状诺卡氏菌(N. asteroides)、粗形诺卡氏菌(N. crassostreae)和杀鲑诺卡氏菌(N. salmonicida)则是引起鱼类内脏结节病较为常见的病因^[24]。鰤诺卡氏菌可引起黄尾鰤(Seriola quinquerudiuta)、卵形鲳鲹^[25]、乌鳢^[26]、丝足鲈^[12]和加州鲈^[13]等鱼类的结节病。本研究从四川大口黑鲈养殖地采集病料，从症状主要表现为内脏结节的自然感染患病的大口黑鲈体内分离到3株病原菌，并通过表型特征、16S rRNA与hsp65基因系统发育分析鉴定分离的3株菌均为鰤诺卡氏菌。回归感染试验证实了分离菌株的致病性，表明四川省养殖大口黑鲈以体表溃疡、内脏器官出现白色结节为特征的疫病病原为鰤诺卡氏菌。

在本研究中，患病大口黑鲈特征病变主要有体表出血、溃疡，鳍条出血，内脏多器官出现大小不等的结节，与鱼类鰤诺卡氏菌感染病变相似^[9]。组织病理上，鰤诺卡氏菌感染大口黑鲈会对其肝、肾、脾、心、头肾、鳃和肌肉等多个组织器官造成不同程度的损伤。其中肾脏组织的肉芽肿病变与蒋依依等^[13]在加州鲈肾脏中发现的肉芽肿状病变一致。本研究中病鱼主要表现为全身多组织器官内出现慢性肉芽肿结节，显微镜下肉芽肿结节一般分为3层，由内到外依次为：干酪样坏死、上皮样细胞以及外围聚集的淋巴细胞与成纤维细胞，未观察到多核巨噬细胞，与研究报道^[21]鱼类一般不形成多核巨噬细胞一致。病鱼鳃小片表现为炎性水肿、增生及融合，严重者相邻鳃小片、鳃丝甚至粘连在一起，呈棒状化。鳃小片的增生、融合，造成鱼体呼吸障碍、组织缺氧，当水温升高、水溶氧量降低或组织代谢旺盛时，病鱼则因缺氧大量死亡^[21]。因此，夏季是鰤诺卡菌病发病高峰期。另外，有研究表明：肉芽肿形成是机体控制寄生性细菌如分枝杆菌、诺卡菌等传播扩散的重要措施^[27]。本研究发现：肉芽肿内存在大量完整的鰤诺卡氏菌菌体，表明肉芽肿并不能完全消除并杀死细菌；反而有可能为鰤诺卡氏菌提供了栖息保护地，其外的炎症吞噬细胞无法进入肉芽肿内杀死鰤诺卡氏菌^[28]，给鰤诺卡氏菌在鱼体的持续感染提供了条件，同时也为临床药物治疗带来困难^[29]。

本研究采用微量稀释法对3株分离菌株的药物敏感性进行了初步研究，结果发现分离株DY01、XJ01和PJ01对多西环素、红霉素和庆大霉素均敏感，其中多西环素对3菌株的MIC分别为4、0.5和4 µg/mL，表明来源于不同区域的病原菌在药物敏感程度上存在差异。据报道，许多病原菌的MIC一直处于变化状态^[30]，因此，持续评估鰤诺卡氏菌的MIC将有助于确定抗生素的最佳剂量并可有效减少残留量^[31]。另外，由于鰤诺卡氏菌广泛分布于水体环境中，其感染鱼类往往与水质、养殖密度和应激等有关^[24]。因此，在水质和底质改良、保持适宜的养殖密度和减少应激等养殖环境控制与饲养管理上应进行相应的改善工作以降低鰤诺卡菌病的发生风险。