不同前作对植烟土壤养分含量、酶活性及细菌群落结构的影响
Effect of Different Previous Crops on the Nutrient Content, Enzyme Activity and Bacterial Community Structure in Tobacco Growing Soil
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同一作物长期连续种植会造成土壤养分异常积累或过度消耗，根系的毒害分泌物增多，病原微生物迅速繁衍，土壤微生物多样性改变以及种群结构失衡，最终导致土壤调控能力减弱，产生连作障碍[1-2]。轮作可以适当减缓连作障碍的发生，前茬作物的根系分泌物和残留物对土壤微生物的多样性、群落结构和组成产生重要影响[3]，是生态防治土传病害的重要手段。在烟草生产上，可以通过合理轮作改善土壤质量达到增产提质的目的。毛倪寿等[4]研究表明：小麦和油菜根系浸提液对烟株生长有促进作用，能促进生长发育，提高烟叶质量和产量。郭云周等[5]通过红壤旱地上2年的定位试验表明：翻压等量绿肥(光叶紫花苕)相比化肥减量，不仅有利于提高烟草产量，更有利于提高烟草品质。
不同前作对烟田土壤物理、化学、酶活性和微生物学性质的影响不一样。禚其翠等[6]研究表明：前茬种植大蒜与绿肥均能在一定程度上改善烟田土壤有效磷、速效钾及可溶性有机碳含量以及烟叶产量。陈丹梅等[7]研究表明：烤烟—苕子—水稻轮作能够提高烟田土壤的蔗糖酶、脱氢酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性及细菌群落多样性，有益于保持或提高土壤肥力和土地生产力。选择合适的前作有利于改善土壤的生产力与生态功能，是保持土地生产力和可持续发展的重要措施，而以往的研究着重于前作对根际土壤理化性质、酶活性和微生物数量的影响，较少关注烟田土壤中微生物群落的变化和根际土壤理化性质、酶活性与微生物群落的相关性。因此，本研究以凉山州不同前作烟田为对象，利用化学、酶学分析及16S多样性测序技术，分析前作荞麦、油菜、小麦和绿肥耕种后土壤的养分、酶活性及细菌群落结构组成，研究不同前作对烟田土壤养分、酶活性和细菌群落的影响，为轮作调控技术提供更丰富的理论依据和指导。
1. 材料与方法
1.1 试验田概况
试验田位于四川省凉山彝族自治州，N26°50′，E102°17′，海拔1 944 m，红壤黏土。前作荞麦、油菜、小麦和绿肥烟田分别编号FB、FR、FW和FG烟田，种植烟草品种均为云烟87，轮作7年。每个处理面积222 m2，荞麦秸秆、油菜秸秆和小麦秸秆均不翻压烟田，绿肥苕子秸秆翻压到烟田。荞麦和油菜在9月下旬种植，苕子和小麦在10月下旬种植，荞麦在12月下旬收割，油菜、苕子和小麦在次年3月收割。在烤烟种植季节，行距约1 m，株距约0.5 m，每667 m2种植约1000株，基肥由m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=10∶15∶20烤烟专用肥提供，用量30 kg/667 m2，追肥m(N)∶m(K2O)=9∶35烤烟专追肥提供，用量20 kg/667 m2。油菜和荞麦种植季节氮磷分别由尿素和普钙提供，苕子和小麦种植季节氮磷分别由尿素和烤烟专用用肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=10∶15∶20]提供，4种前作全部的氮和磷均作基肥，全部基施。
1.2 烟田土壤的采集与处理
于前作收获后、烟株移栽前采集土样，采用五点取样法，去掉表层，采5~20 cm耕层土壤，混合后取土样总量不少于1 kg，每块烟田取3个平行样，每个样品过筛除去根等杂质后取少量土壤装入15 mL带盖的离心管中，储存于有冰袋的保温箱中，带回实验室−20 ℃保存，并及时送到上海美吉生物医药科技有限公司进行多样性测序与分析。取部分土壤风干，用于常规分析。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 土壤理化性质测定方法
土壤pH值采用电位法测定；有机质采用重铬酸钾—油浴法测定；全氮用硫酸消解—凯氏定氮法测定；速效钾用乙酸铵提取—原子吸收法测定；采用同一消解法测定全磷和全钾；有效磷用碳酸氢钠提取—钼锑抗比色法测定；碱解氮用碱解扩散法测定[8]。
1.3.2 土壤酶活性测定方法
蛋白酶的测定采用福林试剂比色法[9]；蔗糖酶的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法[10]；脲酶的测定方法为靛酚蓝比色法[10]；过氧化氢酶活性测定采用滴定法，酶活性以单位土重消耗高锰酸钾毫升数表示[9]；磷酸酶采用对硝基苯磷酸二钠比色法测定[11]。
1.3.3 微生物多样性分析测定
由上海美吉生物医药科技有限公司对根际土壤微生物进行16S多样性测序；根据E.Z.N.A.® soil试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA质量浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶泳检测DNA提取质量；用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对V3~V4可变区进行PCR扩增。Illumina Miseq测序，使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor™-ST (Promega, USA) 进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina, San Diego, USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300文库。用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序
1.4 数据处理
试验数据均以3个值的“平均值±标准差”表示，并采用Excel 2010软件进行统计处理。利用IBM SPSS Statistics 21软件进行独立样本T检验，差异显著性水平为P<0.05。多样性基因测序由上海美吉生物医药科技有限公司信息平台相应软件进行分析，原始数据上传至NCBI数据库中，原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件 (version 7.1)，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，使用UCHIME软件剔除嵌合体，利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，设置比对阈值为70%。利用Mothur (version v.1.30.1)软件计算Chao、ACE、Shannon和Sobs等4种常用的群落α多样性指数，测序深度用覆盖率(coverage)表示，利用Excel 2010进行初处理和制图，采用IBM SPSS Statistics 21软件进行统计分析。基于tax_summary_a文件夹中的数据表，利用R语言工具绘制在门水平和属水平上的群落柱状图，Qiime计算β多样性距离矩阵，然后用R语言作层级聚类分析，利用R语言的VEGAN数据包对根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子进行冗余分析(RDA)。利用R (pheatmap package)进行根际土壤细菌群落结构多样性和丰度与土壤环境因子的Spearman相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 不同前作烟田土壤理化性质和酶活性
由表1可知：4种前作烟田土壤pH值在4.50~7.10，前作小麦土壤最高，油菜最低，且小麦和绿肥相差不大。有机质、全氮和碱解氮含量在FR烟田土壤最高，FG和FW烟田的次之，FB烟田最低。全钾和有效磷含量同样是FR烟田最高，但FW烟田较低。速效钾含量则是FG烟田最高，而在FR烟田最低。
表 1 烟田土壤的理化性质Table 1. Physicochemical properties of tobacco field soil with different previous crops前作
previous
crops含量 content pH 有机质/
(g·kg−1)
organic matter全氮/
(g·kg−1)
total nitrogen碱解氮/
(mg·kg−1)
alkaline nitrogen全磷/
(g·kg−1)
total phosphorus有效磷/(mg·kg−1)
available phosphorus全钾/
(g·kg−1)
total potassium速效钾/(mg·kg−1)
available potassiumFB 6.26±0.01 b 19.68±0.48 b 0.76±0.12 b 47.95±0.49 b 0.96±0.01 a 78.62±6.98 a 19.09±0.71 c 210.91±6.79 a FR 4.50±0.03 c 30.04±0.32 a 1.62±0.16 a 143.50±7.92 a 0.57±0.00 d 88.09±5.93 a 29.09±0.71 a 147.21±7.78 b FG 6.53±0.07 ab 27.42±2.09 ab 1.12±0.00 a 66.50±3.96 b 0.65±0.00 b 62.17±0.57 a 23.59±0.00 b 240.10±10.98 a FW 7.10±0.14 a 21.51±0.16 b 1.04±0.12 ab 58.45±8.41 b 0.60±0.00 c 44.41±1.10 a 19.70±0.00 c 155.34±2.80 b 注：FB. 荞麦；FR. 油菜；FG. 绿肥；FW. 小麦；同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平(P<0.05)；下同。
Note: FB. fagopyrum; FR. rape; FG. green manure; FW. wheat; after the same columns of data, the difference between different lower-case letters was significant (P<0.05); the same as below.由表2可知：蛋白酶、脲酶和磷酸酶活性在4种前作烟田土壤存在显著差异，而蔗糖酶和过氧化氢酶活性在4种前作烟田土壤的差异不显著。蛋白酶在FG烟田土壤的活性最高，其次是FR烟田和FB烟田，FW烟田土壤的活性最低。脲酶和蔗糖酶在FW烟田土壤的活性最高，在FB烟田的活性最低。磷酸酶在FG烟田的活性最高，在FR烟田的活性最低。
表 2 烟田土壤酶的活性Table 2. Activities of soil enzymes in tobacco fields with different previous crops前作
previous crops酶活性 enzyme acfivity 蛋白酶/
(μg·g−1·d−1)
protease脲酶/
(μg·g−1·d−1)
urease蔗糖酶/
(mg·g−1·d−1)
sucrase过氧化氢酶/
(mL·g−1)
hydrogen peroxide磷酸酶/
(μg·g−1·h−1)
phosphataseFB 364.74±3.38 b 126.02±8.83 b 57.20±7.57 a 9.84±0.09 a 92.01±5.52 c FR 373.98±4.76 b 148.63±7.77 b 69.34±14.33 a 8.38±0.09 a 40.79±14.66 c FG 709.02±7.03 a 405.82±119.72 ab 75.92±32.40 a 9.69±0.04 a 306.60±0.65 a FW 181.63±2.65 c 736.55±2.97 a 87.55±42.01 a 10.03±0.01 a 117.42±4.91 b 2.2 不同前作烟田土壤细菌群落α多样性比较
由表3可知：样本土壤细菌群落的覆盖率均达到94%以上，结果可真实反映环境中细菌群落结构。烟田土壤细菌群落的α多样性指数中Sobs、ACE和Chao可表示土壤样本细菌的总数，4种前作土壤细菌总数大小为：FB>FW>FG>FR；Shannon指数反应土壤细菌的多样性，其大小为：FW>FR>FB>FG。表明FB烟田土壤细菌丰度最高，其次是FW烟田，而FW烟田土壤细菌种类最多且含量均匀，即多样性最高。
表 3 烟田土壤细菌群落α多样性Table 3. The α diversities of soil bacterial communities in tobacco fields with different previous crops前作previous crops Sobs Shannon ACE Chao 覆盖率/% coverage FB 2850±85.50 a 6.582±0.04 b 4112±120.94 a 4086±190.15 a 94.80±0.00 FR 2227±55.37 c 6.605±0.05 b 2925±103.36 c 2922±142.80 c 96.65±0.00 FG 2584±65.02 b 6.322±0.10 c 3630±71.49 b 3602±55.03 b 95.50±0.00 FW 2702±86.93 ab 6.795±0.04 a 3634±93.22 b 3659±132.45 b 95.64±0.00 2.3 不同前作烟田土壤细菌的群落结构
2.3.1 土壤细菌群落结构相似性分析
不同前作烟田土壤细菌群落在门水平和属水平上的层级聚类分析(图1)发现：4种轮作模式烟田土壤细菌群落结构具有差异，在门水平和属水平上，FB烟田和FG烟田细菌群落结构都比较相似，且在属水平上，FR与另外3种前作烟田土壤细菌群落差异较大。
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图 1 土壤细菌群落门水平(a)和属水平 (b)层级聚类分析注：FB. 荞麦；FR. 油菜；FG. 绿肥；FW. 小麦；数字代表每个处理的3个平行样。Figure 1. Cluster analysis of phylum level (a) and genus level (b) of soil bacterial communityNote: FB. fagopyrum; FR. rape; FG. green manure; FW. wheat; numbers represent three parallel samples for each treatment.2.3.2 土壤细菌群落结构在门水平的分析
不同前作烟田土壤细菌群落结构在门水平上的分布见图2。4种前作烟田共检测出36门菌，其中FB烟田32门，FR烟田30门，FW烟田30门，FG烟田27门。平均相对丰度高于1%的菌门共有8门，依次是Actinobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes和Saccharibacteria，其中Actionbacteria的相对丰度最高，占总量的26.87%~45.21%，平均相对丰度为35.81%，Proteobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria的平均相对丰度依次为27.57%、12.68%和8.06%，因前作不同而异。
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图 2 不同前作烟田土壤细菌群落门水平结构分布Figure 2. Distribution of soil bacterial community structure in phylum level of tobacco fields with different previous crops2.3.3 土壤细菌群落结构在属水平的分析
不同前作烟田土壤细菌群落结构在属水平上的分布见图3。4种前作烟田共检测出899属菌，其中FB烟田770属，FR烟田597属，FG烟田670属，FW烟田654属。FB烟田土壤相对丰度较高的5属依次是Streptomyces、unclassified_f_Micrococcaceae、Sphingomonas、norank_o_Gaiellales和Nocardioides，相对丰度分别为4.22%、4.03%、3.55%、2.88%和2.87%；FR烟田土壤相对丰度较高的5属依次是norank_o_Gaiellales、Acidothermus、norank_f_Acidobacteriacede_Subgroup_1_、norank_o_JG30-KF-AS9和Rhodanobacter，相对丰度分别为4.43%、3.07%、2.57%、2.54%和2.44%；FG烟田土壤相对丰度较高的5属依次是unclassified_f_Micrococcaceae、Streptomyces、Roseiflexus、Sphingomonas和Nocardioides，相对丰度分别为10.05%、6.22%、3.01%、2.30%和1.79%；FW烟田土壤相对丰度较高的5属依次是norank_c_Acidobacteria、unclassified_f_Micrococcaceae、Roseiflexue、Bacillus和Streptomyces，相对丰度分别为7.38%、4.33%、2.93%、2.62%和2.58%。其中unclassified_f_Micrococcaceae、Streptomyces、norank_c_Acidobacteria、norank_o_Gaiellales、Sphingomonas和Roseiflexus在4种前作烟田土壤的平均相对丰度超过2%，分别为5.52%、3.85%、3.24%、2.74%、2.69%和2.00%。
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图 3 不同前作烟田土壤细菌属水平群落结构分布Figure 3. Distribution of soil bacterial community structure in genus level of tobacco fields with different previous crops由表4可知：Bradyrhizobium、Rhizobium和Paenibacillus在FB烟田的相对丰度最高，Streptomyces和Pseudomonas 在FB烟田的相对丰度分别为4.217%和0.238%，仅次于其在FG烟田的相对丰度，同样Mycobacterium在FB烟田的相对丰度为0.846%，仅次于其在FR烟田的相对丰度。Bacillus在FB烟田的相对丰度为1.609%，仅次于其在FW烟田的相对丰度。
表 4 不同前作烟田土壤功能菌的相对丰度Table 4. Relative abundance of soil functional bacteria in different tobacco fields% 益生菌 vprobiotics FB FR FG FW 链霉菌属 Streptomyces 4.217±0.51 0.823±0.11 6.222±2.92 2.583±0.36 短根瘤菌属 Bradyrhizobium 1.937±0.26 1.927±0.14 1.168±0.29 0.857±0.15 芽孢杆菌属 Bacillus 1.609±0.09 1.147±0.10 0.952±0.10 2.619±0.66 分枝杆菌属 Mycobacterium 0.846±0.06 1.114±0.15 0.439±0.09 0.439±0.15 根瘤菌属 Rhizobium 0.670±0.07 0.078±0.02 0.604±0.10 0.311±0.11 类假单胞菌属 Pseudomonas 0.238±0.19 0.052±0.03 0.616±0.14 0.136±0.18 芽孢杆菌属 Paenibacillus 0.249±0.02 0.208±0.00 0.102±0.03 0.240±0.05 2.4 不同前作烟田细菌群落与环境因子的关系
2.4.1 烟田土壤细菌群落与环境因子的RDA分析
由图4a可知：2个坐标轴共解释细菌物种和环境因子总方差的90.00%，能较好地反映土壤环境因素对土壤细菌群落结构的影响。土壤全磷含量(P=0.041)对土壤细菌群落结构正相关且影响达到显著水平，速效钾含量(P=0.001)与细菌群落结构极显著负相关。由图4b可知：2个坐标轴共解释80.20%的细菌群落变化。土壤pH值(P=0.001)、有效磷含量(P=0.001)和速效钾含量(P=0.001)对土壤细菌群落影响达到极显著水平，其中pH、有效磷含量是极显著负相关，速效钾含量为极显著正相关，碱解氮含量(P=0.013)对土壤细菌群落的影响为显著正相关。
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图 4 门分类水平(a)和属分类水平(b)土壤细菌群落与环境因子的RDA分析注：TN. 全氮；AN. 碱解氮；TP. 全磷；AP. 有效磷；TK. 全钾；AK. 速效钾；organic. 有机质。Figure 4. RDA analysis of soil bacterial communities and environmental factors on phylum (a) and genus (b) levelsNote: TN. total nitrogen; AN. alkali hydrolysis nitrogen; TP. total phosphorus; AP. available phosphorus; TK. total potassium; AK. available potassium; organic. organic matter.2.4.2 土壤细菌群落优势菌与环境因子的关系
由表5可知：不同前作烟田土壤细菌群落包含8个主要细菌门和6个主要细菌属。在门水平上，Actinobacteria与土壤速效钾含量极显著正相关；Proteobacteria与有机质、全钾和碱解氮含量显著负相关；Chloroflexi与碱解氮含量极显著正相关，与全磷含量极显著负相关；Acidobacteria与速效钾含量极显著负相关；Firmicutes与速效钾极含量显著负相关；Bacteroidetes与pH值极显著正相关，与有效磷含量极显著负相关；Saccharibacteria与速效钾和全磷含量极显著负相关。在属水平上，unclassified_f_Micrococcaceae与土壤有效磷含量显著负相关，与速效钾含量极显著正相关；Streptomyces与速效钾和全磷含量极显著正相关；norank_c_Acidobacteria与有效磷含量值极显著负相关，与pH显著正相关；norank_o_Gaiellales与pH值极显著负相关，与有效磷含量极显著正相关；Sphingomonas与有机质、全氮、碱解氮和全钾含量极显著负相关，与全磷含量极显著正相关；Roseiflexus与有效磷含量极显著负相关，与pH值极显著正相关。
表 5 烟田土壤主要细菌与土壤环境因子的Spearman相关性Table 5. Spearman correlation between main soil bacteria and soil environmental factors in tobacco fields菌门(属) phylum (genus) pH Organic TN AN TP AP TK AK 门水平phylum level 放线菌门Actinobacteria −0.077 −0.077 −0.192 −0.126 0.587* 0.098 −0.071 0.755*** 变形菌门Proteobacteria 0.168 −0.643* −0.541 −0.657* 0.517 −0.056 −0.631* 0.182 绿弯菌门Chloroflexi −0.231 0.699* 0.698* 0.755*** −0.867*** 0.126 0.674* −0.629* 酸杆菌门Acidobacteria −0.035 0.126 0.157 0.210 −0.650* −0.007 0.135 −0.818*** 厚壁菌门Firmicutes −0.420 0.371 0.445 0.371 0.650* 0.399 0.355 −0.902*** 拟杆菌门Bacteroidetes 0.853*** −0.252 −0.210 −0.259 0.287 −0.832*** −0.255 0.622* 芽单胞菌门Gemmatimonadetes 0.517 −0.294 −0.185 −0.280 −0.112 −0.503 −0.248 −0.189 螺旋体菌门Saccharibacteria −0.245 0.294 0.402 0.378 −0.741*** 0.238 0.277 −0.853*** 属水平genue level 微球菌科未分级菌属unclassified_f_Micrococcaceae 0.559 −0.273 −0.367 −0.301 0.510 −0.594* −0.255 0.776*** 链霉菌属Streptomyces 0.336 −0.510 −0.566 −0.531 0.818*** −0.301 −0.489 0.930*** 酸杆菌纲未知菌属norank_c_Acidobacteria 0.692* −0.573 −0.584* −0.483 0.217 −0.832*** −0.617* 0.196 盖勒氏菌目未知菌属norank_o_Gaiellales −0.888*** 0.364 0.342 0.315 −0.161 0.972*** 0.397 −0.385 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas 0.343 −0.909*** −0.883*** −0.895*** 0.860*** −0.231 −0.880*** 0.601** 玫瑰弯菌属Roseiflexus 0.762** −0.252 −0.274 −0.252 0.301 −0.832*** −0.270 0.629* 注：TN. 全氮；AN. 碱解氮；TP. 全磷；AP. 有效磷；TK. 全钾；AK. 速效钾；organic. 有机质；“*”为0.01<P≤0.05，“**”为0.001< P≤0.01，“***”为P≤0.001。
Note: TN. total nitrogen; AN. alkali hydrolysis nitrogen; TP. total phosphorus; AP. available phosphorus; TK. total potassium; AK. available potassium; organic. organic matter.3. 讨论
土壤养分是衡量土壤质量的重要指标，有机质是土壤微生物的碳源和氮源[12]，其含量与前作的根系分泌物和有机肥残存有关[13]。不同前作由于耕作管理、根系分泌物及残留物等差异，使得其对烟田土壤理化性质的影响各不相同。黄新杰等[14]研究表明：烟稻轮作能够使土壤中的养分在不同的条件下交替变化，从而为作物提供更高的土壤养分。贾志红等[15]研究表明：烟玉轮作可以导致土壤全氮和碱解氮含量的增加以及有效磷和速效钾含量的改变。本研究表明：FR烟田土壤的pH值最低，而有机质、全氮、碱解氮和有效磷的含量最高，FG烟田土壤的有机质、全氮、碱解氮和有效磷的含量仅低于FR烟田，且无显著差异，而FG烟田速效钾含量显著高于其他烟田，与前人的研究结果[16]相似。说明油菜和绿肥对烟田土壤的有机质和养分含量有利，特别是绿肥有利于改善速效钾含量的状况。其原因一方面可能由于油菜和绿肥前作对土壤磷素和氮素吸收量小于小麦前作[17]，且油菜地上部覆盖量较大，自身落花落叶多，干物质C/N较大，导致烟田土壤养分相对较高；而绿肥是由于翻压增加了土壤有机质含量，改善土壤缓效钾状况，且自身固氮效应能增加土壤氮素含量。土壤酶在土壤生态系统代谢扮演重要的角色，调控土壤中的生化反应，植物根系的分泌物释放和植物残体释放是土壤酶的重要来源[18-19]。FG烟田土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性仅低于FW烟田，且无显著性差异，而其土壤蛋白酶和磷酸酶活性显著高于其他烟田。其原因是翻压绿肥为微生物代谢提供更多可供分解的植物残体，进而促进了土壤酶的产生。因此从土壤有机质、养分含量和酶活性的角度来看，绿肥是合适的前作。
4种前作烟田土壤细菌在门水平和属水平上的群落组成存在明显差异，且FB烟田土壤细菌群落的相对丰度在门水平和属水平上最高。优势细菌门与土壤功能密切相关，Actionbacteria和Proteobacteria是本研究中两大优势细菌门，且在FB烟田的相对丰度高。Actinobacteria能够促使土壤中的动物和植物残体腐烂[20]，在土壤的氮素循环中也起着一定的作用，其与速效钾含量显著正相关，其在4种前作烟田土壤细菌群落的相对丰度大小与速效钾在4种前作烟田土壤含量的大小相同，这与烤烟是喜“钾”作物[21]相符合；Proteobacteria为土壤生态系统的氮素以及能量的循环提供帮助[22]，是土壤生态环境物质循环的重要组成。土壤是决定细菌群落组成的基本要素，种植模式可不同程度地改变细菌的群落结构。FB烟田的细菌群落种类最丰富，细菌之间互相制约达到动态平衡，可防止病原菌的大量繁殖，降低作物土传病害的发生。Sphingomonas、Streptomyces、Bacillus、Pseudomonas、Bradyrhizobium、Paenibacillus、Rhizobium和Mycobacterium等功能菌属在FB烟田的相对丰度高，Sphingomonas是土壤主要有益菌之一，促进烟株根际吸收营养，抵抗多种病原菌，能够降解高分子有机污染物[23]，在维持土壤氮平衡方面起着重要作用；Streptomyces可改善根际土壤的微生物生态[24]，促使根际土壤微生物由“真菌型”向“细菌型”转变；Bacillus和Pseudomonas主要的抑菌途径是产生抗生素，能显著降低烟草青枯病菌的侵染机会[25]，从而促进植物生长；Bradyrhizobium、Paenibacillus和Rhizobium是作物根际和农田环境中固氮微生物的优势种群，并且是固氮潜能相对较大的种群[26]，是重要的植物根际促生菌；Mycobacterium能够拮抗多种真菌产生的病害。在属水平上不同前作烟田土壤细菌群落结构组成存在明显差异，FB烟田土壤细菌群落种属较多，且益生菌的相对丰度较高，菌属数量和益生菌的增多可以预防烟田病害的发生，因此从防治作物土传病害的角度看，荞麦是最合适的前作。
土壤养分的变化，一部分是土壤中化学作用，最主要的是通过土壤中的微生物活动来进行的[27]。土壤养分影响微生物，微生物群落结构变化也会影响土壤养分[22, 28]。土壤微生物可以分解各种有机物质，释放丰富的氮、磷和钾等营养元素，并对土壤中无机化合物通过不同途径进行转化，为烟草提供养分来源。土壤微生物生命活动过程中还会形成各种产物如有机酸、维生素、抗生素和激素等，这些物质可以改变烟草土壤营养和氧化还原条件，影响土壤养分供应特征。该研究表明：土壤pH值、有效磷和速效钾含量是烟田土壤细菌群落在属水平上相关性较大且影响显著的环境因子，土壤全磷和速效钾含量是与烟田土壤细菌群落在门水平上相关性较大且影响显著的环境因子，土壤群落主要菌门和菌属与土壤养分之间存在一定的显著相关性，表明土壤微生物的种类和数量在一定程度上影响着土壤养分的含量和释放，而土壤养分的变化又在一定程度上影响着土壤细菌群落结构。因此，土壤养分与微生物之间相互依存、相互影响，对土壤生态系统的稳定和维持起着重要的作用。
4. 结论
不同前作对烟田土壤的养分、酶活性和细菌群落的影响不同。油菜和绿肥对烟田土壤有机质、碱解氮、全氮和有效磷含量等理化性质有较好的改善作用，绿肥有利于改善土壤缓效钾，对烟田土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、蛋白酶和磷酸酶活性有利。前作荞麦烟田土壤细菌群落丰度最高，其次是前作小麦烟田，而前作小麦烟田土壤细菌种类最多，即最丰富，荞麦能提高烟田土壤细菌群落的总数和Streptomyces、Bradyrhizobium、Bacillus、Mycobacterium等拮抗菌及Rhizobium、Pseudomonas、Paenibacillus等固氮菌的相对丰度。
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图 1 土壤细菌群落门水平(a)和属水平 (b)层级聚类分析
注：FB. 荞麦；FR. 油菜；FG. 绿肥；FW. 小麦；数字代表每个处理的3个平行样。
Figure 1. Cluster analysis of phylum level (a) and genus level (b) of soil bacterial community
Note: FB. fagopyrum; FR. rape; FG. green manure; FW. wheat; numbers represent three parallel samples for each treatment.
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图 2 不同前作烟田土壤细菌群落门水平结构分布
Figure 2. Distribution of soil bacterial community structure in phylum level of tobacco fields with different previous crops
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图 3 不同前作烟田土壤细菌属水平群落结构分布
Figure 3. Distribution of soil bacterial community structure in genus level of tobacco fields with different previous crops
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图 4 门分类水平(a)和属分类水平(b)土壤细菌群落与环境因子的RDA分析
注：TN. 全氮；AN. 碱解氮；TP. 全磷；AP. 有效磷；TK. 全钾；AK. 速效钾；organic. 有机质。
Figure 4. RDA analysis of soil bacterial communities and environmental factors on phylum (a) and genus (b) levels
Note: TN. total nitrogen; AN. alkali hydrolysis nitrogen; TP. total phosphorus; AP. available phosphorus; TK. total potassium; AK. available potassium; organic. organic matter.
表 1 烟田土壤的理化性质
Table 1 Physicochemical properties of tobacco field soil with different previous crops
前作
previous
crops含量 content pH 有机质/
(g·kg−1)
organic matter全氮/
(g·kg−1)
total nitrogen碱解氮/
(mg·kg−1)
alkaline nitrogen全磷/
(g·kg−1)
total phosphorus有效磷/(mg·kg−1)
available phosphorus全钾/
(g·kg−1)
total potassium速效钾/(mg·kg−1)
available potassiumFB 6.26±0.01 b 19.68±0.48 b 0.76±0.12 b 47.95±0.49 b 0.96±0.01 a 78.62±6.98 a 19.09±0.71 c 210.91±6.79 a FR 4.50±0.03 c 30.04±0.32 a 1.62±0.16 a 143.50±7.92 a 0.57±0.00 d 88.09±5.93 a 29.09±0.71 a 147.21±7.78 b FG 6.53±0.07 ab 27.42±2.09 ab 1.12±0.00 a 66.50±3.96 b 0.65±0.00 b 62.17±0.57 a 23.59±0.00 b 240.10±10.98 a FW 7.10±0.14 a 21.51±0.16 b 1.04±0.12 ab 58.45±8.41 b 0.60±0.00 c 44.41±1.10 a 19.70±0.00 c 155.34±2.80 b 注：FB. 荞麦；FR. 油菜；FG. 绿肥；FW. 小麦；同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平(P<0.05)；下同。
Note: FB. fagopyrum; FR. rape; FG. green manure; FW. wheat; after the same columns of data, the difference between different lower-case letters was significant (P<0.05); the same as below.
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表 2 烟田土壤酶的活性
Table 2 Activities of soil enzymes in tobacco fields with different previous crops
前作
previous crops酶活性 enzyme acfivity 蛋白酶/
(μg·g−1·d−1)
protease脲酶/
(μg·g−1·d−1)
urease蔗糖酶/
(mg·g−1·d−1)
sucrase过氧化氢酶/
(mL·g−1)
hydrogen peroxide磷酸酶/
(μg·g−1·h−1)
phosphataseFB 364.74±3.38 b 126.02±8.83 b 57.20±7.57 a 9.84±0.09 a 92.01±5.52 c FR 373.98±4.76 b 148.63±7.77 b 69.34±14.33 a 8.38±0.09 a 40.79±14.66 c FG 709.02±7.03 a 405.82±119.72 ab 75.92±32.40 a 9.69±0.04 a 306.60±0.65 a FW 181.63±2.65 c 736.55±2.97 a 87.55±42.01 a 10.03±0.01 a 117.42±4.91 b
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表 3 烟田土壤细菌群落α多样性
Table 3 The α diversities of soil bacterial communities in tobacco fields with different previous crops
前作previous crops Sobs Shannon ACE Chao 覆盖率/% coverage FB 2850±85.50 a 6.582±0.04 b 4112±120.94 a 4086±190.15 a 94.80±0.00 FR 2227±55.37 c 6.605±0.05 b 2925±103.36 c 2922±142.80 c 96.65±0.00 FG 2584±65.02 b 6.322±0.10 c 3630±71.49 b 3602±55.03 b 95.50±0.00 FW 2702±86.93 ab 6.795±0.04 a 3634±93.22 b 3659±132.45 b 95.64±0.00
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表 4 不同前作烟田土壤功能菌的相对丰度
Table 4 Relative abundance of soil functional bacteria in different tobacco fields
% 益生菌 vprobiotics FB FR FG FW 链霉菌属 Streptomyces 4.217±0.51 0.823±0.11 6.222±2.92 2.583±0.36 短根瘤菌属 Bradyrhizobium 1.937±0.26 1.927±0.14 1.168±0.29 0.857±0.15 芽孢杆菌属 Bacillus 1.609±0.09 1.147±0.10 0.952±0.10 2.619±0.66 分枝杆菌属 Mycobacterium 0.846±0.06 1.114±0.15 0.439±0.09 0.439±0.15 根瘤菌属 Rhizobium 0.670±0.07 0.078±0.02 0.604±0.10 0.311±0.11 类假单胞菌属 Pseudomonas 0.238±0.19 0.052±0.03 0.616±0.14 0.136±0.18 芽孢杆菌属 Paenibacillus 0.249±0.02 0.208±0.00 0.102±0.03 0.240±0.05
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表 5 烟田土壤主要细菌与土壤环境因子的Spearman相关性
Table 5 Spearman correlation between main soil bacteria and soil environmental factors in tobacco fields
菌门(属) phylum (genus) pH Organic TN AN TP AP TK AK 门水平phylum level 放线菌门Actinobacteria −0.077 −0.077 −0.192 −0.126 0.587* 0.098 −0.071 0.755*** 变形菌门Proteobacteria 0.168 −0.643* −0.541 −0.657* 0.517 −0.056 −0.631* 0.182 绿弯菌门Chloroflexi −0.231 0.699* 0.698* 0.755*** −0.867*** 0.126 0.674* −0.629* 酸杆菌门Acidobacteria −0.035 0.126 0.157 0.210 −0.650* −0.007 0.135 −0.818*** 厚壁菌门Firmicutes −0.420 0.371 0.445 0.371 0.650* 0.399 0.355 −0.902*** 拟杆菌门Bacteroidetes 0.853*** −0.252 −0.210 −0.259 0.287 −0.832*** −0.255 0.622* 芽单胞菌门Gemmatimonadetes 0.517 −0.294 −0.185 −0.280 −0.112 −0.503 −0.248 −0.189 螺旋体菌门Saccharibacteria −0.245 0.294 0.402 0.378 −0.741*** 0.238 0.277 −0.853*** 属水平genue level 微球菌科未分级菌属unclassified_f_Micrococcaceae 0.559 −0.273 −0.367 −0.301 0.510 −0.594* −0.255 0.776*** 链霉菌属Streptomyces 0.336 −0.510 −0.566 −0.531 0.818*** −0.301 −0.489 0.930*** 酸杆菌纲未知菌属norank_c_Acidobacteria 0.692* −0.573 −0.584* −0.483 0.217 −0.832*** −0.617* 0.196 盖勒氏菌目未知菌属norank_o_Gaiellales −0.888*** 0.364 0.342 0.315 −0.161 0.972*** 0.397 −0.385 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas 0.343 −0.909*** −0.883*** −0.895*** 0.860*** −0.231 −0.880*** 0.601** 玫瑰弯菌属Roseiflexus 0.762** −0.252 −0.274 −0.252 0.301 −0.832*** −0.270 0.629* 注：TN. 全氮；AN. 碱解氮；TP. 全磷；AP. 有效磷；TK. 全钾；AK. 速效钾；organic. 有机质；“*”为0.01<P≤0.05，“**”为0.001< P≤0.01，“***”为P≤0.001。
Note: TN. total nitrogen; AN. alkali hydrolysis nitrogen; TP. total phosphorus; AP. available phosphorus; TK. total potassium; AK. available potassium; organic. organic matter.
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