从民勤盆地植被覆盖度时空变化视角评估石羊河流域综合治理成效
Effect Evaluation on the Comprehensive Management for Shiyang River Basin from the Perspective of Temporal and Spatial Changes of Vegetation Coverage in Minqin Basin
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奶山羊(Capra hircus)作为重要的经济草食家畜，具有饲养成本低、占地面积小、适应能力强等特点，是中国农村经济发展的支柱产业之一[1]。种公羊的精液质量是影响繁殖率的重要因素，睾酮合成能力的强弱则直接决定精液品质[2]。睾酮是睾丸间质细胞(Leydig cells，LCs)产生的一种类固醇激素，与家畜繁殖活动密切相关。雄性奶山羊繁殖季的血浆睾酮水平显著高于非繁殖季，且交配行为与睾酮水平显著相关[3]。睾酮可促进精子发生，提高精子数量和活力，改善精液质量[4]。
LCs合成睾酮受下丘脑—垂体—睾丸轴(hypothalamus-pituitary-testis，HPT)调控，垂体分泌的促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)与LH受体(LH receptor，LHR)结合，促进睾酮合成[5]。啮齿类动物中，LCs发育分为4个不同阶段：睾丸间质干细胞(stem Leydig cells，SLCs)、睾丸间质祖细胞(progenitor Leydig cells，PLCs)、未成熟睾丸间质细胞(immature Leydig cells，ILCs)和成熟睾丸间质细胞(adult Leydig cells，ALCs)[6]。其中，SLCs和PLCs不具备睾酮合成能力，ILCs主要产生雄烯二酮，ALCs则主要合成睾酮[7]。与啮齿类动物不同，初情期前家畜的HPT轴未被激活，LCs发育处于静息期[8]，此时LCs具有低水平的睾酮合成能力[9]；初情期，HPT轴被激活，释放LH， ILCs转变为ALCs， 促进睾酮的合成[10]。 但是，目前鲜有奶山羊不同发育阶段LCs的形态变化特征及睾酮合成规律的研究报道。
本研究以关中奶山羊为试验对象，采用多种形态学技术分析不同发育阶段奶山羊LCs的生物学特性，进一步检测睾酮合成关键酶的动态变化规律。研究结果可为揭示奶山羊睾酮合成的分子机制奠定形态学基础，也可为进一步完善哺乳动物精子发生调控网络提供参考资料。
1. 材料与方法
1.1 材料
苏木精—伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色试剂盒(索莱宝，G1120)；油红O染色试剂盒(Sigma，O0625)；3β-羟基类固醇脱氢酶(hydroxysteroid dehydrogenase，HSD)兔多克隆抗体(爱博泰克，A1823)；StAR兔多克隆抗体(Affinit，DF6192)；Cyp11a1兔多克隆抗体(爱博泰克，A1713)；17β-HSD兔多克隆抗体(Affinit，DF7790)；GAPDH兔多克隆抗体(Affinit，AF7021)；山羊LH和山羊睾酮酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海酶联生物)；RIPA裂解液(Thermo Scientific)；增强型ECL化学发光液(Millipore)；HRP标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司。
1.2 试验动物与样品采集
选取2~3月龄(幼龄期)、6~8月龄(初情期)和18~24月龄(成年期)的健康雄性关中奶山羊各5只用于研究。供试动物由西北农林科技大学实验动物中心提供，许可证号为：SYXK(陕)2022-03。颈静脉采集血液样品后，4 ℃静置30 min，随后
3000 r/min离心15 min，收集血清样品并分装冻存，用于后续试验。奶山羊进行实验室麻醉，手术切开阴囊壁，摘取两侧睾丸样品，迅速放入盛有25~35 ℃的灭菌PBS缓冲液中洗涤2~3次。取一侧部分样品用于透射电镜制样，剩余样品液氮冻存。另一侧部分样品迅速用最佳切割温度(optimal cutting temperature，OCT)包埋剂包埋，用于制备冰冻切片，再进行油红O染色；剩余睾丸组织样品以4%多聚甲醛固定液固定，用于制备石蜡切片，再进行HE染色。动物试验通过西北农林科技大学生物安全委员会的审核，许可证号为：DY2023033。1.3 睾丸组织的HE染色
将睾丸样品切割成小块组织，以4%多聚甲醛固定24 h。样品上行梯度乙醇脱水→二甲苯透明→石蜡包埋→切片机切取5 μm切片；组织切片下行梯度乙醇脱蜡→HE染色→中性树胶封片。使用光学显微镜观察并拍照。
1.4 油红O染色
将睾丸组织冰冻切片置于室温晾干，以冷丙酮固定10 min，PBS洗涤3次。油红O染色液(V油红O原液∶V去离子水=3∶2)室温染色15 min，然后用苏木素复染细胞核，再用甘油明胶封片，置于光学显微镜下观察并拍照。
1.5 免疫组织化学检测
将睾丸组织石蜡切片脱蜡，先用3% H2O2室温孵育10 min，然后用柠檬酸盐缓冲液进行抗原热修复，再用5% BSA室温孵育30 min。3β-HSD一抗(LCs特异性标记Marker) 4 ℃孵育过夜，PBS洗涤5次；二抗室温孵育40 min，DAB显色5 min，苏木精复染，上行梯度乙醇脱水，中性树胶封片。使用显微镜观察并拍照。
1.6 奶山羊睾丸组织透射电镜制样
脂滴为脂溶性细胞器，常规透射电镜制样过程中，梯度乙醇脱水环节容易造成脂滴形态结构损坏，导致LCs超微结构特征改变，因此，本研究对透视电镜制样方法进行改良，具体操作为：将切成1 mm3的睾丸组织样品用强渗透能力的2.5%戊二醛—4%多聚甲醛混合缓冲固定液固定1.5~3.0 h，再用经过预冷的2.5%戊二醛—PBS缓冲液固定过夜；次日用PBS洗涤5次，再用1%锇酸室温固定2 h，上行梯度乙醇脱水，丙酮置换，Epon 812包埋。先半薄切片，甲苯胺蓝染色定位后进行超薄切片(50 nm)，采用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，置于透射电子显微镜下观察LCs的超微结构特征并拍照。
1.7 ELISA检测血清中LH和睾酮的含量
按ELISA试剂盒说明书进行，每孔加入待测血清样品50 μL，重复5次。使用酶标仪检测波长450 nm下的吸光度值(OD值)。
1.8 睾丸组织RNA提取及荧光定量PCR (qPCR)检测
采用Trizol法提取睾丸组织总RNA，使用核酸分析仪(NanoDrop 2000)检测RNA的纯度和浓度；随后逆转录合成cDNA，采用Absolute qPCR SYBR Green Mix Kit试剂盒进行qPCR检测。检测对象包括：胆固醇转运相关基因、睾酮合成相关基因、LCs成熟关键基因以及内参基因(GAPDH)，共计16个(表1)。每个核酸样品重复5次，以2−ΔΔCt值表示基因相对表达量。
表 1 qPCR引物信息Table 1. Primer information基因名
gene name引物序列 (5′→3′)
primer sequence产物长度/bp
product lengthTm/℃ 胆固醇转运相关基因
cholesterol transport-
related genesStAR F：TACTAAAGGAGCCGTGGATAAAG；R：CTACAAGTGGTAATGGTTGGGTT 577 58 TSPO F：ACCCAGTACATCCGTGGAGA；R：CCAGATGCGGTAGTTGAGCA 423 60 VDAC1 F：ACAAGACCGATGAGTTCCAGC；R：TGTTCACTTTAGCCGAGAAGC 198 60 VDAC2 F：CGACCTACGGACAGAACTGC；R：GATGTTGAGAATTCCACGCCG 160 60 睾酮合成相关基因
testosterone synthesis-
related genesCyp11a1 F：ATCCACTTTCGCCACATCG；R：GGTCTTTCTTCCAGGCTCCT 232 58 Cyp17a1 F：CTGAAGGCCATACAAAATGTCA；R：TTATTGTCTGCATTCACCTTGG 245 57 3β-HSD F：CTATGTTGGCAATGTGGC；R：ATCTCGCTGAGCTTTCTTAT 340 55 3α-HSD F：GATACTGGCTTTGGAAACTTGG；R：TTACATCCAGAAGCACGGTATG 142 58 SRD5A1 F：TACTTCGGAGAAGTCGTGGAGT；R：ATGGTACCACTTGTGATGTTGC 129 60 SRD5A2 F：TACGGTTTAGCCTGGGTGTC；R：ACAAGCCACCTTGTGGAATC 126 59 SRD5A3 F：AGGCAGGAGTGGTCATTCAC；R：TATGTTACCACGAGCCACCA 157 59 17β-HSD-1 F：GATCCCTGGGTCAAGTAGGAAATGC；R：AGGTGCGTATATGTGTGCTCAGTTG 133 62 睾丸间质细胞
成熟关键基因
key genes in the matu-
ration of Leydig cellsNR3C4 F：AGGCACTGCTGCTCTTTAGC；R：GGAGCTTGGTGAGCTGGTAG 165 60 Insl3 F：GGCTGGAAGGACAACATCTC；R：GACAGAGGGTCAGCAGGTCT 183 59 17β-HSD-3 F：TGCATTTTCCTGCACTTCTG；R：GATGGCCTGAAGTTTTTCCA 177 55 内参基因
reference genesGAPDH F：AACGTGTCCGTTGTGGATCT；R：GAGTGTCGCTGTTGAAGTCG 157 60 1.9 蛋白免疫印迹(Western-blot)检测
采用RIPA裂解法提取睾丸组织总蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度；经SDS-PAGE电泳后，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉孵育30 min，漂洗后置于待检测抗体溶液中，4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗涤3次，加入增强型ECL发光液后置于凝胶成像系统中进行检测，采用Quantity One软件分析。
1.10 数据处理与统计分析
使用SPSS 16.0和GraphPad Prism 9.0进行数据分析和制图，结果以“平均值±标准误”表示；数据采用Tukey试验多重比较法分析组间差异。
2. 结果与分析
2.1 不同发育阶段奶山羊LCs的分布特点
奶山羊LCs分布于曲细精管(seminiferous tubules，ST)之间，呈圆形或椭圆形，胞体较大，胞核位于细胞中央(图1)。幼龄期奶山羊睾丸生精上皮主要由精原细胞和支持细胞组成，LCs分布于ST之间(图1a和1d)。初情期和成年期的睾丸生精上皮由各级生精细胞和支持细胞构成，LCs成群分布并逐渐向间质中央移动；初情期可观察到变态发育的精子细胞(图1b和1e)，成年期的ST管腔内可见精子(图1c和1d)。性成熟后，睾丸生精上皮的长度和ST直径极显著增加(图1g和1h)。
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图 1 不同发育阶段奶山羊睾丸组织的HE染色注：d)、e)、f)分别为a)、b)、c)黑色虚线方框中的高倍图；ST. 曲细精管，Lu. 曲细精管管腔，SE. 生精上皮；黑色弯曲箭头指毛细血管，黑色箭头指睾丸间质细胞(LCs)；**. 不同阶段之间存在极显著差异 (P<0.01)；下同。Figure 1. HE staining of testis tissue in dairy goats at different development stagesNote: d), e), f) are the higher magnifications of the corresponding black rectangles in a), b), c), respectively; ST. seminiferous tubules, Lu. lumen, SE. spermatogenic epithelium; black curved arrow refers to capillary, black arrow refers to Leydig cells (LCs); **. there are extremely significant differences among different stages (P<0.01); the same as below.不同发育阶段LCs中睾酮合成关键酶3β-HSD的免疫组织化学检测结果(图2)显示：幼龄期LCs中的3β-HSD呈弱阳性表达(图2a和2d)；初情期和成年期呈强阳性表达(图2j)，且阳性反应主要分布于胞核周围的胞质中(图2b~c和2e~f)。油红O染色发现：幼龄期LCs胞质中的脂滴较少(图2g)，而初情期和成年期的脂滴含量极显著增加(图2h~i和2k)。
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图 2 不同发育阶段奶山羊LCs的分布特点Figure 2. Distribution characteristics of LCs at different development stages2.2 不同发育阶段奶山羊LCs的超微结构特征
透射电镜观察结果如图3所示。幼龄期LCs呈卵圆形，胞核大而圆，位于细胞中央，胞质内分布线粒体、光面内质网等细胞器，偶见小脂滴位于细胞边缘(图3a)；高倍镜下观察到细胞核双层膜结构，线粒体分散在光面内质网之间(图3d)；体积较大，嵴结构明显减少，嵴与嵴之间空隙较大，线粒体与光面内质网间分布着大量呈簇状排列的细胞骨架结构(直径约10 nm)(图3g)。初情期和成年期的LCs变大，呈不规则多边形，细胞核呈椭圆形位于细胞中央(图3b~c)；细胞核中异染色质明显较幼龄期多，胞质内分布发达的光面内质网、线粒体、小脂滴等与类固醇合成相关的细胞器(图3e~f)；高倍镜下观察到线粒体嵴数量发达，且线粒体与脂滴、光面内质网等细胞器发生直接的物理性接触(图3h~i)。随着性成熟，LCs胞质内与类固醇合成有关的细胞器数量极显著增加(图3j~l)，细胞器间的直接接触为快速合成雄激素睾酮奠定了形态学基础。
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图 3 不同发育阶段奶山羊LCs的超微结构特征注：N. 细胞核，Mi. 线粒体，sER. 光面内质网，LD. 脂滴；黑色箭头指细胞骨架；脂滴和线粒体的数量以单个LCs中的数量统计。Figure 3. Ultrastructural characteristics of LCs at different development stagesNote: N. nucleus, Mi. Mitochondria, sER. smooth endoplasmic reticulum, LD. lipid droplet; black arrow refers to cytoskeleton; the numbers of LD and Mi are counted in per LCs.2.3 不同发育阶段奶山羊LCs合成雄激素睾酮的水平
ELISA检测结果(图4a)显示：幼龄期血清中LH和睾酮的含量处于极低水平，初情期和成年期LH和睾酮的含量显著或极显著升高。qPCR检测结果(图4b)显示：胆固醇转运关键基因StAR和TSPO，LCs成熟相关基因NR3C4、Insl3和 17β-HSD-3， 以及睾酮合成关键酶基因 Cyp11a1、Cyp17a1、3β-HSD和17β-HSD-1的水平在初情期和成年期均显著或极显著高于幼龄期。Western-blot检测睾酮合成关键酶的蛋白水平，结果与基因表达水平一致(图4c~d)。这些结果表明：奶山羊LCs合成雄激素睾酮能力与其成熟过程密切相关。
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图 4 不同发育阶段奶山羊LCs合成睾酮的水平注：*. 不同阶段之间存在显著差异 (P<0.05)。Figure 4. Testosterone synthesis levels of LCs at different development stagesNote: *. there are significant differences among different stages (P<0.05).3. 讨论
睾酮属于LCs合成分泌的类固醇激素，作为动物体内重要的性激素，在性器官的发育成熟、精子发生、维持雄性第二性征等方面发挥着关键作用[11]。LCs合成睾酮受HPT轴精确调控，其睾酮的合成能力与发育成熟过程密切相关[12]。
哺乳动物LCs分为2种类型：胎儿型LCs和出生后成熟LCs。在啮齿类动物中，SLCs分化发育为ALCs需要经历PLCs和ILCs两个过渡阶段[13]。在该过程中，HPT轴协同血小板衍生生长因子、胰岛素生长因子I、肿瘤坏死因子、白介素等细胞因子调控LCs的增殖、分化和成熟[14]，其中以HPT轴分泌的促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone，GnRH)、促性腺激素抑制激素(gonadotrophin inhibiting hormone，GnIH)和LH起主要调控作用[15]。对于家畜而言，性成熟前HPT轴未被激活，LCs长期处于静息状态，此时的LCs称为幼龄期LCs[16]；在初情期，随着HPT轴被激活并释放大量的LH，进而激活cAMP-PKA信号通路，促进雄激素睾酮合成[17]，此时的LCs称为成熟期LCs，胞质内除类固醇合成关键基因表达水平增强外，与类固醇合成有关的细胞器也出现显著的变化[18]。本研究利用多种形态学方法观察不同发育阶段奶山羊LCs的结构特征，结果表明：初情期和成年期的LCs逐渐变大，呈不规则多边形，且LCs逐渐向间质中央移动；LCs胞质内含有大量脂滴，且脂滴与线粒体、光面内质网等细胞器密切接触，这些与类固醇合成相关的细胞器大量出现，为LCs快速合成雄激素睾酮奠定了物质基础。进一步通过ELISA、qPCR和Western-blot检测发现：成熟期奶山羊LCs中雄激素睾酮合成关键酶的表达水平显著高于幼龄期，且血清中LH和睾酮的含量也显著高于幼龄期。ISRAEL等[9]研究表明：LCs内存在一系列高度特异性的甾体酶系，它们按照一定的规律分布于线粒体、光面内质网等细胞器，在HPT轴的调控下适时分泌睾酮，维持动物机体发育和生殖需求。这些研究结果提示：LCs合成雄激素的能力与其发育过程密切相关。
类固醇激素的合成始于游离胆固醇，而胆固醇可在细胞内以胆固醇酯的形式储存于细胞器脂滴中[19]。有学者在人类、猕猴以及啮齿类动物的肾上腺上皮细胞脂滴中检测到大量与类固醇激素合成相关的酶及线粒体蛋白[20]。脂滴是一种储存中性酯的多功能细胞器，普遍存在于各种动物的各类细胞中。在脂肪组织中，脂滴主要以甘油三酯的形式存在，其水解后释放的游离脂肪酸经线粒体β-氧化作用产生ATP，供给细胞能量[21]；而在类固醇激素合成的细胞中，脂滴主要以若干体积较小的方式存在，其主要作用是释放游离胆固醇，用于类固醇激素的合成[22]。
本研究通过油红O染色和改良后的透射电镜方法观察发现：幼龄期LCs内脂滴的含量极少；而初情期和成年期LCs内脂滴的含量极显著增加。值得注意的是，LCs内脂滴与线粒体、内质网等细胞器发生直接物理性接触，这为高效合成睾酮提供了形态学基础。此外，透射电镜下还观察到类固醇合成的细胞器周围分布大量的细胞骨架，其可能参与睾酮的合成。还有研究表明：特异性的敲除Vimentin可显著抑制小鼠类固醇激素的合成[23-24]。综上所述，哺乳动物LCs合成睾酮的能力与胞内胆固醇的来源密切相关。
4. 结论
奶山羊睾酮的合成与LCs的成熟过程密切相关，LCs中的脂滴具有参与睾酮合成的形态学依据。研究结果为揭示奶山羊睾酮合成的分子机制奠定了形态学基础，也为进一步完善哺乳动物精子发生调控网络提供了参考。
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图 2 4个时期植被覆盖度反演结果
Figure 2. Fractional vegetation coverages inversion results of the four periods
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图 3 2000—2016年平均植被覆盖度变化
Figure 3. Average fractional vegetation coverages changes from 2000 to 2016
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图 4 研究区4个时段植被覆盖度年均变化情况
Figure 4. Annual variation of fractional vegetation coverages in the four periods of the study area
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图 5 整个绿洲区及13个乡镇植被覆盖度变化情况
Figure 5. Changes of fractional vegetation coverages in the whole oasis area and 13 townships
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图 6 荒漠区4个时期各等级植被覆盖度面积占比
Figure 6. Proportion of different vegetation coverages levels in different periods of the desert region
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图 7 青土湖Landsat影像及植被覆盖度变化情况
Figure 7. Changes of Landsat images and fractional vegetation coverages in different periods of Qingtu Lake
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图 8 老虎口Landsat影像及植被覆盖度变化情况
Figure 8. Changes of Landsat images and fractional vegetation coverages in different periods of Laohukou
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图 9 黄岸滩Landsat影像及植被覆盖度变化情况
Figure 9. Changes of Landsat images and fractional vegetation coverages in different periods of Huangantan
表 1 研究所需数据及参数
Table 1 Data and parameters of the study
年份
year数据类型
data type影像获取日期
image acquisition date云量/%
cloud cover2000 Landsat 5 TM 2000-07-19 0.00 2006 Landsat 5 TM 2006-08-05 0.00 2010 Landsat 5 TM 2010-07-15 1.00 2016 Landsat 8 OLI 2016-07-15 0.13 
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表 2 研究区植被覆盖度分类等级
Table 2 Classification levels of fractional vegetation coverage in the study area
植被覆盖度/%
vegetation coverage分类等级
classification level<5 无植被区no vegetative area ≥5~25 低覆盖度low coverage ≥25~50 中覆盖度medium coverage ≥50~75 中高覆盖度medium to high coverage ≥75 高覆盖度high coverage
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