烟叶在成熟过程中其生理生化特性和化学组成不断发生变化^[1-2]，这些变化直接影响着烟叶的烘烤特性^[3]，烟叶采收成熟度是衡量烟叶生产和质量的核心，影响并决定着烟叶的加工价值^[4]。上部烟叶是烟叶产量的主要部分，也是影响烟叶质量的重要组成。烘烤过程是烟叶水分蒸发和干燥的过程。上部烟叶通常较厚，组织结构紧密，烘烤过程失水特性不易把握^[5]。烟叶失水会促进烟叶变黄，变黄阶段也是烟叶叶绿素转化降解的主要时期。烟叶在烘烤过程中的高温失水通常会影响其生理代谢^[6]，而生理指标的变化常常可反映出这些代谢活动对烟叶烘烤质量的影响，例如MDA含量的多少能体现出细胞膜脂过氧化程度^[7]；多酚类化合物则是衡量烟草品质的重要指标，对烟叶香气、色泽和烟气生理强度等都有重要影响^[8]；SOD和POD是叶内活性氧酶促防御系统的重要保护酶，是植物抗逆能力的体现，在烘烤过程中起到重要保护作用^[9]。多酚氧化酶属于核编码的铜金属酶，化学性质稳定^[10]，在烟草中，如果组织受损或类囊体膜被破坏后，多酚氧化酶则被释放出来而表现出活性^[11]，在烟叶烘烤调制过程中多酚氧化酶能催化氧化多酚类化合物为α-醌，并聚合成黑色素，影响烟叶的外观和内在品质^[12]。近年来，对不同成熟度烤烟在烘烤过程中的研究多集中于烘烤品质^[13]和组织结构的变化^[14]，或者单一和少数生理指标的研究^[15]。而对烘烤过程中不同成熟度烟叶多个生理指标及其相关性的研究鲜有报道。本研究以不同成熟度的烤烟K326上部烟叶为研究材料，检测分析不同成熟度烟叶对烘烤过程中多个相关生理指标的影响。研究结果对进一步探讨烤烟K326的成熟度对烘烤特性的影响有一定的参考价值。

1.   材料与方法

1.1   材料

供试材料于2017年8—9月采自宜良规范化种植规模化管理长势一致的试验基地，供试烤烟品种为K326。选择上部叶(烟株最下部往上第15~16位叶)进行试验。按欠熟、适熟和过熟3种成熟度档次在田间采收鲜烟叶样品。其外观特征为：(1)欠熟：用字母“J”表示，叶色淡绿，主脉1/2白、发亮，支脉发青，茸毛较少脱落，叶尖微下勾。(2)适熟：用字母“K”表示，叶色以黄为主，变黄面积6~8成，主脉全白、发亮，支脉1/2变白，叶尖叶缘下卷，茸毛较多脱落。(3)过熟：用字母“L”表示，叶面基本全黄，有成熟斑，主脉和支脉全白、发亮，叶尖枯尖，叶缘焦边，茸毛大部分脱落^[16]。

1.2   方法

将采摘的上部烟叶按照360~400杆装烟量的标准进行装烟，置于温湿度自控密集烤房中，采用常规三段式烘烤工艺烘烤。参考霍开玲等^[17]的取样方法，分别于烤前(T1)及烘烤过程干球温度达到36 ℃末(T2)、38 ℃末(T3)、42 ℃末(T4)、48 ℃末(T5)、54 ℃末(T6)和68 ℃末(T7) 7个阶段分别取样。每个成熟度随机选取3杆烟叶，进行3次重复，去除主脉和较大支脉，称取等量材料用于杀青，再烘至恒重，其他材料剪碎混匀并用锡纸包裹放入液氮中进行临时处理，后放于−86 ℃冰箱保存待用。

烟叶中MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法^[18-19]；SOD活性的测定采用NBT还原法，以每单位时间内光化还原50% NBT 为1个酶活性单位^[18]；多酚氧化酶活性采用邻苯二酚氧化法测定^[20]；叶绿素采用分光光度法^[20]；POD 活性的测定采用愈创木酚法 ^[18]；多酚总量测定采用酒石酸亚铁法^[21]；含水量和失水率测定参照曾建敏等^[22]的方法进行。

1.3   数据处理

数据用Excel 2007处理，SPSS 7.1软件分析。

2.   结果与分析

2.1   含水率和失水率变化

由表1可知：烟叶含水率在T1、T2和T7阶段J、K、L间无显著差异；在T3、T4和T5阶段表现为J>K>L；T3阶段J、K间无显著差异，J极显著大于L，K显著大于L；T4阶段J、K间无显著差异，J、K极显著大于L；T5阶段J显著大于K，J极显著大于L；T6阶段L显著大于J、极显著大于K，J显著大于K。

表  1  不同成熟度烟叶各烘烤阶段含水率和失水率

Table  1.  Moisture content and water loss rate of different maturity tobacco leaves in each curing stage %

项目 item	成熟度maturity	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7
含水率 moisture content	J	73.95±1.30 aA	72.50±4.02 aA	72.32±3.28 aA	61.92±6.32 aA	46.35±7.96 aA	13.42±1.94 bAB	11.85±3.07 aA
	K	71.75±2.06 aA	70.19±2.05 aA	68.62±0.64 aAB	59.27±3.80 aA	30.20±3.66 bAB	9.41±1.25 cB	9.83±4.58 aA
	L	71.87±3.64 aA	69.82±7.17 aA	61.67±3.73 bB	40.10±3.55 bB	24.10±7.88 bB	16.60±0.89 aA	11.06±1.75 aA
失水率 water loss rate	J	0	1.96±2.37 aA	0.24±1.61 aA	14.06±3.34 bB	21.06±8.39 aA	44.53±7.55 aA	2.11±3.65 aA
	K	0	2.17±0.36 aA	2.19±2.12 aA	13.03±2.60 bB	40.76±6.42 aA	28.72±1.82 abAB	0.01±2.73 aA
	L	0	2.85±3.40 aA	11.35±7.41 aA	30.01±1.00 aA	22.26±5.55 aA	10.44±7.52 bB	7.72±1.15 aA
注：字母“J”表示欠熟烟叶；字母“K”表示适熟烟叶；字母“L”表示过熟烟叶；T1 表示烘烤前，T2、T3、T4、T5、T6 和 T7 分别表示烘烤过程干球温度达到 36 ℃ 末、38 ℃ 末、42 ℃ 末、48 ℃ 末、54 ℃ 末和 68 ℃ 末。小写字母表示同列数据在 5% 水平上差异显著，大写字母表示在 1% 水平上差异极显著；下同。 Note: The letter “J” means under mature leaf ; the letter “K” indicates well-matured leaf; the letter “L” means over mature leaf; t1 means before curing, T2, T3, T4, T5, T6 and T7 indicate that the dry bulb temperature of the curing process reaches the 36 ℃, 38 ℃, 42 ℃,48 ℃, 54 ℃ and 68 ℃ respectively; the lowercase letters in the table indicate significant differences in the same column data at 5% levels, and uppercase letters indicate significant differences at the 1% level; the same as below.

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烘烤过程中烟叶主要失水期发生在T4~T6之间，且随成熟度的提高而提前。烟叶失水率在T2、T3、T5和T7阶段J、K、L三者间无显著差异；T4阶段L极显著大于K和J；T6阶段J极显著大于L；J的失水率在T6阶段达到最大值为44.53%；K的失水率在T5阶段达到最大值为40.76%，L的失水率在T4阶段达到最大值为30.01%。

2.2   烘烤过程中叶绿素含量变化

由表2可知：T1期时，叶绿素含量表现为J>K>L；在T2阶段时，J>K和L；在T3和T6阶段时，表现为J>L>K；在T4阶段，表现为K大于J但不显著，而J则极显著大于L；在T5阶段，J极显著大于K，而K大于L但不显著；T7表现为J极显著大于L，L极显著大于K。叶绿素降解过程主要发生在T1~T4阶段之间，适熟烟叶和过熟烟叶提前到T2阶段。

表  2  不同成熟度烟叶烘烤过程中叶绿素含量的变化

Table  2.  Changes of chlorophyll content during curing of tobacco leaves with different maturities mg/g

成熟度maturity	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7
J	3.771 ±0.011 aA	0.919 ±0.010 aA	0.653 ±0.010 aA	0.139 ±0.031 aA	0.260 ±0.007 aA	0.240 ±0.016 aA	0.144 ±0.004 aA
K	1.937 ±0.008 bB	0.099 ±0.017 bB	0.051 ±0.021 cB	0.144 ±0.003 aA	0.067 ±0.006 bB	0.024 ±0.005 cB	0.013 ±0.001 cC
L	0.823 ±0.006 cC	0.125 ±0.011 bB	0.099 ±0.005 bB	0.032 ±0.004 bB	0.050 ±0.004 bB	0.078 ±0.007 bB	0.053 ±0.011 bB

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2.3   烘烤过程中烟叶多酚氧化酶含量变化

从图1可见：欠熟烟叶和过熟烟叶的PPO活性均表现出先升高后降低的趋势，适熟烟叶则表现为先升高后降低、再升高再降低的趋势，三者均在T2阶段达到最大值；在T1~T2阶段，PPO活性升高的趋势表现为L>K>J；T2~T7过熟烟叶和欠熟烟叶均表现出降低的趋势；在T2~T3阶段适熟烟叶PPO活性降低而后又升高，从T4~T7又呈现降低趋势。

图  1  不同成熟度烟叶烘烤过程中PPO、POD和SOD活性变化以及MDA和多酚含量变化

Figure  1.  Changes of PPO, POD and SOD activities and changes of MDA and polyphenols contents

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2.4   烘烤过程中烟叶MDA含量变化

从图1可见：烟叶在烘烤过程中MDA含量整体呈上升趋势，过熟烟叶MDA含量始终高于适熟烟叶；在T4~T6期间适熟和过熟烟叶MDA含量明显升高，欠熟烟叶出现下降趋势；T6和T7期间MDA含量表现为L>K>J。

2.5   多酚含量变化

从图1可见：适熟和过熟烟叶多酚含量随烘烤的进行而呈现先上升后下降再上升的趋势，均从T2开始下降，T3开始上升；欠熟烟叶多酚含量一直呈现上升趋势直到在T5出现下降趋势，但T6又出现上升趋势；3个成熟阶段在烘烤过程中多酚含量始终表现为L>K>J。

2.6   烘烤过程中POD和SOD活性变化

从图 1 可见：POD 活性变化情况呈现为POD 活性随烘烤进行在过熟烟叶呈现先升高后降低，而欠熟和适熟烟叶呈现先升高后降低、再升高再降低的趋势，均在 T3 阶段出现最大值且酶活性大小表现为 K>L>J。SOD 活性变化情况在过熟烟叶呈现先降低后升高，而欠熟和适熟烟叶呈现先降低后升高再降低再升高的趋势，在 T2~T3阶段表现出较低的酶活性。T1和T5阶段表现为J>K>L。T7 阶段 K 和 L 酶活性大小趋于接近，但均小于J。

2.7   生理指标之间相关性分析

从表3可见：不同成熟度烟叶烘烤过程中MDA与多酚含量变化之间均存在显著正相关关系(0.05置信区间)，而叶绿素与多酚含量变化之间则均存在显著负相关关系(0.05置信区间)；多酚含量与PPO活性间在欠熟烟叶中显现显著负相关性，而在适熟及过熟烟叶中则相关性不显著。MDA含量变化与POD活性变化之间呈不显著负相关，与SOD活性变化之间呈正相关，且相关系数随着成熟度的提高而增大。多酚含量与SOD活性变化之间呈正相关，且相关性随着成熟度的提高而增大；多酚与POD活性之间则呈负相关，相关性随着成熟度增加而减小。POD活性与SOD活性之间呈负相关，欠熟和过熟烟叶相关性在0.05置信区间达到显著，适熟烟叶相关性在0.01置信区间达到显著。

表  3  不同成熟度烟叶烘烤过程各生理指标相关性

Table  3.  Correlation of different physiological indexes in curing process of tobacco leaves with different maturities

成熟度maturity	指标index	MDA	多酚polyphenols	叶绿素chlorophyll	PPO	POD	SOD
J	MDA	—
	多酚polyphenols	0.841*	—
	叶绿素chlorophyll	−0.865*	−0.773*	—
	PPO	−0.728*	−0.817*	0.686	—
	POD	−0.157	−0.575	0.044	0.199	—
	SOD	0.024	0.379	0.283	−0.142	−0.837*	—
K	MDA	—
	多酚polyphenols	0.832*	—
	叶绿素chlorophyll	−0.540	−0.833*	—
	PPO	−0.530	−0.291	0.005	—
	POD	−0.524	−0.304	−0.154	0.500	—
	SOD	0.674	0.450	−0.006	−0.670	−0.939**	—
L	MDA	—
	多酚polyphenols	0.872*	—
	叶绿素chlorophyll	−0.645	−0.834*	—
	PPO	−0.472	−0.246	−0.004	—
	POD	−0.410	−0.264	−0.252	0.575	—
	SOD	0.755*	0.714*	−0.304	−0.728*	−0.798*	—
注：“*”表示在0.05置信区间相关性显著；“**”表示在0.01置信区间相关性显著。 Note: “*” indicates significant differences in the same column data at 5% levels; “**” indicates significant differences at the 1% level.

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3.   讨论

烟叶成熟度对烟叶烘烤过程中水分含量变化有重要影响^[20]，这与烟叶组织结构疏松致密程度紧密相关^[23-24]，随着烟叶采收成熟度的提高，烟叶组织结构逐渐疏松，保水能力变弱，失水变强。武圣江等^[25]发现：烟叶水分含量在定色期(42~54 ℃)变化最显著，54 ℃与烤后烟叶水分含量差异不显著；本研究结果也显示：烘烤过程中烟叶主要失水期发生在42~54 ℃之间。而对不同成熟度的研究表明烟叶大量失水期随成熟度提高而提前，即成熟度越高的烟叶失水越早。宋洋洋等^[16]等的研究也表明：过熟烟叶在烘烤48 h (定色初期)时开始大量失水，欠熟和适熟烟叶到54 h时才开始大量失水。烟叶失水会促进烟叶变黄，变黄阶段也是烟叶叶绿素转化降解的主要时期。本试验对叶绿素含量的测定表明：叶绿素降解过程主要发生在烤前至42 ℃末期之间，其中适熟烟叶和过熟烟叶叶绿素含量降解集中发生在烤前至36 ℃末期之间，欠熟烟叶集中在烤前至42 ℃末期之间，从叶绿素的含量来看，烤后为欠熟烟叶极显著大于过熟烟叶，过熟烟叶极显著大于适熟烟叶；适熟烟叶的叶绿素降解较为彻底，可看出烟叶失水和变黄的互相影响。

生物膜在植物生理生化反应过程中扮演重要的角色。LOX以不饱和脂肪酸为底物，启动膜脂过氧化，导致膜透性的增加和MDA的积累，细胞区域化被破坏^[26]。植物MDA含量体现了细胞膜脂程度，MDA含量越高说明植物细胞膜受损程度越严重，对细胞生理活动产生重要影响^[9]。本试验MDA含量呈逐渐增加趋势，但由于成熟度的差别具体变化有所差异，具体表现为过熟烟叶烘烤各阶段MDA含量普遍较高，适熟和欠熟烟叶变黄期MDA含量相差不大，进入定色期后适熟烟叶MDA含量明显高于未熟烟叶，这说明成熟度高的烟叶在烘烤过程中MDA含量较高，在烘烤时易发生膜脂过氧化反应。韩锦峰等^[27]研究发现：烟叶细胞膜透性与MDA含量呈显著正相关关系，同一部位烟叶成熟度越高其MDA含量越高，膜脂过氧化越严重，膜系统损伤越重。同时，MDA和多酚含量与SOD活性均呈正相关，且成熟度越高相关性越高，这说明烘烤使烟叶衰老，加剧膜脂过氧化，而氧自由基的增加会刺激SOD活性升高从而进行防御。

宫长荣等^[28]研究发现：多酚含量在烘烤开始后的前24 h呈增加趋势，而相关研究^[29]亦表明烟叶烘烤过程中多酚类物质含量呈持续缓慢增加的趋势。本试验中多酚含量总体呈上升趋势，同时其含量变化因成熟度不同而略有差异。本研究显示：T1和T7阶段烟叶多酚含量表现为L>K>J，说明成熟度高的烟叶烤前多酚含量高，烤后多酚含量亦高。多酚含量高说明不易发生棕色化反应，减少了杂色烟^[30]。多酚氧化酶对多种香气物质的形成起着重要作用，烘烤过程中多酚氧化酶的活性过高会造成烟叶质量的下降^[31]，同时也是影响烤烟色泽的重要酶，本试验中PPO酶活性均呈现先升高后降低的趋势，成熟度对PPO活性产生显著影响，变黄前期(T3阶段)成熟度高的烟叶PPO活性显著高于成熟度低的烟叶，且此阶段适熟和过熟烟叶色素急剧降解，多酚含量升高，表明酚类物质不会被大量氧化成醌而减少，不易发生棕色化反应。另外，多酚与POD活性之间的关系表明较低的POD活性既有利于多酚物质的形成又能防止酶促褐变的发生。

SOD和POD是烟叶内活性氧酶促防御系统的重要保护酶，其活性强弱反映了烟叶本身清除活性氧自由基的能力，即抗衰老能力和抗逆能力^[31]。POD是植物组织内分解H₂O₂的重要标志性酶，限制潜在的氧伤害，能防御细胞膜损伤和酚类物质过度氧化发生褐变反应。本研究显示：烘烤中烟叶POD 活性在过熟烟叶呈现先升高后降低，而欠熟和适熟烟叶呈现先升高后降低再升高再降低的趋势，均在 T3 阶段出现最大值且酶活性大小表现为 K>L>J，T3~T5阶段POD 活性急剧下降，说明POD在较高温度胁迫下稳定性较差，T4~T5期间POD活性为L>K>J。在植物逆境下，SOD能专一地清除生物氧化中的超氧阴离子自由基，故SOD活性在烟叶烘烤过程中起到重要保护作用，在酶促棕色化敏感期(定色期)尤为重要。试验中SOD活性随烟叶成熟度的不同而变化，随着烘烤的进行 SOD 活性在过熟烟叶呈现先降低后升高，而欠熟和适熟烟叶呈现先降低后升高再降低再升高的趋势，成熟度高的烟叶 SOD 活性先达到最低点，在T3~T5阶段SOD 活性逐渐缓慢升高。由此可见，SOD在较高温度下依然有较好的活性，有较好的耐高温特性。烘烤过程中，烟叶POD活性与SOD活性呈极显著负相关。这说明POD在烘烤前期起主要防御作用，SOD在烘烤后期起主要防御作用，这也与POD活性不耐高温而SOD较耐高温特性的结论相一致，故而SOD和POD一起组成烟叶烘烤过程中活性氧酶促防御系统。

4.   结论

烟叶烘烤过程中生理变化因成熟度不同而有所不同。综合各生理生化指标和其相关性的研究显示：适熟烟叶与其他成熟度烟叶相比其各生理生化指标均表现出更好的烘烤特性。过熟烟叶的表现和适熟烟叶相似或略差于适熟烟叶。欠熟烟叶表现不佳。针对过熟烟叶也可考虑在T4~T5阶段适当升高温度降低湿度来降低POD活性、增加SOD活性以提高烟叶的烘烤质量。总之烟叶烘烤过程中各生理指标变化是复杂相关的，不能单一根据某一指标变化来判断烟叶烘烤的特性和质量。烘烤过程是有促有控、控促结合的过程，各指标的恰当配合才能增进和改善烟叶的品质。