辣木(Moringa oleifera)为辣木科(Moringaeae)辣木属(Moringa)多年生速生树种，因其根具有辣味又称辣根树，共有13个种^[1]，主要分布于亚洲和非洲^[2]。中国主要引种了印度传统辣木、非洲辣木和印度改良辣木(PKM-1和PKM-2)，改良品种均由印度泰米尔纳都农业大学园艺学院研究所培育^[3]。辣木整株均有价值，其种子是优质的植物食用油原料^[4]，榨油所剩残渣还可用于制作净水剂^[5]，嫩梢可作蔬菜^[6]；辣木还可辅助治疗和缓解多种疾病，如糖尿病^[7]、高血脂^[8]和癌症^[9]等。辣木具有较高的经济价值，但其生产受虫害影响较大，其中以鳞翅目(Lepidoptera)草螟科(Crambidae)害虫辣木瑙螟(Noorda blitealis)危害尤为严重^[10]，可将叶片全部取食。

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中分离出的Bt基因，其表达产物BT杀虫蛋白对辣木瑙螟等鳞翅目昆虫具有特异性杀虫活性^[11]，目前研究较多的BT蛋白是CRY蛋白。经过几十年的发展，Bt基因中的Cry1-Ac和Cry2A等基因已经在玉米^[12]和棉花^[13]等植物的抗虫转基因中发挥了重要作用。修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CpTi)基因(signal pepetide-CpTi-KDEL，sck)来自豇豆的可食用部分，抗虫谱广，且对人畜无害^[14]，将该基因导入辣木可提高其抗虫性。将外源基因导入植物的方法很多，如农杆菌介导法、电击法和基因枪法等，其中农杆菌介导法具有成本低、转化效率高和重复性好等优点^[15]。

目前对辣木的研究多是关于其种质资源、栽培技术和药用价值等方面，也有研究者使用带有芽或是原基芽的外植体(如顶芽和茎节)来建立快繁体系^[16-17]，但关于辣木抗虫转基因方面的研究报道甚少。本研究以携带双价抗虫基因sck+Cry1-Ac的工程菌EHA105为供体，利用农杆菌介导遗传转化PKM-1的叶片和茎段，以期为辣木抗虫分子育种提供材料。

1.   材料与方法

1.1   供试材料、农杆菌菌株和质粒

以来源于云南省玉溪市元江县依江辣木产业开发有限公司、云南省红河州红河县红河谷辣木公司万年青基地、云南省农业科学院热区生态农业研究所元谋试验基地和云南农业大学温室多油辣木栽培种PKM-1为试验材料；供试农杆菌菌株EHA105以及质粒pRPBSCK-35SBt 均由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯研究员提供，质粒含利用内质网定位修饰的sck基因、密码子优化过的苏云金芽孢杆菌基因(Cry1-Ac)和nptⅡ基因，且具有卡那霉素抗性。

1.2   供试试剂

供试萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、卡那霉素、利福平和提门叮均购自源叶生物；DNA分子量标准DL5000和nptⅡ引物购自上海生工生物工程公司；植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3   外植体的获取

采收当年的辣木种子进行无菌苗诱导。选取无菌苗叶片或温室中种植辣木的叶片备用；其中，采自温室的叶片于流水下冲洗20 min后，使用75%酒精和NaClO消毒，无菌水清洗后使用灭菌手术刀切割为0.5 cm×0.5 cm的叶盘；茎段取自无菌苗，将无菌苗从培养瓶中取出，使用灭菌后的刀将茎切为约0.5 cm的茎段。

1.4   农杆菌菌液的制备

1.4.1   农杆菌的活化

取−80 ℃保存的农杆菌工程菌菌株于冰上解冻，在固体LB培养基上进行划线活化。LB培养基中加入50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平，划线后将培养皿倒置，于28 ℃恒温培养箱培养过夜。

1.4.2   农杆菌的摇菌

待农杆菌长出单菌落后，使用移液枪枪头挑取单菌落，连带枪头一起放入液体LB培养基中，加入50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素，28 ℃、200 r/min摇菌过夜。摇菌至对数生长期后取出。

1.4.3   农杆菌的重悬和稀释

使用分光光度计测定农杆菌菌液的OD₆₀₀值，之后在4 ℃、8000 r/min条件下离心5 min，弃上清液，使用含有乙酰丁香酮的液体MS培养基重悬并分别稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.3、0.4和0.5，冰上放置1 h后备用。

1.5   提门叮抑制农杆菌浓度的确定

为确定筛选培养过程中农杆菌抑制剂提门叮的浓度，将农杆菌菌液OD₆₀₀值调整至0.5，将叶片于菌液中浸泡4 min，无菌滤纸吸干多余菌液后将叶片分别接种于含50、100、150、200和250 mg/L提门叮的愈伤组织诱导培养基(MS+0.5 mg/L IBA+1.5 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L琼脂)中，观察不同质量浓度提门叮对农杆菌的抑制情况，并计算染菌率。染菌率=染菌的培养物数量/接种外植体数量×100%。每组接种10片叶片，重复3次。

1.6   外植体的预培养、共培养及筛选培养

1.6.1   预培养

侵染前，将辣木叶片和茎段外植体在28 ℃于愈伤组织诱导培养基上进行预培养，其中，叶片培养基为MS+0.5 mg/L IBA+1.5 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L琼脂，茎段培养基为MS+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L琼脂。

1.6.2   侵染及共培养

将经过0、1、2和3 d预培养的外植体于超净工作台中取出，分别放入稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.3、0.4和0.5的农杆菌菌液中，分别浸泡2、3和4 min，浸泡过程中轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触；使用无菌滤纸吸干外植体表面多余菌液，接种于共培养培养基(配方同1.6.1节)中。于28 ℃下避光共培养0、1、2和3 d，观察农杆菌生长情况。

1.6.3   筛选培养

将共培养结束的外植体取出，使用含有500 mg/L 提门叮的无菌水冲洗，无菌滤纸吸干多余水分，接种于筛选培养基上，其中，叶片培养基为MS+0.5 mg/L IBA+1.5 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L 琼脂+50.0 mg/L卡那霉素+200.0 mg/L提门叮，茎段培养基为MS+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+30.0 g/L 蔗糖+8.0 g/L 琼脂+50.0 mg/L卡那霉素+200.0 mg/L提门叮，筛选培养基中卡那霉素的质量浓度参照张慧等^[18]的研究。每隔15 d继代培养1次，防止培养基中抗生素失效。

1.7   转化条件的优化

设置不同预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮浓度的对比试验。其中预培养时间设置为0、1、2和3 d，菌液OD₆₀₀值设置为0.2、0.3、0.4和0.5，侵染时间设置为2、3和4 min，共培养时间设置为0、1、2和3 d，乙酰丁香酮浓度设置为0、50和100 μmol/L，观察不同处理对出愈率的影响。出愈率=形成愈伤的培养物数量/接种外植体数量×100%。每个处理接种40片叶片和20个茎段，均重复3次。

1.8   抗性愈伤组织的PCR鉴定及NPTⅡ ImmunoStrip检测

取辣木叶片和茎段来源的愈伤组织约100 mg于液氮预冷的研钵中磨碎，研磨过程中持续添加液氮，直至研磨为细粉末。使用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用PCR检测nptⅡ基因，目标片段约为700 bp。引物序列为：F1：5′-GAGGCTATCGGCTATGACTG-3′，R1：5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′。PCR反应体系为50 μL，其中模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR buffer 5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL， DNA聚合酶 1 μL，去离子水补足至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。

NPTⅡ蛋白检测采用NPTⅡ ImmunoStrip试纸条，参照说明书并略有改动。称取愈伤组织20 mg，置于1.5 mL Eppendorf管中，加入PEB1缓冲液400 µL，用塑料棒捣碎愈伤组织；采用台式离心机以10000 r/min离心2 min，取上清液300 µL至1.5 mL Eppendorf管中，将检测试剂条标有“sample”的一端插入上清液中，静置15 min，阳性愈伤组织将会出现2条带。

1.9   数据统计与分析

采用Excel 2007和SPSS进行数据统计和分析。

2.   结果与分析

2.1   抑制农杆菌的提门叮质量浓度

由表1可知：50、100和150 mg/L提门叮不能完全抑制农杆菌生长，而200和250 mg/L提门叮可以完全抑制农杆菌生长。考虑到抗生素的加入可能会影响外植体的生长，最终选定200 mg/L为筛选培养基中提门叮的工作质量浓度。

表  1  不同质量浓度提门叮对农杆菌的抑制

Table  1.  Inhibition of Agrobacterium tumefaciens by different mass concentrations of Timentin

c/(mg·L−1)	染菌率/%infection rate of bacteria
50	92.80±6.46 a
100	46.63±2.96 b
150	13.89±2.40 c
200	0±0 d
250	0±0 d
注：同列不同小写字母表示差异达显著水平 (P<0.05)；下同。 Note: Lowercase letters in the same row indicate significant differences (P<0.05); the same as below.

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2.2   不同预培养时间对农杆菌转化的影响

由表2可知：不经预培养的叶片在后续筛选中具有最高的出愈伤(10.84%)；预培养1 d时后续没有得到愈伤组织；预培养2 d时出愈率也较低(1.67%)，且叶片接种于筛选培养基后第17天首次观察到伤口处出现愈伤组织；预培养3 d时没有得到愈伤组织。此外，随着预培养时间的增加，茎段出愈率呈下降趋势，由预培养0 d的18.37%降低至预培养3 d的3.34%，且当预培养时间为3 d时，侵染前仅在1个茎段外植体的切口处观察到极少淡黄色愈伤组织，而不进行预培养的外植体后续愈伤长势较好，愈伤组织紧实，为淡黄色。

表  2  不同预培养时间对农杆菌转化的影响

Table  2.  Effects of different preculture times on the Agrobacterium-mediated transformation

外植体 explants	预培养时间/d preculture time	出愈率/% callus induction rate
叶片 leaves	0	10.84±1.45 a
	1	0±0 b
	2	1.67±1.44 b
	3	0±0 b
茎段 stems	0	18.37±0.32 a
	1	16.67±2.88 a
	2	6.26±0.39 b
	3	3.34±2.90 b

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2.3   不同菌液OD₆₀₀值对农杆菌转化的影响

由表3可知：随着侵染农杆菌菌液OD₆₀₀值的增大，叶片出愈率逐渐降低，由OD₆₀₀值为0.2时的8.30%降低至OD₆₀₀值为0.5时的0，且当侵染菌液OD₆₀₀值为0.2时，叶片在接种于筛选培养基后15 d首次观察到叶片愈伤组织；随着侵染农杆菌菌液OD₆₀₀值的增大，茎段出愈率逐渐降低，由OD₆₀₀值为0.2时的14.77%降低至OD₆₀₀值为0.5时的0，且当OD₆₀₀值为0.2时，茎段在接种于筛选培养基后10 d首次观察到愈伤组织，愈伤组织为淡黄色，质地紧实。

表  3  不同菌液OD₆₀₀值对农杆菌转化的影响

Table  3.  Effects of different OD₆₀₀ value for bacterial on the Agrobacterium-mediated transformation

外植体 explants	OD600值 OD600 value	出愈率/% callus induction rate
叶片 leaves	0.2	8.30±1.05 a
	0.3	5.78±0.77 b
	0.4	2.50±0.00 c
	0.5	0±0 d
茎段 stems	0.2	14.77±1.34 a
	0.3	11.67±2.88 a
	0.4	8.15±1.29 b
	0.5	0±0 b

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2.4   不同侵染时间对农杆菌转化的影响

由表4可知：当侵染时间为2 min时，叶片出愈率最高，为14.17%；随着侵染时间的增加，茎段出愈率逐渐降低，当侵染时间为2 min时出愈率最高(13.26%)，当侵染时间为4 min时出愈率最低(8.33%)。

表  4  不同侵染时间对农杆菌转化的影响

Table  4.  Effects of different infiltration time on the Agrobacterium-mediated transformation

外植体 explants	侵染时间/min infiltration time	出愈率/% callus induction rate
叶片 leaves	2	14.17±1.44 a
	3	11.67±1.44 a
	4	12.50±2.50 a
茎段 stems	2	13.26±2.40 a
	3	9.55±2.22 a
	4	8.33±2.88 a

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2.5   不同共培养时间对农杆菌转化的影响

由表5可知：不进行共培养时，叶片出愈率为0；共培养1 d时，叶片出愈率较低；共培养2 d时，叶片出愈率为11.67%；共培养3 d时，农杆菌数量增加，叶片周围菌液变得浑浊且黏稠，在清洗除菌时需使用镊子将叶片表面农杆菌菌体剥下。此外，不进行共培养时，没有获得茎段愈伤组织；共培养1 d时，茎段出愈率较低(3.33%)；共培养2 d时，茎段出愈率最高 (16.17%)，茎段周围开始出现透明水渍状的农杆菌菌落，但面积较小；共培养3 d时，茎段与培养基接触面周围已经出现浑浊且黏稠的农杆菌菌液，远离培养基的茎段表面也能观察到少量农杆菌。

表  5  不同共培养时间对农杆菌转化的影响

Table  5.  Effects of different coculture time on the Agrobacterium-mediated transformation

外植体 explants	共培养时间/d coculture time	出愈率/% callus induction rate
叶片 leaves	0	0±0 d
	1	4.82±1.79 b
	2	11.67±1.44 a
	3	2.5±0.00 c
茎段 stems	0	0±0 b
	1	3.33±2.88 b
	2	16.17±3.58 a
	3	13.33±2.88 a

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2.6   不同乙酰丁香酮浓度对农杆菌转化的影响

乙酰丁香酮浓度为0、50和100 μmol/L时，叶片出愈率分别为(9.15±0.75)%、(10.80±0.98)%和(9.98±2.18)%，三者间无显著差异，说明乙酰丁香酮添加与否以及添加浓度不同都可以获得一定的出愈率。

2.7   抗性愈伤组织的PCR鉴定及NPTⅡ ImmunoStrip检测

以nptⅡ基因序列为模板设计引物，PCR检测愈伤组织中nptⅡ基因，结果(图1)显示：目标片段约为700 bp，3个叶片愈伤组织中有2个检测出nptⅡ基因，5个茎段愈伤组织中有3个检测出nptⅡ基因，即PCR检测呈阳性。由图2可知：PCR检测呈阳性的愈伤组织蛋白水平均表达正常，可初步判定sck+Cry1-Ac基因已经导入辣木叶片和茎段的愈伤组织中。由图3可知：含有nptⅡ基因的抗性愈伤组织能够在含一定浓度卡那霉素的培养基上正常生长，而不含有nptⅡ基因的非抗性愈伤组织接种于含一定浓度卡那霉素的培养基上一段时间后会死亡。

图  1 

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注：M. DNA marker；1. 阳性对照，含npt Ⅱ的质粒DNA；2~4. 叶片愈伤组织；5. 空白对照，未进行侵染的愈伤组织；6~10. 茎段愈伤组织。

Figure  1. 

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Note: M. DNA marker; 1. positive control, plasmid DNA containing npt Ⅱ; 2-4. leaf callus; 5. CK, callus without infection; 6-10. stem segment callus.

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图  2  NPTⅡ蛋白检测

注：出现1条带表示试剂检测正常但无NPTⅡ蛋白，出现2条带表示NPTⅡ蛋白检测为阳性。

Figure  2.  NPTⅡ ImmunoStrip test

Note: The one band indicates the test kit works but without NPTⅡ protein, two bands indicates NPTⅡ protein is positive.

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图  3  部分辣木叶片愈伤组织

注：1和2为抗性愈伤组织，3和4为非抗性愈伤组织。

Figure  3.  PKM-1 leaf and stem segment callus

Note: 1 and 2 are resistant callus, 3 and 4 are non-resistant callus.

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3.   讨论

要建立高效的遗传转化体系，抗生素浓度、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和共培养时间等的选择尤为重要。由于辣木抗虫转基因方面的研究报道甚少，故目前只能对比参考其他植物的研究结果。提门叮是由提卡霉素和β-内酰胺酶抑制剂形成的抗生素，适合的质量浓度能够有效抑制农杆菌生长，同时对外植体的生长以及愈伤组织的诱导和分化影响较小。本研究最终确定提门叮的工作质量浓度为200 mg/L，该质量浓度的提门叮能够完全抑制农杆菌的生长，农杆菌过度繁殖可对外植体产生毒害最终导致外植体死亡，这与王芳等^[19]对紫雨桦的研究结果相同，也证明了适宜抗生素浓度对于遗传转化的重要性。对外植体进行造伤处理是影响遗传转化的重要因素，常用方法有负压、超声波和切割等，伤口的存在可以使外植体处于代谢活跃的状态，促进细胞分裂，该状态下的细胞更易于整合外源基因^[20]。本研究所得较适预培养时间为0 d，即不进行预培养，其原因可能是预培养过程中外植体伤口发生了愈合，对后续农杆菌的侵染和T-DNA区段的整合产生影响，这与前人对大白菜^[21]和菊苣^[22]的研究结果相同。较低的侵染菌液浓度可以保证后续顺利除菌，但可能不利于T-DNA区整合；而过高的侵染菌液浓度则会导致后续除菌困难，且不同植物对农杆菌的耐受能力不同。由于本研究所使用的辣木幼嫩叶片较薄，侵染时菌液浓度过高可能会导致外植体受到不可逆损伤或是后续筛选培养过程中除菌困难，因此本研究最终确定菌液较适OD₆₀₀值为0.2，这与江帅菲等^[23]对枫香的研究结果相同。

本研究中，不同侵染时间对叶片和茎段的出愈率影响不显著，推测可能是因为设置的时间梯度较小，在后续的试验中应增加时间梯度或是增加梯度数量。农杆菌介导的外源基因导入并不能在一瞬间完成，共培养的目的是为农杆菌T-DNA的整合提供时间，若共培养时间过短，农杆菌T-DNA区的转移过程不能完成；若共培养时间过长，培养基上过度繁殖的农杆菌可能会对外植体产生毒害作用。此外，共培养的温度和光照等也会对农杆菌介导的遗传转化产生影响，本研究仅探究了共培养时间对农杆菌介导的遗传转化的影响，其余条件还需后续进行研究。本研究所得的较适共培养时间为2 d，与苏振华等^[24]对甜椒的研究结果相同。由农杆菌介导的 T-DNA 加工和输出到植物细胞的过程在很大程度上受Ti质粒携带的毒力基因(Vir基因)活性所影响，Vir基因可以激活T-DNA区的转移^[25]。植物受到创伤后，受创细胞释放出的酚类化合物(如乙酰丁香酮)和糖类信号分子会诱导农杆菌Vir基因的表达，因此，在遗传转化过程中加入乙酰丁香酮可以在一定程度上提高转化效率。在遗传转化试验中，是否加入乙酰丁香酮都可以获得一定的转化率，需要根据受体材料和菌株种类所决定^[26]。本研究所使用的菌株为EHA105，该菌株所合成的冠瘿碱分解产物为糖类物质，转化过程中加入乙酰丁香酮可以提高转化效率，但最终结果表明不同乙酰丁香酮浓度对出愈率的影响不显著，这与郭利军等^[27]对菠萝的研究结果相同，推测原因是辣木本身含有乙酰丁香酮，所以乙酰丁香酮加入与否以及加入浓度不同对农杆菌转化均无明显影响。

4.   结论

本研究以携带双价抗虫基因 sck+Cry1-Ac 的工程菌EHA105为供体，利用农杆菌介导转化PKM-1 叶片和茎段并获得转化后的愈伤组织； PCR和NPTⅡ ImmunoStrip检测结果表明：nptⅡ基因已整合至愈伤组织，且蛋白表达水平正常。研究结果可为辣木抗虫分子育种提供材料。