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昆明市某猪场猪戊型肝炎病毒流行情况调查

王源, 郑晓林, 严红亚, 段新慧, 张以芳, 杨莎莎, 李文贵

王源, 郑晓林, 严红亚, 等. 昆明市某猪场猪戊型肝炎病毒流行情况调查[J]. 云南农业大学学报（自然科学）, 2020, 35(6): 1111-1114. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).201907009
引用本文: 王源, 郑晓林, 严红亚, 等. 昆明市某猪场猪戊型肝炎病毒流行情况调查[J]. 云南农业大学学报（自然科学）, 2020, 35(6): 1111-1114. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).201907009
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Yuan WANG, Xiaolin ZHENG, Hongya YAN, et al. Study on the Prevalence of Hepatitis E Virus in a Swine Farm in Kunming City[J]. JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY（Natural Science）, 2020, 35(6): 1111-1114. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).201907009
Citation: Yuan WANG, Xiaolin ZHENG, Hongya YAN, et al. Study on the Prevalence of Hepatitis E Virus in a Swine Farm in Kunming City[J]. JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY（Natural Science）, 2020, 35(6): 1111-1114. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).201907009
shu

昆明市某猪场猪戊型肝炎病毒流行情况调查

  • 1.

    云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201

  • 2.

    云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224

  • 3.

    云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201

基金项目: 国家自然科学基金项目（31160495）
详细信息
    作者简介:

    王源（1995—），女，辽宁朝阳人，在读硕士研究生，主要从事兽医公共卫生学研究。E-mail：721736168@qq.com

    通信作者:

    李文贵（1972—），男，云南昆明人，博士，教授，主要从事兽医公共卫生学研究。E-mail：li.wengui@qq.com

摘要:
目的了解昆明市某猪场戊型肝炎病毒感染情况，进一步探究病毒基因型及分子进化情况，为戊型肝炎防控提供参考。
方法从该猪场随机采集39份新鲜粪便，用逆转录巢式聚合酶链反应对HEV ORF2部分基因片段扩增、克隆及测序；应用生物信息学软件进行同源性分析并构建系统进化树。
结果PCR检测结果发现：该猪场核酸阳性率达35.9% (14/39)。同源性分析结果表明：14株流行毒株核苷酸序列与GenBank中HEV I~IV 型参考株的同源性分别为77.4%~83.9%、81.0%~83.2%、78.8%~86.9%和90.5%~98.5%，全部流行株均属基因IV型。进化分析结果表明：YN-KM-9与该猪场其他流行毒株同源性较远，应属不同基因亚型。
结论该猪群HEV IV感染率较高，对公共卫生安全构成潜在威胁。

 

Study on the Prevalence of Hepatitis E Virus in a Swine Farm in Kunming City

  • 1.

    College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

  • 2.

    Yunnan Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Kunming 650224, China

  • 3.

    College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

Abstract:
PurposeTo determine the hepatitis E infection situation in a pig farm of Kunming City, Yunnan Province, further explore the virus genotype and molecular evolution, and provide a reference for the prevention and control of hepatitis E.
MethodThirty-nine fresh fecal samples were randomly collected from the target a pig farm. The reverse transcription nested polymerase chain reaction (RT-nPCR) was used to detect the ORF2 gene of swine hepatitis E virus. After cloning and sequencing, bioinformatics software was used for homology analysis and the phylogenetic tree was constructed.
ResultRT-nPCR detection results found that the positive rate was 35.9% (14/39). The analysis results showed that homologies between 14 detected strains and genotype I-IV represents were 77.4%-83.9%, 81.0%-83.2%, 78.8%-86.9% and 90.5%-98.5%, respectively, indicating that all the prevalence strains belongs to HEV type IV. Evolutionary analysis showed that YN-KM-9 is away from other prevalence strains and should belong to different sub-genotypes.
ConclusionThe HEV IV infection rate of this pig herd is relatively high, posing a potential threat to public health safety.

 

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  • 戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的家族成员，是一种单股正链RNA病毒[1]。HEV的传播风险包括食用未煮熟的猪肉、贝类等海鲜和鹿肉等，尤其是动物的实质器官(如肝脏等)。中国猪群中HEV感染率较高，核酸阳性率约10%，血清流行率60%~100%[2-3]。在中国戊型肝炎已经发展成感染率高、难以防控的疾病，正威胁着人们的健康。此外，由于人体器官来源非常有限，猪是未来异体器官移植良好的替代供体，而其所携带的HEV等人畜共患病病原又对人的健康构成威胁。本研究旨在调查昆明某猪场戊型肝炎病毒的感染、病毒基因型及分子进化情况，为戊型肝炎防控提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   试验材料

    按随机抽样法，从云南省昆明市某散养户300多头2~6月龄猪中采集39份新鲜猪粪便样品，放置−80 ℃冰箱冷冻保存备用。

    1.2   主要试剂

    RNA提取试剂TRIZOL、逆转录试剂盒(Easy First-Strand cDNA Super Mix)、2x×TransTag HIFI Mix II、Marker、凝胶快速回收试剂盒(EasyPureQuick Gel ExtractionKit)、质粒小量提取KIT、pEASY-T1载体和感受态细胞(Trans1-T1)等购自北京全式金公司，氯仿、异丙醇和75%乙醇等为分析纯试剂。

    1.3   引物合成

    采用巢式PCR扩增目的基因片段[4]，引物由昆明硕擎生物技术公司合成。

    1.4   TotalRNA的提取及目的基因的扩增

    取少量粪便，加入0.5 mL生理盐水，充分混匀后，4 ℃冰箱放置过夜；4 ℃，2 000 r/min，5 min；4 ℃，10 000 r/min，5 min；取300 μL上清，用Trizol法提取RNA (RNA保存于−80 ℃)。cDNA的合成：2×TS Reaction Mix 5 μL，TS (TransScriptTM Two-step RT/RI Enzyme Mix) 0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNA 4 μL，总反应体系10 μL，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。第一轮PCR扩增总反应体系为20 μL：上游引物和下游引物各0.5 μL，2×TransTag HIFI Mix II 10 μL，DEPC水7 μL，cDNA 2 μL；反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，35个循环，72 ℃ 延伸7 min。将第一轮PCR产物作为模板稀释50倍，进行第二轮扩增。第二轮PCR扩增总反应体系为20 μL：上游引物和下游引物各0.5 μL，2×TransTag HIFI Mix II 10 μL，DEPC水8 μL，cDNA 1 μL；反应条件与第一轮相同，循环次数25次。

    1.5   目的基因的回收、基因克隆及测序

    PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR产物用凝胶快速回收试剂盒(EasyPureQuick Gel Extraction Kit)回收纯化，连接到pEASY-T1载体转化到Trans1-T1，提取质粒后送至昆明硕擎生物技术公司测序。

    1.6   序列分析及遗传进化树构建

    从GeneBank中选择32条HEV基因 I型至IV型的代表序列(表1)，用DNASTAR软件分析序列的同源性，利用MEGA 6.0生物信息学软件构建遗传进化树。

    表  1  同源性分析戊型肝炎病毒参考序列
    Table  1.  Hepatitis E virus reference sequences used in homology analysis
    基因型
    genotype    		登录号
    accession No.    		宿主
    hosts    		分离地
    origins
    I AF444002 人 human 美国 USA
    AF076239 人 human 印度 India
    D10330 人 human 缅甸 Myanmar
    M80581 人 human 巴基斯坦 Pakistan
    M94177 人 human 中国河北
    Hebei, China
    NC001434 人 human 中国新疆
    Xinjiang, China
    D11092 人 human 中国新疆
    Xinjiang, China
    II M74506 人 human 墨西哥 Mexico
    III AP00340 人 human 日本 Japan
    AY115488 猪 swine 加拿大 Canada
    AF060668 人 human 美国 USA
    AF082843 猪 swine 美国 USA
    FJ527832 猪 swine 中国上海
    Shanghai, China
    JQ679014 人 human 英国 UK
    FJ956757 人 human 德国 Germany
    EU375463 猪 swine 泰国 Thailand
    AB222184 野猪 wild boar 日本 Japan
    IV HQ634346 人 human 中国台湾
    Taiwan, China
    KC163335 人 human 中国山东
    Shandong, China
    FJ610232 猪 swine 中国甘肃
    Gansu, China
    EU676172 猪 swine 中国广西
    Guangxi, China
    JX855794 猪 swine 中国广东
    Guangdong, China
    AB197674 人 human 中国上海
    Shanghai, China
    AY594199 猪 swine 中国新疆
    Xinjiang, China
    GU119961 猪 swine 中国新疆
    Xinjiang, China
    KM253769 猪 swine 中国河南
    Henan, China
    JQ993308 猪 swine 中国江苏
    Jiangsu, China
    KC692453 猪 swine 中国山东
    Shandong, China
    AY723745 猪 swine 印度 India
    DQ079628 野猪 wild boar 日本 Japan
    KF736234 牦牛 bos grunniens 中国 China
    KJ816337 毛蚶 scapharca subcrenata 中国 China
    AY535004 禽 avian 美国 USA
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    2.   结果与分析

    2.1   巢式PCR扩增结果

    巢式PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳100 V 35 min后，可见1条约137 bp特异性条带(图1)。39份粪便样品的检测结果显示：阳性14份，阳性率为35.9%。

    图  1  巢式RT-PCR产物电泳结果
    注：M. DNA分子量标记 DL1000；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. 样品。
    Figure  1.  Agarose gel electrophoresis of fragment amplified by RT-nested PCR
    Note: M. DNA Marker DL1000; 1. negative control; 2. positive control; 3. sample.
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    2.2   系统进化分析

    与32条参考序列进行同源性分析结果表明：所检测到的14株流行HEV株 ORF2基因核苷酸序列与 HEV I~IV 型的同源性分别为 77.4%~83.9%、81.0%~83.2%、78.8%~86.9%和90.5%~98.5%，属基因IV型。进化分析表明：YN-KM-9流行株与其他毒株同源性较远，应属不同基因亚型(图2)。

    图  2  基于ORF2基因核苷酸序列的系统进化分析
    注：代表14株流行HEV株。
    Figure  2.  Phylogenetic analysis based on ORF2 gene nucleotide sequence
    Note: represent 14 epidemic HEV strains.
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    3.   讨论

    戊型肝炎病毒是人病毒性肝炎的重要病原之一，全球每年超过百万人感染，被世界卫生组织认定为影响发展中国家的重要公共卫生问题[5]。HEV引起的戊型肝炎感染通常是一种自限性疾病，偶尔也能导致大规模的肝炎暴发。目前已知的HEV宿主有猪、野猪、禽类、牦牛和毛蚶等，猪是最重要的潜在传染源[6]。中国猪饲养量大且与人类关系密切，而云南很多偏远农村甚至还存在人猪混住的现象，猪群HEV的传播流行对人构成重大威胁，不容忽视。掌握当地猪群戊型肝炎病毒流行情况是防控人戊型肝炎的必要前提[7]。

    中国在调查猪群HEV感染方面已做了大量的工作。广东地区对300份猪粪便和猪肝进行检测，共检测到81份阳性样品，阳性率为46.7%。江苏盐城地区的747份猪粪便样品的病原学检测结果显示：阳性样品共86份，阳性率为11.5%[8-9]。本次调查发现HEV核酸流行率高于此前的报道，原因应与样品来源于散养户有关。该病毒主要以粪口途径传播，与环境卫生关系密切。规模化饲养场大多设有粪污处理设施，生物安全防护措施完善，散养户与规模化猪场相比，卫生条件较差，排泄物不能及时清除，猪群的随意流动和误食导致该病毒感染率高。此前研究已证实流行率与养殖规模有关联[10]。

    近年来，各国科学家在细胞培养体系和感染模型建立等限制戊型肝炎研究的瓶颈问题上已获较大突破，有望加速对该病的致病机理、人和动物间传播模式等研究[11-12]。与此同时，越来越多的学者也开始关注HEV在人与人、人与动物、动物与动物间的越种传播机制以及HEV基因型、亚型与致病性和宿主选择的分子基础等长期以来悬而未决的问题。

  • 图  1   巢式RT-PCR产物电泳结果

    注：M. DNA分子量标记 DL1000；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. 样品。

    Figure  1.   Agarose gel electrophoresis of fragment amplified by RT-nested PCR

    Note: M. DNA Marker DL1000; 1. negative control; 2. positive control; 3. sample.

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    图  2   基于ORF2基因核苷酸序列的系统进化分析

    注：代表14株流行HEV株。

    Figure  2.   Phylogenetic analysis based on ORF2 gene nucleotide sequence

    Note: represent 14 epidemic HEV strains.

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    表  1   同源性分析戊型肝炎病毒参考序列

    Table  1   Hepatitis E virus reference sequences used in homology analysis

    基因型
    genotype    		登录号
    accession No.    		宿主
    hosts    		分离地
    origins
    I AF444002 人 human 美国 USA
    AF076239 人 human 印度 India
    D10330 人 human 缅甸 Myanmar
    M80581 人 human 巴基斯坦 Pakistan
    M94177 人 human 中国河北
    Hebei, China
    NC001434 人 human 中国新疆
    Xinjiang, China
    D11092 人 human 中国新疆
    Xinjiang, China
    II M74506 人 human 墨西哥 Mexico
    III AP00340 人 human 日本 Japan
    AY115488 猪 swine 加拿大 Canada
    AF060668 人 human 美国 USA
    AF082843 猪 swine 美国 USA
    FJ527832 猪 swine 中国上海
    Shanghai, China
    JQ679014 人 human 英国 UK
    FJ956757 人 human 德国 Germany
    EU375463 猪 swine 泰国 Thailand
    AB222184 野猪 wild boar 日本 Japan
    IV HQ634346 人 human 中国台湾
    Taiwan, China
    KC163335 人 human 中国山东
    Shandong, China
    FJ610232 猪 swine 中国甘肃
    Gansu, China
    EU676172 猪 swine 中国广西
    Guangxi, China
    JX855794 猪 swine 中国广东
    Guangdong, China
    AB197674 人 human 中国上海
    Shanghai, China
    AY594199 猪 swine 中国新疆
    Xinjiang, China
    GU119961 猪 swine 中国新疆
    Xinjiang, China
    KM253769 猪 swine 中国河南
    Henan, China
    JQ993308 猪 swine 中国江苏
    Jiangsu, China
    KC692453 猪 swine 中国山东
    Shandong, China
    AY723745 猪 swine 印度 India
    DQ079628 野猪 wild boar 日本 Japan
    KF736234 牦牛 bos grunniens 中国 China
    KJ816337 毛蚶 scapharca subcrenata 中国 China
    AY535004 禽 avian 美国 USA
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    • 参考文献(12)
  • [1] 张厚勇. 猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查及ORF2区的克隆和表达[D]. 武汉: 华中农业大学, 2010.
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    [3] 王佑春, 张华远, 崔鹏, 等. 戊肝病毒(HEV)在猪和牛群中的流行病学研究[J]. 中国预防医学杂志, 2002, 3(3): 199. DOI: 10.3969/j.issn.1009-6639.2002.03.011.
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    INOU E J, TAKAHASHI M, YAZAKI Y, et al. Development and validation of an improved RT-PCR assay with nested universal primers for detection of hepatitis E virus strains with significant sequence divergence[J]. Journal of Virological Methods, 2006, 137: 325. DOI: 10.1016/j.jviromet.2006.07.004.
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    PAVIO N, MENG X J, RENOU C. Zoonotic hepatitis E: animal reservoirs and emerging risks[J]. Veterinary Research, 2010, 41(6): 46. DOI: 10.1051/vetres/2010018.
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    FU R M, DECKER C C, THI V L D. Cell culture models for hepatitis E virus[J]. Viruses, 2019, 11(7): 608. DOI: 10.3390/v11070608.
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    • 相关文章
    • 施引文献(4)

  • 期刊类型引用(3)

    1. 吴静波，南文金，胡鸿惠，黄健强，彭国良. 5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立. 中国兽医杂志. 2024(03): 18-26 . 百度学术
    2. 王树鹏，方苓，任可，刘锦龙，张宇，白慧敏. 内蒙古包头地区猪戊型肝炎病毒的流行特征及其ORF2分子特征分析. 中国预防兽医学报. 2024(12): 1293-1297 . 百度学术
    3. 杨国琴，王国君，宋春莲，蔡懿琳，武鑫，柴俊，李文贵，朱培英. 云南省临沧市猪戊型肝炎病毒流行株遗传进化分析. 中国动物检疫. 2023(08): 28-33 . 百度学术

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出版历程
  • 通信作者:  李文贵 li.wengui@qq.com
  • 收稿日期:  2019-06-30
  • 修回日期:  2020-05-08
  • 网络首发日期:  2020-11-29

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  • 1.   材料与方法

  • 1.1   试验材料

  • 1.2   主要试剂

  • 1.3   引物合成

  • 1.4   TotalRNA的提取及目的基因的扩增

  • 1.5   目的基因的回收、基因克隆及测序

  • 1.6   序列分析及遗传进化树构建

  • 2.   结果与分析

  • 2.1   巢式PCR扩增结果

  • 2.2   系统进化分析

  • 3.   讨论

参考文献(12)
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