茜草制诃子多糖的提取工艺研究
Study on the Extraction Process of Rubia cordifolia L. Processed Terminalia chebula Retz Polysaccharide
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玉米是全球也是中国第一大作物，在保障国家粮食安全中占有重要地位[1-3]。光是最主要的环境因子之一，光合作用是玉米光合物质生产和产量形成的重要因素。黄淮海区域光温资源丰富，但利用率低，光能利用率仅为1%~2%，远低于作物理论最大光能利用率5%~6%[4]。在温度、降水和辐射3个气象因素中，太阳辐射降低对玉米产量的不利影响大于前两者[5-6]。目前由于气候变化和环境污染等问题，中国大部分地区都出现太阳辐射减弱的问题[7]；再加上玉米花粒期的阴雨天气，导致玉米减产较为严重[8]。然而光强是作物生长过程中最难调控的环境因素之一。氮是玉米生长发育及产量形成所需要的主要营养元素之一，其营养状况的好坏，影响玉米的光合速率及干物质形成[9-10]。玉米是高光效C4植物，对氮肥需求高而快，然而大量施用氮肥既增加种植成本，又会对农产品的品质安全和生态环境造成不良影响[10-12]。因此，研究弱光条件下氮肥合理施用问题，对生产实践具有重要的指导意义。然而目前研究以烟草和蔬菜较多，禾本科作物的研究相对较少[13]。如云菲等[14]研究显示：弱光条件下增施氮肥可改善烟株的光合性能，促进体内碳氮代谢平衡。李会合等[15]报道：低光照下控制氮肥施用量并增加钾肥用量，在莴苣上可获得良好的增产效果。最近，宋航等[16]的研究结果显示：适量增施氮肥可以部分弥补弱光胁迫对玉米生长发育的影响，缓解弱光胁迫对玉米氮素吸收利用的影响，提高玉米的物质生产能力，改善植株体内干物质分配，增加产量。我们先前对气孔特征的研究显示：在不同施氮水平，玉米气孔开度、气孔频度和气孔导度均随光照强度的增加而增加；但在相同光照条件下，三者皆随氮素供应的增加而降低[17]。此基础上，我们进一步探讨光氮互作条件下玉米生长发育特征及光合生理机制，旨在为通过合理施肥减轻玉米弱光胁迫、促进玉米稳产增收提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地点概况
本试验在河南省开封市河南大学试验田进行，开封地处N34°11′45″~35°01′20″，E113°52′15″~115°15′42″，土壤多为沙壤土，属黄河下游大冲积扇南翼。该区属暖温带大陆性季风型气候，年平均气温14.24~14.50 ℃，无霜期213~215 d，年平均降雨量为670 mm。
1.2 试验设计
采用土培盆栽试验，选用聚乙烯塑料盆(高34 cm，内径36.5 cm)，每盆装土25 kg，土壤类型为黄河沉积物发育的黄潮土，土壤有机质16.5 g/kg，全氮0.8 g/g。
试验采用两因素随机区组试验设计，二因素分别为氮肥用量和光照条件。氮肥用量设置为纯氮65 kg/hm2 (N1)、130 kg/hm2 (当地农田施肥标准，N2)和260 kg/hm2 (N3) 3个水平，氮肥品种选用金正大树脂包膜尿素(N，34%)；光照条件设自然光(L1)和遮光(L2) 2个水平，自然光处理即全生育自然光照，遮光处理即在一层遮阳网罩住的遮阳棚中进行，经光合测定仪测得在自然光和遮光条件下的光合有效辐射均值分别为1 128.44和576.26 µmol/(m2·s)。每个处理4次重复，共24盆。6月25日播种，每盆保留2穴，每穴3粒；三叶期剔苗，每穴1株，每盆保留2株；7月12日一次性施入氮肥。
供试玉米品种为豫玉22号。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 农艺指标及干物质量
从5叶期定期测量玉米株高，分别于拔节期、抽雄期、抽穗期和灌浆期测定根长；于灌浆期测定不同部位叶片长、宽和叶面积以及不同器官干质量，其中叶面积测定采用LA-S叶面积测定仪，干质量测定采用千分之一天平，其余均采用直尺测量。
1.3.2 光合特性
分别于拔节期、抽雄期和抽穗期，采用美国LI-COR公司生产的Li-6400便携式光合测定仪测定玉米功能叶片(拔节期是最新全展叶，抽雄和抽穗期是穗位叶)光合参数。测定时间为8：30~11：40，使用红蓝光源，光量子通量密度(PFD)为1 200 µmol/(m2·s)，叶室(2 cm×3 cm)内温度设定为30 ℃。
1.3.3 叶绿素含量
分别于拔节期、抽雄期、抽穗期和灌浆期采集玉米功能叶片，采用95%乙醇浸提比色法测定其叶绿素含量。首先称取新鲜玉米叶片约0.1 g，然后加2 mL 95%乙醇研磨成浆，用95%乙醇定容至终体积10 mL，4 000 r/min下离心10 min，上清液分别于665和649 nm处测定吸光值。
1.3.4 可溶性糖含量
采用蒽酮比色法测定拔节期、抽雄期、抽穗期和灌浆期玉米功能叶片以及抽雄期、抽穗期和灌浆期茎部可溶性糖含量。首先将玉米样品105 ℃杀青，65 ℃烘干，磨碎后称取0.5 g，然后用80%乙醇提取离心，重复3次，合并上清液；定容至10 mL，吸取0.1 mL，加入3 mL蒽酮试剂90 ℃水浴15 min，620 nm处测定吸光值。
1.4 数据统计分析
采用Excel 2007进行数据处理，SPSS 17.0进行方差分析，LSD法进行多重比较。
2. 结果与分析
2.1 不同光照强度和氮素水平对玉米株高和根长生长动态的影响
由图1可知：随着生育期的推进，玉米呈现先缓慢—后快速—再缓慢的生长态势，且生育前期各处理株高差异较小，后期差异逐渐增大。8月15日，3个自然光处理的玉米株高均大于遮阴处理，且以N1处理最高，N2处理最低；3个遮阴处理不同施氮量间无显著差异。之后，自然光条件下N2处理的玉米生长最为迅速，并逐渐超过N1和N3处理；而遮阴条件下，则以N3处理生长最为迅速。图1还显示：自然光条件下，拔节期和抽穗期玉米根长随施氮量增加而逐渐降低，抽雄期，N1和N2处理间无显著差异，但均显著高于N3处理，而灌浆期则以N2处理最低；遮阴条件下，拔节期和抽雄期均以N2处理最高，抽穗期和灌浆期则以N1处理最高。该结果说明：遮阴对玉米地上部生长的抑制作用大于地下部，且高氮处理有利于地上部生长，而低氮处理有利于地下部生长。
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图 1 不同光照强度和氮素水平对玉米茎秆和根系生长动态的影响注：L1N1. 自然光条件下，施纯氮65 kg/hm2；L1N2. 自然光条件下，施纯氮130 kg/hm2；L1N3. 自然光条件下，施纯氮260 kg/hm2；L2N1. 遮阴条件下，施纯氮65 kg/hm2；L2N2. 遮阴条件下，施纯氮130 kg/hm2；L2N3. 遮阴条件下，施纯氮260 kg/hm2。不同小写字母表示同一时期不同处理间差异显著(P<0.05)；下同。Figure 1. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the growth trend of the shoot and root of maizeNote: L1N1. the applying nitrogen amount was 65 kg/hm2 under natural light condition; L1N2. the applying nitrogen amount was 130 kg/hm2 under natural light condition; L1N3. the applying nitrogen amount was 260 kg/hm2 under natural light condition; L2N1. the applying nitrogen amount was 65 kg/hm2 under shading condition; L1N2. the applying nitrogen amount was 130 kg/hm2 under shading condition; L1N3. the applying nitrogen amount was 260 kg/hm2 under shading condition. Different small letters indicate significant difference between treatments at P<0.05 at the same stages; the same as below.2.2 不同光照强度和氮素水平对灌浆期玉米叶片生长的影响
表1 显示：3个自然光处理的不同部位玉米叶片叶长、叶宽、叶面积和叶鞘长均基本高于遮阴处理，其中穗位叶各项指标均以N2处理最低，N1和N3处理间无显著差异；3个遮阴处理叶长以N1处理最低，叶宽以N3处理最低，N2处理的叶面积显著高于N1和N3处理，但其叶鞘长最低。自然光条件下，上部叶的叶长、叶宽和叶面积也均以N2处理最低，叶鞘长则以N1处理最高；3个遮阴处理的叶长和叶面积以N3处理最低，N2处理的叶宽最高，但叶鞘长最低。自然光条件下，下部叶的叶长、叶宽和叶面积以N2处理最低；遮阴条件下，以N2处理最高；两种光照条件下叶鞘长不同施氮量间均无显著差异。该结果说明：遮阴严重影响玉米不同部位叶片生长，中氮处理的玉米叶片在自然光条件下最小，遮阴条件下则最大。
表 1 不同光照强度和氮素水平对灌浆期玉米叶片生长的影响Table 1. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the growth of maize leaves at filling stage处理treatment 穗位叶ear leaves 上部叶upper leaves 下部叶lower leaves 叶长/cm leaf length 叶宽/cm leaf width 叶面积/cm2 leaf area 叶鞘长/cm leaf sheath length 叶长/cm leaf length 叶宽/cm leaf width 叶面积/cm2 leaf area 叶鞘长/cm leaf sheath length 叶长/cm leaf length 叶宽/cm leaf width 叶面积/cm2 leaf area 叶鞘长/cm leaf sheath length L1N1 81.75 a 8.10 a 662.18 a 13.90 a 73.88 a 8.55 a 631.63 a 14.08 a 87.23 a 7.93 a 691.26 a 14.50 a L1N2 71.54 b 7.64 b 546.57 b 13.08 b 67.48 b 7.68 b 518.25 b 13.70 b 82.56 b 7.56 b 624.15 b 14.48 a L1N3 84.32 a 8.10 a 682.99 a 13.74 a 75.30 a 8.20 a 617.46 a 13.80 b 89.88 a 7.82 a 702.86 a 14.54 a L2N1 66.78 c 7.12 c 475.47 d 12.86 b 58.42 c 7.18 c 419.46 c 13.58 b 73.52 c 6.92 d 508.76 d 12.80 b L2N2 72.25 b 7.10 c 512.98 c 12.07 d 60.35 c 7.48 b 451.12 c 12.12 d 79.63 b 7.08 c 563.35 c 12.70 b L2N3 70.05 b 6.98 d 488.60 d 12.45 c 54.95 d 7.20 c 395.64 d 12.93 c 77.95 bc 6.88 d 535.91 cd 12.60 b 注：L1N1. 自然光条件下，施纯氮 65 kg/hm2；L1N2. 自然光条件下，施纯氮 130 kg/hm2；L1N3. 自然光条件下，施纯氮 260 kg/hm2；L2N1. 遮阴条件下，施纯氮 65 kg/hm2；L2N2. 遮阴条件下，施纯氮 130 kg/hm2；L2N3. 遮阴条件下，施纯氮260 kg/hm2。同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)；下同。
Note: L1N1. the applying nitrogen amount was 65 kg/hm2 under natural light condition; L1N2. the applying nitrogen amount was 130 kg/hm2 under natural light condition; L1N3. the applying nitrogen amount was 260 kg/hm2 under natural light condition; L2N1. the applying nitrogen amount was 65 kg/hm2 under shading condition; L1N2. the applying nitrogen amount was 130 kg/hm2 under shading condition; L1N3. the applying nitrogen amount was 260 kg/hm2 under shading condition. Data within the same column followed by no same letters indicate significant difference between treatments at P<0.05; the same as below.2.3 不同光照强度和氮素水平对玉米叶片叶绿素含量的影响
图2显示：自然光条件下，拔节期和灌浆期玉米功能叶片叶绿素a含量以N3处理最低，抽雄期和抽穗期不同施氮量间无显著差异；遮阴条件下，拔节期以N3处理最低，灌浆期以N3处理最高，抽雄期以N2处理最低。自然光条件下，拔节期叶绿素b含量随施氮量增加而逐渐降低，抽穗期和灌浆期则随施氮量增加而逐渐增加；遮阴条件下，抽雄期以N2处理最低，抽穗期以N1处理最低，灌浆期以N3处理最低。自然光条件下，拔节期和抽雄期总叶绿素含量以N3处理最低，抽穗期以N3处理最高；遮阴条件下，拔节期和灌浆期以N3处理最低，抽雄期以N2处理最低，抽穗期以N1处理最低。该结果说明：遮阴对生育前期玉米叶绿素含量影响较大，高氮处理自然光条件下生育前期含量较低，生育后期含量较高；遮阴条件下，抽穗之前也表现出相似规律。
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图 2 不同光照强度和氮素水平对玉米叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的影响Figure 2. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the contents of chlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll of maize leaves2.4 不同光照强度和氮素水平对玉米叶片光合特性的影响
表2显示：3个自然光处理的玉米净光合速率在不同生育期均高于遮阴处理，其中N3处理在拔节期和抽雄期最高，在抽穗期最低；遮阴条件下，不同生育期均以N1处理最高，N2和N3处理间无显著差异。自然光条件下，N3处理的气孔导度在拔节期和抽雄期最高，在抽穗期最低；遮阴条件下，拔节期和抽穗期以N1处理最高，抽穗期以N2处理最低。自然光条件下，拔节期和抽雄期的胞间CO2浓度以N2处理最高，抽穗期以N3处理最低；遮阴条件下，拔节期以N1处理最高，抽雄期以N2处理最高，抽穗期以N3处理最高。自然光条件下，拔节期和抽雄期的蒸腾速率均以N3处理最高，抽穗期以N2处理最高；遮阴条件下，拔节期以N2处理最低，抽雄期和抽穗期以N1处理最高。该结果说明：遮阴显著降低不同生育期玉米光合速率，从而影响光合作用的进行；自然光条件下，高氮处理生育前期光合速率较高；遮阴条件下，则以低氮处理光合速率较高。
表 2 不同光照强度和氮素水平对玉米光合特性的影响Table 2. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the photosynthetic characteristic of maize leaves生育期
growth period处理
treatment净光合速率/(µmol·m−2·s−1)
net photosynthetic rate气孔导度/(mol·m−2·s−1)
stomatal conductance胞间CO2浓度/(µmol·mol−1)
intercellular CO2 concentration蒸腾速率/(mmol·m−2·s−1)
transpiration rate拔节期
jointing stageL1N1 23.27 b 0.197 b 99.95 cd 2.773 b L1N2 22.07 b 0.203 b 112.69 b 2.945 b L1N3 26.17 a 0.229 a 95.17 d 3.839 a L2N1 21.13 b 0.196 b 127.14 a 2.212 c L2N2 14.69 c 0.127 d 104.58 c 1.984 d L2N3 16.03 c 0.143 c 109.39 bc 2.345 c 抽雄期
anthesis stageL1N1 21.63 b 0.157 b 83.71 c 2.771 c L1N2 20.73 b 0.165 b 97.00 b 3.006 b L1N3 27.14 a 0.220 a 89.29 c 3.883 a L2N1 19.37 b 0.145 b 65.17 d 3.682 a L2N2 11.23 c 0.091 c 118.80 a 1.764 d L2N3 12.45 c 0.081 c 96.64 b 1.604 d 抽穗期
heading stageL1N1 18.00 a 0.146 a 101.55 b 3.174 b L1N2 16.63 a 0.135 a 103.06 b 3.591 a L1N3 13.62 b 0.103 b 90.52 c 2.762 bc L2N1 13.66 b 0.112 b 107.96 b 2.980 b L2N2 9.02 c 0.067 c 92.19 c 1.751 d L2N3 10.43 c 0.096 b 130.72 a 2.519 c 2.5 不同光照强度和氮素水平对玉米叶和茎中可溶性糖含量的影响
可溶性糖不仅是植物体内重要的光合产物，也具有渗透调节及保护膜结构的功能[18]。图3显示：自然光条件下，拔节期和抽雄期的叶中可溶性糖含量，不同施氮量间无显著差异，但拔节期整体高于遮阴处理，抽穗期和灌浆期则均以N2处理最高；遮阴条件下，不同生育期均以N3处理最低，N1处理最高。自然光条件下，不同生育期茎中可溶性糖含量均以N1处理最高，N2和N3处理间无显著差异；遮阴条件下，抽雄期和灌浆期均以N2处理最高；抽穗期以N3处理最高，N1处理最低。该结果说明：遮阴显著降低生育前期玉米叶中可溶性糖含量，且随施氮量增加降幅逐渐增大；自然光条件下，低氮处理的茎中可溶性糖含量较高；遮阴条件下，则以中高氮处理较高。
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图 3 不同光照强度和氮素水平对玉米叶和茎中可溶性糖含量的影响Figure 3. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the soluble sugar content in leaves and stems of maize2.6 不同光照强度和氮素水平对玉米干物质累积及分布的影响
表3显示：自然光条件下，3个氮水平处理的玉米根和叶片干质量均无显著差异，但根干质量均高于遮阴处理，N2和N3处理的叶片干质量也显著高于遮阴处理；遮阴条件下，根干质量以N3处理最高，叶片干质量以N1处理最高。自然光条件下，N2处理的茎和叶鞘干质量显著高于N1和N3处理；遮阴条件下，则以N1处理最高。自然光处理的花秆、花和雄蕊干质量整体均高于遮阴处理，其中N2处理自然光条件下最高，遮阴条件下最低。自然光条件下，N2和N3处理的穗干质量显著高于N1处理；遮阴条件下，则以N1处理最高。自然光条件下，总生物量以N2处理最高，且显著高于遮阴时处理；遮阴条件下，则以N1处理最高，并高于自然光时处理。该结果说明：遮阴条件下低氮处理有助于玉米干物质累积，尤其是穗部；中高氮处理则表现为抑制玉米干物质累积。
表 3 不同光照强度和氮素水平对玉米干物质累积及分布的影响Table 3. Effects of different light intensities and nitrogen levels on the accumulation and distribution of dry matter of maizeg/plant 处理
treatment根
root茎
shoot叶片
leaf叶鞘
leaf sheath花秆
flowering stems花
flowering雄蕊
stamens穗
maize ear总生物量
total biomassL1N1 7.80 a 21.02 b 15.43 a 9.53 b 0.41 b 1.28 b 1.69 b 31.15 c 88.31 c L1N2 7.35 a 26.06 a 16.57 a 10.95 a 0.56 a 1.68 a 2.24 a 36.93 b 102.34 a L1N3 7.74 a 20.90 b 16.34 a 9.46 b 0.36 bc 1.23 b 1.59 b 37.02 b 94.64 b L2N1 6.13 c 19.50 b 16.14 a 9.91 ab 0.33 c 1.14 b 1.46 b 41.01 a 95.62 b L2N2 4.97 d 13.71 c 11.07 b 7.34 d 0.25 d 0.58 c 0.82 c 12.78 e 51.52 d L2N3 6.88 b 15.90 c 10.57 b 8.07 c 0.33 c 1.03 b 1.37 b 19.13 d 63.28 d 3. 讨论
光照是影响玉米光合作用及干物质生产的重要因子。本研究显示：遮阴对玉米地上部生长的抑制作用大于地下部，不同部位叶片大小均小于自然光处理，生育前期功能叶片叶绿素含量和叶中可溶性糖含量均有所降低，全生育期净光合速率也显著下降，说明遮阴抑制玉米光合作用的进行，进而影响玉米生长发育及干物质积累。前人研究显示[18-21]：弱光胁迫下玉米光合效率明显降低，茎叶等营养器官的生物量严重降低，且总生物量主要分布在营养器官中，影响光合产物向籽粒的转运，降低产量，本研究结果与其基本一致。杜成凤等[22]报道：玉米苗期遮阴后叶片单面面积叶绿体数目减少，基粒数、基粒厚度和片层数增加，这可能是导致光合色素降低和光合速率下降的原因。此外，玉米花粒期遮阴处理影响花后籽粒发育，使粒重降低，导致其干物质总量和产量均显著下降[23]。本试验中，中高氮水平条件下，遮阴处理玉米穗部干质量和总干质量均显著低于自然光处理，可能是上述原因所致。
氮对玉米植株的光合物质生产、物质分配以及碳氮代谢具有重要影响，且与光照存在显著的交互作用[24-26]。本研究显示：遮阴条件下，低氮处理的不同部位叶片大小、净光合速率及根长均高于高氮处理，从而导致叶中可溶性糖含量及总干质量也均较高，说明遮阴条件下低氮处理有利于玉米干质量累积，尤其是穗部；中高氮水平下玉米干质量积累量有所下降。关义新等[24]报道：弱光下植株在较低供氮水平下具有较高的物质生产能力和氮素同化能力，而强光下植株的最大光合物质生产能力和氮素同化能力则出现在较高的氮素水平。EVANS[25]报道：弱光条件下，供氮过多会使叶片C/N值过低、氮代谢旺盛以及光合产物的输出率降低，造成光合产物对光合器官的反馈抑制，从而不利于干物质的积累；我们的研究结果与其相符。关义新等[26]的研究还显示：在较高的供氮水平下，高光强下叶片的PSII效率较高，非光化学猝灭较低，吸收的光能较多的进入光化学过程；而低光强下则有较多的光能通过天线色素以热能形式散失，较多的光能即无法进入光化学过程也不能进入热耗散，而有可能以叶绿素单线激发态的形式存在，或通过产生活性氧等极为不利的方式散失。李海波等[27]研究发现：高肥处理叶片的各部位气孔频度均低于低肥处理，我们前期结果也表现出类似规律[17]，这可能是本试验中遮阴条件下低氮处理玉米干物质累积较高的原因。也有报道指出：增施氮肥可提高弱光胁迫下小麦叶片对光能的捕获能力，提高光能转化效率和PSII反应中心开放部分的比例，降低非辐射能量的热耗散，有利于小麦将捕获的光能更有效地用于光合作用，进而提高净光合速率[28]，这与本试验结果不一致，可能与氮肥施用范围不同有关。本研究结果表明：自然光条件下，玉米植株的适宜氮素水平较高，而弱光条件下玉米植株的适宜供氮水平较低，因此在生产过程中，应注意光与肥的关系，尽量协调使之达到平衡。
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图 1 料液比、提取温度、提取时间和提取次数对多糖提取率影响
Figure 1. Effect of different ratios of solid to liquid ratio, extraction temperature, extraction time and extraction times on the extraction yield of crude polysaccharides
表 1 因素水平表
Table 1 Factor level
水平level A B C D 料液比/(g∶mL) solid to liquid
ratio提取温度/℃extraction temperature 提取时间/h
extraction time提取次数
extraction times1 1∶10 70 3 2 2 1∶20 80 4 3 3 1∶30 90 5 4 
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表 2 正交试验设计与结果
Table 2 Orthogonal experimental design and results
编号No. A B C D 提取率/%
extraction rate料液比/
(g∶mL) solid to liquid ratio提取温度/℃
extraction temperature提取时间/h
extraction time提取次数
extraction times1 1∶10 70 3 2 1.47 2 1∶10 80 4 3 2.04 3 1∶10 90 5 4 2.50 4 1∶20 70 4 4 2.68 5 1∶20 80 5 2 1.22 6 1∶20 90 3 3 3.55 7 1∶30 70 5 3 2.80 8 1∶30 80 3 4 2.45 9 1∶30 90 4 2 2.46 K1 2.003 2.317 2.490 1.717 K2 2.483 1.903 2.393 2.797 K3 2.570 2.837 2.173 2.543 R 0.567 0.934 0.317 1.080
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