克氏原螯虾多巴脱羧酶的cDNA克隆、序列分析及表达分布
The cDNA Cloning, Sequence Analysis and Expression of Dopa Decarboxylase Gene in Procambarus clarkii
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Keywords:
- Procambarus clarkii /
- dopa decarboxylase /
- cDNA cloning /
- properties analysis /
- tissue expression
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自然界中，先天免疫系统广泛存在于较为低等的无脊椎动物和部分脊椎动物中，而获得性免疫系统一般认为只存在于脊椎动物中[1]。无脊椎动物的先天免疫系统主要包括物理屏障、体液免疫和细胞免疫3个部分[2]。多巴脱羧酶(dopa decarboxylase，DDC)作为无脊椎动物黑化作用中的关键酶，在体液免疫中起重要作用。DDC也被称为色氨酸脱羧酶(AAD)，对芳香族左旋氨基酸具有强烈的脱羧作用，它可通过催化L-3,4-二羟基苯丙氨酸(左旋多巴)和L-5-羟基色氨酸，分别合成具有重要生理活性的神经递质分子——多巴胺和5-羟色胺[3]。多巴脱羧酶一直被认为是昆虫外表皮层黑色素合成过程中的一种关键酶[4]，其作用过程为：昆虫体内的苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶催化作用下生成酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸羟化酶作用下生成L-多巴，之后被多巴脱羧酶催化生成多巴胺，生成的多巴胺会被转运到表皮的特殊前体微粒中，再被酚氧化酶催化生成黑色素[5]，从而参与昆虫表皮的揉化与硬化。
除了表皮硬化与黑色素的形成有关之外，无脊椎动物对病原微生物的防御反应也涉及到多巴脱羧酶的参与。如：多巴脱羧酶活性降低会使果蝇幼虫对寄生蜂的吞噬作用受到明显损害[6]。注射多巴脱羧酶抗体之后，栉孔扇贝血细胞对病原的包囊作用发生了明显的下降[7]。利用RNAi技术，将多巴脱羧酶的表达量敲低之后，冈比亚按蚊对于外源物质的黑化作用明显降低[8]。这些现象都说明多巴脱羧酶除了可以调控黑色素的产生之外，在受到病原微生物侵染的时候，它也可以直接发挥先天免疫活性。
近年来，克氏原螯虾(也称淡水小龙虾)作为一种极其重要的淡水水产养殖品种受到广泛关注。2017年，中国小龙虾养殖总产量约112.97万t，占淡水虾总产量的52%，虾总产量的32%，直接产值超过350亿元，但每年因疾病造成小龙虾养殖业的损失高达数十亿元，故有必要对克氏原螯虾的先天免疫系统进行进一步的研究。综合国内外文献发现：克氏原螯虾的多巴脱羧酶基因没有得到科研工作者的重视和研究，而DDC在先天免疫系统中发挥着重要作用。因此，本研究以克氏原螯虾多巴脱羧酶为对象，构建小龙虾ddc基因的大肠杆菌原核表达重组载体，分析其核酸和蛋白序列特征，检测其在6个重要组织中的表达差异，以期为克氏原螯虾先天免疫系统的探索奠定重要基础。
1. 材料与方法
1.1 试验动物
试验小龙虾从包头市友谊水产市场购买，在实验室无菌条件下采集虾的血细胞、肝胰腺、鳃、肠肌肉及淋巴组织，快速置于液氮中用于后续提取总RNA。
1.2 分子克隆
1.2.1 总RNA的提取
将实验室预养1周的小龙虾于冰上解剖，取小龙虾肝胰腺组织置于液氮中，利用TRizol总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取过程按照说明操作步骤进行。提取出的总RNA用DEPC处理的灭菌双蒸水稀释后置于−80 ℃冰箱保存备用。之后，取适量总RNA样品，利用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.2.2 cDNA的合成
按照cDNA第1链合成试剂盒(Thermo Scientific RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit)的使用说明书，以Oligo (dT)18作为后引物，通过逆转录反应将已经提取的总RNA反转录成cDNA，转录后的cDNA保存在−80 ℃冰箱中，作为PCR扩增模板用。
1.2.3 目的基因的PCR扩增与电泳检测
根据实验室前期转录组测序的结果，以及参照NCBI数据库中收录的各物种ddc基因序列，用引物设计软件Primer 5.0设计1对小龙虾ddc目的基因特异的上下游引物，Pc-ddc-F：5′-ATGGACGCCGATCAGTTC-3′ (位于目的基因序列起始密码子附近)，Pc-ddc-R：5′-TTACTCCTGCAGAATGAT-3′ (位于目的基因序列终止密码子附近)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA为模板，扩增目的基因序列。PCR程序如下：94 ℃，3 min循环1次；94 ℃，30 s；57 ℃，45 s；72 ℃，60 s，循环35次；后延伸72 ℃，10 min。PCR扩增结束后，取3 μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 重组载体的构建与序列测定
PCR扩增结束后，利用DNA纯化回收试剂盒纯化目的基因扩增片段；同时，用DNA小量提取试剂盒提取大肠杆菌pET-28a质粒载体；之后，将目的基因PCR扩增片段与质粒载体分别进行EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切、回收，并且重组连接；最后，将重组表达载体pET-28a-Pc-ddc转化大肠杆菌TL129感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性重组子，最后送到上海生工生物工程有限公司进行测序。
1.3 生物信息学分析
1.3.1 目的基因的序列分析
通过NCBI上的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)软件对测序所得的cDNA全长序列做开放阅读框分析；使用Expasy网站上的Translate软件(http://web.expasy.org/translate/)将所得的cDNA序列翻译为氨基酸序列。再利用生物学软件DNA MAN对选择出的物种相近、基因序列相似度较高的ddc基因进行氨基酸序列对比。
1.3.2 系统进化树的绘制
根据BLAST序列比对的结果，把物种较近、基因序列较相似的ddc基因的核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列；利用MEGA 7.0软件绘制系统进化树，分析进化关系。
1.3.3 理化性质分析
通过ExPASy网站上的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)软件对测序所得的ddc开放阅读框氨基酸序列做蛋白质的理化性质分析；通过ExPASy网站上的SignalP4.1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件预测蛋白质的信号肽；通过Softberry-ProtComp9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)软件做蛋白的亚细胞定位分析；通过ExPASy网站上的ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)软件做蛋白的亲疏水性分析；利用TMHMM (https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件做蛋白的跨膜结构预测分析；使用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白的磷酸化位点；通过GORIV (http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)软件做蛋白的二级结构预测；通过SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)软件做蛋白质的同源建模，预测三级结构。
1.4 多组织表达分析
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2. 结果与分析
2.1 目的基因的PCR扩增
由图1可知：在DNA标准分子量1 000~2 000 bp处有1条明亮的条带，与理论预测值1 425 bp相一致，扩增正确。
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图 1 目的基因Pc-ddc PCR电泳图注：M. DL2000 DNA Marker；1~4. 目的基因PCR产物；N. 阴性对照。Figure 1. PCR amplification of Pc-ddc geneNote: M. DL2000 DNA Marker; 1-4. target gene PCR products; N. negative control.2.2 菌落PCR筛选阳性重组子
如图2可知：在DNA标准分子量1 000~2 000 bp处有1条明亮的条带，与理论预测值1 425 bp相一致，说明筛选得到DDC的阳性重组克隆子。
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图 2 菌落PCR筛选阳性重组子的电泳图注：M. DL2000 DNA Marker；1~7. 菌落PCR产物；N. 阴性对照。Figure 2. PCR amplification of pET-28a-Pc-ddc recombinant vectorNote: M. DL2000 DNA Marker; 1-7. target gene PCR products; N. negative control.2.3 目的基因的序列分析
由图3可知：小龙虾ddc基因的cDNA开放阅读框(ORF)序列的全长为1 425 bp，编码474个氨基酸残基，多肽的理论分子量为52.99 ku。
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图 3 小龙虾ddc基因的cDNA序列以及翻译的氨基酸序列注：atg. 起始密码子；*. 终止密码子；上面一行字母和下面一行字母分别表示核酸序列和其对应的氨基酸序列；灰色区域为功能结构域区域。Figure 3. The nucleotide and predicted amino acid sequences of Pc-ddc geneNote：atg. start codon; *. stop codon; letters of upper line and letters of lower line are nucleotide sequences and amino acid sequences; the gray area is the domain of functional structure.2.4 氨基酸序列的同源性分析
由图4可知：小龙虾DDC分子与蜜蜂(Af-DDC)、家蝇(Md-DDC)、赤拟谷盗(Tc-DDC)、黄粉虫(Tm-DDC)和埃及伊蚊(Aa-DDC)多巴脱羧酶分子之间有较高的相似度，同源性达到81.2%。
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图 4 小龙虾ddc基因的氨基酸序列比对结果Figure 4. Multipe alignment and analysis of deduced amino acid sequence of Pc-ddc gene2.5 系统进化树的分析
系统进化树分析结果(图5)显示：小龙虾ddc基因(用黑色三角标出)与埃及伊蚊(Aa-DDC)、家蝇(Md-DDC)、黄粉虫(Tm-DDC)、赤拟谷盗(Tc-DDC)和黑腹果蝇(Dm-DDC)分布在进化树同一分支上，这表明它们之间的亲缘关系较近。其中，黑腹果蝇的ddc基因与小龙虾ddc亲缘性最高。
2.6 Pc-DDC的理化性质分析
通过ExPASy服务器分析显示：小龙虾DDC蛋白分子式为C2384H3689N647O674S25，含有474个氨基酸，其中亮氨酸含量最高(10.1%)，其次是丙氨酸(9.9%)，半胱氨酸含量最低(1.5%)。Pc-DDC蛋白等电点为5.98，为弱酸性蛋白。SignalP4.1软件分析显示：Pc-DDC蛋白的C值、Y值和S值均小于阈值0.5，说明N-末端无信号肽，为非分泌型蛋白(图6)。通过ProtComp 9.0软件预测Pc-DDC蛋白的亚细胞定位情况(表1)可知：小龙虾DDC蛋白在线粒体中最多。
表 1 小龙虾DDC的亚细胞定位Table 1. Subcellular localization prediction of Pc-DDC protein定位location weights LocDB PotLocDB Neural Nets Pentamers Integral 细胞核nuclear 0.0 0.0 0.00 0.00 0.00 细胞膜plasma membrane 0.0 0.0 0.92 0.14 0.00 细胞外extracellular 0.0 0.0 0.92 0.75 2.29 细胞质cytoplasmic 0.0 0.0 0.00 0.77 0.67 线粒体mitochondrial 0.0 0.0 0.00 2.86 1.33 内质网endoplasm. retic. 0.0 0.0 0.00 0.50 1.25 过氧化物酶体peroxisomal 0.0 0.0 0.92 0.00 2.08 溶酶体golgi 0.0 0.0 0.23 0.25 1.23 高尔基体chloroplast 0.0 0.0 0.00 0.34 1.16 液泡vacuolar 0.0 0.0 0.00 0.00 0.00 2.7 Pc-DDC的亲疏水性分析及跨膜结构预测
利用ProtScale程序绘制Pc-DDC蛋白质的亲疏水性序列谱，结果(图7)发现该多肽链第337位的谷氨酰胺具有最低分值−2.356，亲水性最强。第235位的脯氨酸具有最高分值2.678，疏水性最强，总平均亲水性为−0.061，脂肪系数为89.54，不稳定系数为41.18，负电荷残基数目为56，正电荷残基数目为46。利用TMHMM预测Pc-DDC蛋白跨膜结构，结果显示：Pc-DDC蛋白不是跨膜蛋白(图8)。
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图 7 小龙虾DDC的亲疏水性分析结果Figure 7. Predicted hydrophpbicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of Pc-DDC protein2.8 Pc-DDC的磷酸化位点预测及二、三级结构预测
由图9可知：DDC可能存在的蛋白激酶磷酸化位点有58个，其中丝氨酸31个，苏氨酸20个，酪氨酸7个。通过GOR-IV软件对Pc-DDC蛋白进行蛋白质的二级结构分析，结果显示：小龙虾DDC蛋白质二级结构包含无规卷曲41.98%，α-螺旋40.51%以及延伸链17.51% (图10)。同源建模结果显示：其符合无脊椎动物的DDC三级结构构象(图11)。
2.9 Pc-ddc基因多组织表达谱
由图12可知：Pc-ddc基因mRNA在淋巴组织中表达最高，其次是血细胞，在其他组织中表达较低。
3. 讨论
克氏原螯虾是中国重要的水产养殖虾类，因其肉质鲜美、营养丰富而深受广大人民群众的喜爱。近年来，各种各样的病原菌对小龙虾养殖业造成了巨大的经济损失。然而，目前对小龙虾先天免疫途径的研究依旧处于起步阶段。HUANG等[9]对白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)侵染小龙虾Toll信号途径做出了补充；ZHANG等[10]研究了WSSV侵染小龙虾后PI3K信号通路的变化；LAN等[11]探索了抑制素在WSSV侵染小龙虾后起到的免疫作用。此外，在抗细菌免疫方面，LIAO等[12]和LIU等[13]研究了溶菌酶在小龙虾抗细菌免疫中的具体作用；ZHANG等[14]在小龙虾中发现了一种双WAP结构域的蛋白。最新研究发现：小龙虾Peroxiredoxin 6基因能调节Toll信号通路，保护DNA免受氧化应激的损伤[15]；在遭受病原体入侵后，其主要运用体内原酚氧化酶对细菌感染进行免疫反应[16]。随着相关研究的发展，科研工作者在小龙虾中发现的免疫相关基因越来越多，如GTPase Rac1基因[17]和新ALF分子[18]，本研究指出的多巴脱羧酶基因也对此做出了重要补充。
本研究以小龙虾ddc基因作为研究对象，利用基因重组技术将大肠杆菌原核表达载体pET-28a和目的基因Pc-ddc进行了重组，获得了阳性克隆子，首次扩增得到小龙虾多巴脱羧酶基因的完整cDNA序列。利用生物信息学软件对小龙虾ddc基因进行了序列分析，并对Pc-DDC蛋白进行了二级结构预测和三级结构建模，组织表达分析显示Pc-ddc基因mRNA在小龙虾淋巴组织中表达最高。本研究数据为探索小龙虾先天免疫途径提供了重要的理论基础，也为无脊椎动物多巴脱羧酶的研究进展做出了重要补充。
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图 1 目的基因Pc-ddc PCR电泳图
注：M. DL2000 DNA Marker；1~4. 目的基因PCR产物；N. 阴性对照。
Figure 1. PCR amplification of Pc-ddc gene
Note: M. DL2000 DNA Marker; 1-4. target gene PCR products; N. negative control.
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图 2 菌落PCR筛选阳性重组子的电泳图
注：M. DL2000 DNA Marker；1~7. 菌落PCR产物；N. 阴性对照。
Figure 2. PCR amplification of pET-28a-Pc-ddc recombinant vector
Note: M. DL2000 DNA Marker; 1-7. target gene PCR products; N. negative control.
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图 3 小龙虾ddc基因的cDNA序列以及翻译的氨基酸序列
注：atg. 起始密码子；*. 终止密码子；上面一行字母和下面一行字母分别表示核酸序列和其对应的氨基酸序列；灰色区域为功能结构域区域。
Figure 3. The nucleotide and predicted amino acid sequences of Pc-ddc gene
Note：atg. start codon; *. stop codon; letters of upper line and letters of lower line are nucleotide sequences and amino acid sequences; the gray area is the domain of functional structure.
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图 4 小龙虾ddc基因的氨基酸序列比对结果
Figure 4. Multipe alignment and analysis of deduced amino acid sequence of Pc-ddc gene
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图 7 小龙虾DDC的亲疏水性分析结果
Figure 7. Predicted hydrophpbicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of Pc-DDC protein
表 1 小龙虾DDC的亚细胞定位
Table 1 Subcellular localization prediction of Pc-DDC protein
定位location weights LocDB PotLocDB Neural Nets Pentamers Integral 细胞核nuclear 0.0 0.0 0.00 0.00 0.00 细胞膜plasma membrane 0.0 0.0 0.92 0.14 0.00 细胞外extracellular 0.0 0.0 0.92 0.75 2.29 细胞质cytoplasmic 0.0 0.0 0.00 0.77 0.67 线粒体mitochondrial 0.0 0.0 0.00 2.86 1.33 内质网endoplasm. retic. 0.0 0.0 0.00 0.50 1.25 过氧化物酶体peroxisomal 0.0 0.0 0.92 0.00 2.08 溶酶体golgi 0.0 0.0 0.23 0.25 1.23 高尔基体chloroplast 0.0 0.0 0.00 0.34 1.16 液泡vacuolar 0.0 0.0 0.00 0.00 0.00 
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