元阳梯田水稻秸秆饲用特征对增强的UV-B辐射的响应
Response of Forage Characteristics of Rice Straw to UV-B Radiation in Yuanyang Terrace
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Keywords:
- rice straw /
- UV-B radiation /
- forage characteristics /
- nutritive value index
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甘蓝型油菜(Brassica napus L.，AACC，2n=38)是十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)重要的油料作物，是同属中二倍体物种白菜(AA，2n=20)和甘蓝(CC，2n=18)先通过天然的种间杂交，再经过双二倍化进化后产生的异源四倍体物种，目前已经对其中的8种生态型完成了基因组测序[1]。近年来，油菜的多功能利用潜力不断被开发[2]，除榨油、饲料和菜用外，不同花色的甘蓝型油菜也是具有特色的旅游资源[3]；此外，对其不同花色资源的基因功能和代谢组学研究[4-5]以及花色利用也备受关注，因此，研究甘蓝型油菜花色性状的遗传和分子机制具有一定的实践意义。白花性状是比较常见的花色突变类型，其来源比较丰富，产生机制也具有多样性和复杂性，但是其分子机制间的差异和相关性研究并不完善，具有一定的研究意义。
在十字花科植物中，对白花性状的遗传研究成果最为突出。油菜中白花性状的来源较丰富，包含自然突变、人工突变和远缘杂交等方式[6-7]。研究发现：不同来源的白花性状存在多种遗传模式，在某些甘蓝[8]、芥蓝[9]和甘蓝型油菜[10-11]中发现单基因显性遗传的模式，而在一类芥菜型油菜中发现白花性状属于2对隐性基因的遗传调控模式[12]；也有文献表明某些白菜的白花性状受双隐性基因调控[13]或单隐性基因调控[14]，某些甘蓝型油菜的白花性状也受到单隐性基因调控[15]。关于白花性状形成的分子机制也有一定的研究报道，尤其是定位克隆了一部分白花形成的关键基因。在甘蓝型油菜中发现了BnaC3.CCD4[10]、BnNCED4b[11]和PSD3[15]基因与白花性状相关；也有研究利用二代测序技术定位了与白花连锁的6个SSR共分离标记[16]；在芥蓝中定位克隆的ckpc基因[9]、甘蓝中定位的cpc-1基因[8]、芥菜型油菜中定位克隆的Bjpc1/2基因[12, 17]以及白菜中定位克隆的Brwf1、Brwf2[13]和BrWF3[14]等基因均与白花性状相关；此外，在萝卜中发现1个碱基的点突变导致红色花瓣变成白色[18]。
白花属于黄花的一种常见突变类型，研究黄花与白花的基因表达或代谢差异具有重要意义。黄花形成主要与类胡萝卜素代谢路径有关，类胡萝卜素是三大天然色素之一，是花瓣颜色形成的主要因素之一，其代谢路径主要包括合成转化、分解和储存，每个过程包含了复杂的基因合成路径和代谢调控网络[19]。类胡萝卜素合成路径主要的限速基因是八氢番茄红素合成酶基因(PSY)；在合成转化过程中，番茄红素δ-环化酶基因(LCYE)、番茄红素β-环化酶基因(LCYB)和玉米黄质环化酶基因(ZEP)等发挥了重要的作用；在分解代谢路径中，双加氧裂解酶基因(CCD1、CCD4、CCD7和CCD8)和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(NCEDs)发挥了关键作用[19-20]。在油菜中，QU等[21]利用转录组学分析得到18个类胡萝卜素合成的位点；此外，还有研究利用组学分析得到白花和黄花材料中与类胡萝卜素路径相关的多个差异表达基因[5, 11, 22]。目前在甘蓝型油菜中已经发现了多种白花类型，也对部分白花材料进行了组学分析，但是还没有比较和鉴定这些材料中白花基因的序列差异，本研究以此为切入点，分析白花材料中关键基因的序列和表达差异。
本研究以4个新型甘蓝型白花油菜品系为研究材料，以BnaC3.CCD4基因为研究对象，采用生物信息学的进化分析和基因PCR克隆测序等方法进行同源性和遗传变异分析，同时对类胡萝卜素合成转化、分解和代谢路径的一些关键基因进行相对表达量的分析，初步探究不同白花材料白花形成的机制和差异，为确定不同材料中白色花瓣形成的关键基因和关键时期提供参考。
1. 材料与方法
1.1 供试材料和主要试剂、仪器
供试的5个材料均为甘蓝型油菜品系，4个白花材料分别为M50 (人工合成甘蓝型油菜)、M55、M58和M61；对照黄花材料M158为中双11，所有材料于2021年10月种植于田间，待现蕾时取花瓣或小花蕾提取RNA，并进行表型观察。此外，为了确定不同材料中目标基因的变异形式，选取多种白花、黄花和桃红花材料用于分子标记检测，其中，黄花材料包括79、80、81、84、86、95、96-1、96-2、109、111、139、140、141、143、147、158、166、187、188和Westar，桃红花材料包括75和76-1，白花材料为137。所有材料来自华中农业大学油菜研究中心。
主要试剂：I-5™ 2×High-Fidelity Master Mix、荧光定量STBR qPCR Master Mix、大肠杆菌DH5α感受态以及其他生化试剂购自擎科生物科技有限公司；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。主要仪器：伯乐PCR仪、TGL-18高速冷冻离心机、Nano-200微量核酸蛋白分析仪、AFD4800实时荧光定量PCR仪、Tanon-2500凝胶成像系统等。
1.2 CCD4基因的进化分析
CCD4基因属于类胡萝卜素裂解途径中的1个基因，在芸薹属植物中具有较多的同源序列。在甘蓝型油菜泛基因组数据库(http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/)中选择人工合成黄籽材料No. 2127为参考基因组，并下载目标基因BnaC3.CCD4对应的蛋白质序列；在NCBI数据库的十字花科基因库中比对并下载与该基因同源的所有序列，选取相似度较高的39个蛋白质序列，采用MEGA 6.0软件进行进化树分析，再采用邻接法进行聚类分析，Bootstrap设置为1000。
1.3 目的基因扩增检测与测序比对
采用高保真酶在5个材料的基因组中设计特异扩增BnaC3.CCD4基因的引物。以N2127_CCD4-F (5′-AGCAGTGCAATGTACTCTGTTT-3′)和N2127_CCD4-R (3 ′-ATTAAACAGACCGTGATTAAACCT-5′)为上、下游引物，分别从白花和黄花材料的基因组DNA中扩增BnaC3.CCD4，后续将PCR产物纯化回收，再连接到Pclone007平末端载体上，经过转化、复苏、涂平板和阳性克隆检测等步骤后，将单克隆菌液送至擎科生物有限公司进行测序。测序完成后，利用ClustalX对5个材料的目的基因进行比对分析，利用DNAMAN对结果进行美化处理。引物N2127_CCD4-F和N2127_CCD4-R也是鉴定不同材料中BnaC3.CCD4基因的分子标记。
1.4 白花基因转座子TE1特异片段的分子标记设计
很多白花材料是由于BnaC3.CCD4基因序列发生突变产生的，尤其是转座子TE1和TE2的插入[10]。因此，本研究还设计了1对引物(TE1-F和TE1-R)检测BnaC3.CCD4基因序列中是否存在TE1转座子，从而判断黄花材料的BnaC3.CCD4基因突变是否与TE1的插入有关。PCR扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，引物序列为TE1-F：TTGATTCGCCGCGTTTAACAT，TE1-R：CCTGTTTGTGATCTCGACGTTGT。
1.5 RNA提取与荧光定量PCR
分别对5个材料3个不同时期(小花蕾、小花瓣和大花瓣时期)的花瓣或花蕾组织RNA进行提取和反转录。取反转录产物5 μL，加超纯水稀释80倍，分装到1.5 mL离心管中，并按照品系和花瓣或花蕾组织编号。利用AFD4800定量PCR仪进行扩增，扩增体系与程序参照2×Master qPCR Mix-SYBR (+UDG) (货号：TSE203)试剂盒说明书进行。
根据前人研究结果[5, 22]，本研究针对类胡萝卜素合成和裂解路径上的7个基因进行定量分析，其中PSY和LCYB是合成路径中的重要基因，CCD4、CCD7、NCED3和NCED5是裂解路径中的基因，ZEP是类胡萝卜素参与叶黄素循环过程的相关基因。除CCD4只分析BnaC3.CCD4基因的表达量外，其他基因分析了基因组中所有同源序列的表达量。表达量的分析以 β-actin7 作为内参基因。采用2−ΔΔCt法进行相对表达量的计算。
1.6 数据处理与作图
数据采用Excel和IBM SPSS软件进行分析；采用GraphPad Prism 5和Photoshop软件作图。
2. 结果与分析
2.1 白花材料的花瓣表型
由图1可知：黄花对照材料(M158)在花瓣发育早期就积累了丰富的类胡萝卜素，花瓣完全展开时呈深黄色；M50、M55和M58的表现基本相似，花瓣在发育早期有一定的类胡萝卜素积累而呈浅黄色，但在发育后期浅黄色消失，花瓣变为白色；M61的花瓣也表现类似的现象，但最终盛开的花瓣上还表现出浅黄色。说明4种白花材料早期的类胡萝卜素合成路径基本正常，但在花瓣发育过程中类胡萝卜素的积累出现了差异。
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图 1 白花材料与黄花材料的花瓣表型(标尺=1 cm)注：M50、M55、M58和M61为白花材料，M158为黄花材料；下同。Figure 1. Phenotypes of petals of the white flower varieties and the yellow flower variety (scale bar=1 cm)Note: M50, M55, M58 and M61 are white flower varieties, M158 is yellow flower variety; the same as below.2.2 芸薹属植物的CCD4基因进化
白菜、拟南芥、芥菜和萝卜中均存在CCD4基因的同源蛋白序列，该基因在生化过程中具有一定的基础功能，在进化上具有一定的保守型。在近缘物种中，甘蓝中的XP013626299序列与BnaC3.CCD4基因的亲缘关系最近。分析同源性较高的39条蛋白序列(图2)可知：甘蓝型油菜和拟南芥(Arabidopsis thaliana)有6条高度同源的蛋白序列，具备CCD4功能的序列有16条，其中，甘蓝型油菜4条，白菜(B. rapa)、甘蓝(B. oleracea)和萝卜(Raphanus sativus)各2条，亚麻荠(Camelina sativa) 3条，荠菜(Capsella rubella)、盐芥(Eutrema salsugineum)和琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)各1条。结果显示：在这39条序列中，甘蓝中的1个CCD4 (XP013626299)蛋白序列与目标蛋白的序列基本一致。
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图 2 芸薹属CCD4基因的进化树注：*. 具有CCD4预测功能的同源序列。Figure 2. Evolutionary tree of CCD4 in BrassicaceaeNote: *. The homologous sequences with CCD4 prediction function.2.3 白花材料中CCD4基因的克隆与比对
BnaC3.CCD4基因扩增结果(图3)显示：4个白花材料均能扩增出专一的目标条带，而黄花对照材料M158不能扩增出目标片段。由图4可知：4个白花材料的序列完全一致，且与人工合成白花材料No. 2127的CCD4基因序列完全一致，说明白花的形成与功能性CCD4基因的存在一定关联。值得注意的是，C03染色体上的CCD4 (BnaC3.CCD4)序列与A08上的BnaA8.CCD4序列虽然具有一定的同源性，但是在最终的蛋白质氨基酸序列上有一定的差异，说明甘蓝型油菜A08染色体上的CCD4同源拷贝不具有明显的生物学功能，而C03上的同源拷贝才可发挥生物学功能。
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图 3 白花材料与黄花材料BnaC3.CCD4基因的扩增结果注/Note: M. Marker; 下同/the same as below.Figure 3. PCR amplification result of BnaC3.CCD4 in white and yellow flower varieties![]()
图 4 白花材料BnaC3.CCD4的核苷酸序列注：No. 2127和A08.Ref均为参考基因组。Figure 4. Nucleotide sequence alignments of BnaC3.CCD4 in white flower varietiesNote: No. 2127 and A08.Ref are reference genome.2.4 BnaC3.CCD4的基因鉴定以及TE1转座子检测
BnaC3.CCD4序列的特异引物检测结果(图5a)显示：白花材料M50、M58、M61和M137，桃红花材料75和76-1以及黄花材料187均能扩增出目标条带。由图5b可知：除黄花材料187外，其他黄花材料中均检测到TE1序列，而在白花和桃红花材料中没有检测到该特异序列。进一步对黄花材料187和桃红花材料76-1的目的基因(BnaC3.CCD4)测序比对发现：76-1中的目的基因与M50等白花材料一致，而187的该基因虽然没有TE1插入，但是在编码区存在几个碱基的转变而导致发生突变。以上结果说明桃红花材料中目的基因BnaC3.CCD4发挥了生物学功能，黄花材料187的BnaC3.CCD4基因发生了碱基突变，而其他黄花材料中该目标基因由于转座子TE1的插入发生了突变。
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图 5 不同材料中BnaC3.CCD4 (a)和转座子TE1 (b)的检测结果注：79、80、81、84、86、95、96-1、96-2、109、111、139、140、141、143、147、158、166、187、188和Westar为黄花材料；75和76-1为桃红花材料；137为白花材料。Figure 5. Detection results of BnaC3.CCD4 (a) and TE1 transposon (b) in different materialsNote: 79, 80, 81, 84, 86, 95, 96-1, 96-2, 109, 111, 139, 140, 141, 143, 147, 158, 166, 187, 188 and Westar are yellow flower varieties; 75 and 76-1 are peach red flower varieties; 137 is white flower variety.2.5 类胡萝卜素代谢路径中部分基因的表达
由图6可知：在小花蕾期，黄花材料M158的类胡萝卜素合成基因PSY的表达量较低；到小花瓣期，已经明显观察到黄色形成(图1)，PSY基因表达量显著增高，其他降解和代谢路径继续保持较低水平；到大花瓣期，PSY基因表达量显著下降，代谢路径的ZEP基因表达量显著增高，降低了类胡萝卜素含量的积累速度，但花瓣依然保持黄色。说明油菜黄花的形成主要是类胡萝卜素的积累，即类胡萝卜素的生物合成大于其降解和代谢。
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图 6 不同材料3个时期相关基因的表达注：a. 小花蕾期，b. 小花瓣期，c. 大花瓣期；“*”表示在0.05水平上差异显著。Figure 6. Expression of relative genes at three periods in different materialsNote: a. little buds period, b. little petals period, c. blooming petals period; “*” indicates significant differences at 0.05 level.不同时期白花材料不同基因的表达量也有所差异(图6)。对M50而言，花瓣发育早期7个基因的表达量非常低；小花瓣期，PSY基因的表达量显著高于其他基因，但此时ZEP基因和CCD4基因也具有较高的表达量；大花瓣期，合成路径的PSY基因表达量相对于小花瓣期显著降低，但依然高于其他基因的表达量，ZEP和CCD4基因仍有微弱的表达，说明M50小花瓣期因类胡萝卜素部分降解故花瓣表现为浅黄色，而大花瓣期类胡萝卜素合成显著减少、降解增多而表现为白色。对M55而言，花瓣发育早期基因表达量极低；小花瓣期PSY、LCYB和ZEP基因有所表达，但PSY表达量处于绝对优势；大花瓣期，PSY表达量显著下降，ZEP基因仍然具有较高水平的表达，说明M55的小花瓣期存在其他基因参与了类胡萝卜素的降解和代谢使得花瓣表现为浅白色，到大花瓣期合成基因表达量极显著减少而表现为白色。对M58而言，花瓣发育早期PSY基因有微弱表达；小花瓣期PSY、CCD4和ZEP基因具有较高的表达量，且PSY表达量显著高于其他基因；大花瓣期，PSY表达量虽然下降显著，但仍然显著高于其他基因，ZEP的表达量也显著高于其他基因，表明其白花的形成可能是由于CCD4裂解基因和ZEP基因的高表达，导致类胡萝卜素不能大量积累。对M61而言，花瓣发育早期7个基因表达量均很低，小花瓣期，PSY基因表达量较其他基因显著升高，LCYB、CCD4和ZEP基因也有所表达；大花瓣期，PSY、LCYB和ZEP基因的表达量较小花瓣期显著提高，但PSY和ZEP基因的表达量仍显著高于LCYB等基因，表明M61小花瓣期类胡萝卜素合成大于降解从而表现为浅黄色，到大花瓣期类胡萝卜素含量维持在较低水平，推测还存在其他降解或代谢路径的基因发挥作用，导致其花瓣表现为浅白色。
3. 讨论
CCD4基因序列在十字花科近缘物种中具有较高的同源性。有研究以拟南芥AtCCD基因的编码区序列为依据，在甘蓝型油菜中找到30个CCD的位点，其中14个位于A亚基因组，16个位于C亚基因组；这些同源序列可分化为9大亚群，而且具有不同的组织或器官表达特异性[23]。此外，甘蓝型油菜中有4条CCD4基因的同源序列，分别是BnaA1.CCD4、BnaC1.CCD4、BnaA8.CCD4和BnaC3.CCD4，其中C03染色体上的CCD4基因主要在花瓣中表达，其他染色体上的CCD4基因优先在光合作用的组织和器官中表达[10]。本研究表明：白菜、甘蓝和萝卜中具有与BnaC3.CCD4基因同源的多条序列，甘蓝中的同源序列与之亲缘关系最近，而在甘蓝型油菜的基因组中也具有4条同源序列。虽然存在一定的功能冗余，但BnaC3.CCD4基因主要在花瓣中表达，是与花色相关的主要基因，能够以胡萝卜素为底物裂解产生α-紫罗酮和脱辅基类胡萝卜素，从而改变花色[11, 22]。值得注意的是，本研究中2个桃红花材料的基因组中也存在BnaC3.CCD4基因，推测桃红花材料的该基因位点处于杂合状态，且在育种过程中利用了含该基因的白花材料作为上一代亲本，以便于色素的积累与观察。
有研究发现：在甘蓝、埃塞俄比亚芥菜和甘蓝型油菜中均发现不同的单倍型C3.CCD4基因具有不同的突变类型[10]。甘蓝中具有4种突变类型，包括转座子插入、碱基插入和序列缺失等，最终导致黄花，而很多甘蓝型油菜黄花材料的产生是由于CCD4基因存在TE1转座子的插入[10]。本研究显示：黄花材料187也能扩增出与野生型长度相似的CCD4片段，说明该黄花材料中CCD4基因的突变并不是由于TE1转座子的插入，因此，本研究发现了1种新的CCD4单倍型类型，最终使其没有降解类胡萝卜素的功能。
类胡萝卜素分解代谢路径增强是本研究中白花材料形成的主要因素。已有研究表明：PSY、LCYB和ZEP等基因在胡萝卜素及其叶黄素等衍生物的合成路径中发挥着重要作用，NCED基因主要在类胡萝卜素代谢产生脱落酸中发挥重要作用，而CCDs基因主要在其降解上发挥重要作用[19-20]。不同时期油菜花瓣的类胡萝卜素含量不同，在即将开花前或花蕾早期达到顶峰[22]，这与本研究结果基本一致。小花瓣期，M50、M55、M58和M158材料的PSY基因相对表达量达到最大，说明此时类胡萝卜素的合成大于分解，处于积累阶段；大花瓣期，M61材料的PSY和LCYB基因高表达说明仍然存在一定量的类胡萝卜素积累，但花瓣整体上仍呈浅白色，需要进一步研究M61材料中究竟还存在哪些降解路径基因的高效表达。总之，白色花瓣的形成与类胡萝卜素的分解、转化等代谢路径密切相关，并非合成路径发生明显改变，这与前人研究认为PSY基因的表达差异影响花色[5]不一致，可能是因为白花材料类型比较丰富，产生的途径和机制存在一定差异。此外，白花材料在代谢物和转录水平上的差异也是下一步研究的方向。
4. 结论
BnaC3.CCD4蛋白在十字花科中具有较多的同源序列，与甘蓝中的1个蛋白质序列亲缘关系最近。供试4种白花材料的BnaC3.CCD4基因序列完全一致，均不存在TE1转座子插入，白色花瓣的形成与类胡萝卜素降解路径和代谢路径上的基因表达量密切相关，其中BnaC3.CCD4和ZEP基因发挥了一定的作用。
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图 1 UV-B辐射与秸秆形态特征之间的相关性
Figure 1. Correlation between UV-B radiation and growth morphological parameters
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图 2 UV-B辐射处理下水稻秸秆的饲用特征指标聚类分析
Figure 2. Cluster analysis for forage characteristics of rice straw under different UV-B radiation treatments
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图 3 UV-B辐射处理下水稻秸秆的饲用特征指标主成分分析
Figure 3. Principal component analysis for forage characteristics of rice straw under different UV-B radiation treatments
表 1 UV-B辐射对水稻秸秆生长形态及响应指数的影响(mean±SD)
Table 1 Effect of UV-B radiation on the growth morphological parameters and response index of rice straw
指标index UV-B辐射强度/(kJ·m−2) UV-B radiation intensity 0 2.5 5.0 7.5 秸秆长度/cm straw length 93.10±10.84 c 111.20±8.90 b 127.59±15.80 a 114.00±10.55 b 茎粗/cm stem diameter 0.48±0.07 c 0.61±0.05 b 0.58±0.05 b 0.77±0.04 a 单株生物量/g
plant biomass27.60±1.39 a 25.53±4.19 a 22.97±2.66 ab 20.65±1.09 b 形态响应指数/%
morphological response index— 37.7 41.5 58.1 注：同行中字母不同者表示差异显著(P<0.05)；下同。
Note: Different letters mean significant difference among different treatments (P < 0.05); the same as below.
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表 2 UV-B辐射对水稻秸秆饲用成分指标及响应指数的影响
Table 2 Effect of UV-B radiation on forage component indicators and response index of rice straw
指标 UV-B辐射强度/(kJ·m−2) UV-B radiation intensity 0 2.5 5.0 7.5 淀粉含量/% starch content 1.53±0.18 b 1.32±0.34 b 8.07±0.41 a 1.85±0.63 b 可溶性糖含量/% soluble sugar content 0.13±0.01 b 0.70±0.03 a 0.11±0.05 b 0.09±0.02 b 粗蛋白含量/% crude protein content 4.05±0.68 a 4.23±2.10 a 4.46±0.88 a 4.42±0.53 a 非蛋白氮含量/% non-protein nitrogen content 0.49±0.05 ab 0.48±0.05 ab 0.52±0.10 a 0.39±0.03 b 粗纤维含量/% crude fiber content 24.35±3.93 a 19.97±1.48 a 20.05±3.69 a 28.27±8.40 a 中性洗涤纤维含量/% neutral detergent fiber content 63.21±5.43 a 62.30±2.59 a 64.41±3.99 a 67.26±0.63 a 酸性洗涤纤维含量/% acid detergent fiber content 45.87±1.47 a 42.16±2.11 b 44.54±2.16 ab 47.14±0.69 a 粗脂肪含量/% crude fat content 1.72±0.35 a 2.03±0.37 a 2.04±0.23 a 1.87±0.48 a 粗灰分含量/% crude ash content 23.36±1.79 a 20.72±0.85 a 24.05±1.73 a 21.59±2.62 a 饲用成分响应指数/% feed component response index 406.9 433.3 21.7
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表 3 不同UV-B辐射处理下水稻秸秆营养价值指数
Table 3 Nutrient value index of rice straw under different UV-B radiation treatments
UV-B辐射强度/(kJ·m−2)
UV-B radiation intensityTDN/(g· kg−1) NE1 /(MJ·kg−1) DMI/(g· kg−1) DDM /(g· kg−1) RFV/% 0 42.12±1.90 b 4.60±0.16 b 1.91±0.17 a 53.16±1.15 b 78.57±6.12 ab 2.5 46.92±2.74 a 5.01±0.23 a 1.93±0.08 a 56.05±1.65 a 83.85±5.64 a 5.0 43.85±2.79 ab 4.75±0.24 ab 1.87±0.11 a 54.20±1.68 ab 78.56±6.90 ab 7.5 40.50±0.89 b 4.46±0.08 b 1.78±0.02 a 52.18±0.54 b 72.17±1.03 b 注：TDN为可吸收营养物质总量；NE1为净能；DMI为干物质的随意采食量；DDM为可消化的干物质；RFV为粗饲料相对值。
Note: TDN is total digestible nutrient; NE1 is net energy; DMI is dry matter intake; DDM is digestible dry matter; RFV is relative feed value.
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1. 王琦，杨文涛，郭二丹. 甘蓝型油菜花色调控机制研究进展. 现代农业科技. 2025(03): 37-41 . 
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