优质杂交粳稻滇禾优34香味产生的分子基础
The Molecular Basis of Rice Fragrance in the High Quality Japonica Hybrid Rice Variety Dianheyou34
-
Keywords:
- japonica hybrid rice /
- fragrance /
- fragrance related gene /
- gene clone /
- genetic analysis
-
香味是水稻重要的食味品质性状，具有独特香味特性的稻米倍受广大消费者的喜爱和育种工作者的重视[1]。来自印度和巴基斯坦的巴斯马蒂香米和来自泰国的茉莉香米尤其得到人们的认可，而且香米在市场上的价格也都高于非香稻米，因此，选育具有香味的水稻品种已成为现代水稻育种的重要内容之一。明确水稻香味的遗传基础有利于香稻新品种的选育[2]。
对水稻香味遗传规律的研究发现：水稻香味受细胞核基因控制，与细胞质遗传无关[3-4]。水稻的无香味表现为胚乳直感现象[5]，香稻叶片的香味受孢子体(2n)基因型决定[6-7]。F2代香味与无香味的分离比例有1∶3、1∶15、9∶7和207∶49等多种研究结果，从而认为控制香味性状的基因数目有l~4对，其中有单隐性基因、双隐性基因、基因互作和3个显性互补基因的报道，但多数研究结果倾向于1对单隐性基因支配[8-11]。有研究认为：杂交稻米的香味特性为自然参合型，如双亲之一为香稻，且香味基因是等位的，则F2代叶片有香味，杂交稻米为全香型[12-13]。
分子研究发现：水稻香味与香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)在水稻中的浓度密切相关[14]，而2AP在稻米中的积累与水稻中的甜菜醛脱氢酶密切相关，若水稻中编码甜菜醛脱氢酶的OsBADH2基因突变产生无功能的蛋白，则会导致水稻中2AP含量增加，使水稻的叶片和籽粒产生香味[15-16]。到目前为止，已在水稻中发现众多OsBADH2基因的等位突变，如已在OsBADH2基因的启动子区和第1、2、4、5、7、8、10、13和14外显子上发现多种因突变而产生的等位突变基因[17-19]，这些突变均可导致甜菜醛脱氢酶失去功能而使稻米产生香味。在这些突变类型中，分布最为广泛的是在该基因第7外显子上由于8个碱基的缺失和3个碱基的改变而产生的等位突变基因Osbadh-E7[20]。
滇禾优34是云南农业大学选育出的第1个具有香味的杂交粳稻新品种，是目前云南省种植面积最广的优质杂交粳稻品种[21]。其母本是滇Ⅰ型不育系H479A，父本是优质抗病恢复系南34。利用滇禾优34具有香味的特点，通过比较其亲本的甜菜醛脱氢酶基因OsBADH2序列，并鉴定其籽粒基因型叶片香味表型，研究其香味产生的分子机理，探索杂交粳稻中香味遗传的基础，从而为选育更多优质香型杂交粳稻品种奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
滇Ⅰ型不育系H479A和恢复系南34，以及由它们组配的杂交粳稻滇禾优34的F1植株自交获得的具有88个单株的F2群体。
1.2 方法
1.2.1 不育系和恢复系中OsBADH2基因的克隆
(1)在H479A和南34幼苗生长至四叶期时，剪取其幼嫩叶片，迅速放入液氮速冻，然后放入−80 ℃冰箱保存备用。
(2) RNA的提取与纯化：总RNA的提取采用天根TRNzolUniversal试剂，用Omega总RNA纯化试剂盒进行RNA纯化，然后用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量，−80 ℃保存备用。
(3) cDNA的制备：利用TaKaRa 的 PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录cDNA。按如下体积配制RNA/引物混合液10 μL：Oligo dT Primer 1 μL，10 mmol /L dNTP Mixture 1 μL，总RNA 3 μL，RNase Free dH2O 5 μL。将混合液置于水浴锅65 ℃ 5 min后，立即冰上冷却。在上述变性后的反应液中依次加入5×PrimeScriptII Buffer 4 μL、5×PrimeScriptII RTase 1 μL、RNase inhibitor 0.5 μL和RNase Free dH2O 4.5 μL，然后置于PCR仪45 ℃ 50 min，再95 ℃ 5 min后冰上冷却，−20 ℃保存备用。
(4) OsBADH2基因扩增与测序：根据日本晴中OsBADH2基因序列，设计1对引物BADHF1：5′-CATCGTCATCGATCCATCTCCGTATCTC-3′与BADHR1：5′- GCGTGTCATGCGTATGCGCATATTAC-3′。以水稻不育系H479A和恢复系南34的cDNA为模板，用TSINGKE金牌MIX(green)进行目的基因扩增，50 μL PCR反应体系包括：模板 cDNA 1 μL，引物各2 μL，Mix 45 μL。扩增反应条件为：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 变性10 s、62 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s，32个循环；最后72 ℃延伸1 min。将PCR扩增产物在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，利用GenStar快速DNA胶回收试剂盒对目的片段进行回收，回收产物连接到pMD18-T载体，连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，选择性单克隆，菌落PCR鉴定后测序。
1.2.2 香味表型的鉴定
采用氢氧化钾法浸泡法，以具有香味的H479A以及非香的南34为对照，对杂交稻滇禾优34的F2代群体各单株的叶片进行香味鉴定。在有盖的玻璃试管中，用10 mL 1.7% KOH溶液浸泡约2 g叶片样品，在25~30 ℃环境中静置10 min，然后嗅其气味[22]。由于嗅觉敏感度不一致，鉴评时鉴评小组由4人组成，4人同时鉴定为有香味的单株计为“香”，并对有异议的样品重新取样鉴定。
1.2.3 基因型鉴定
以具有88个单株的滇禾优34 的F2代群体DNA作为模板，利用可检测OsBADH2基因第7外显子8个碱基缺失突变类型的特异引物进行PCR的扩增[23]。扩增反应体系20 μL：模板DNA 2 μL，2 μmol/L引物各1 μL，Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。扩增结果在TAE缓冲液中利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2. 结果与分析
2.1 南34与H479A中OsBADH2基因序列分析
由图1可知：恢复系南34的OsBADH2序列长1 628 bp，开放阅读框长1 512 bp，与日本晴(非香稻)的序列完全一致，编码具有503个氨基酸的甜菜醛脱氢酶蛋白；而不育系H479A中是1个典型的在第7外显子产生突变的等位基因Osbadh-E7，即在其开放阅读框的731~743 bp处，有1个8 bp碱基缺失和3个SNPs差异，从而在H479A中产生1个无功能的甜菜醛脱氢酶，导致其产生香味。
![]()
图 1 南34与H479A中OsBADH2基因第7外显子序列分析Figure 1. Analysis of the sequence for OsBADH2 gene of 7 exon in Nan 34 and H479A2.2 滇禾优34 F2代群体香味的遗传分析
This page contains the following errors:
error on line 1 at column 1: Start tag expected, '<' not foundBelow is a rendering of the page up to the first error.
2.3 滇禾优34 F2代群体基因型鉴定
This page contains the following errors:
error on line 1 at column 1: Start tag expected, '<' not foundBelow is a rendering of the page up to the first error.
![]()
图 2 滇禾优34 F2代群体单株基因型分析注：M. Marker；H. H479A；N. 南34；1~88. F2群体的88个单株。Figure 2. Analysis of genotypes of F2 progenies individuals in Dianheyou34Note: M. Marker; H. H479A; N. Nan 34; 1-88. 88 individuals of F2 progenies.2.4 滇禾优34 F2代群体植株表型与基因型对比分析
由于bb基因型植株仅有17株，但表型分析发现有香味的植株多达28株，说明并非所有BB和Bb基因型的植株都是无香味的。通过进一步对F2代群体的88个单株的表型与基因型进行一一比对发现：有2株BB基因型植株和12株Bb基因型植株(占全部Bb基因型植株的23.1%)具有香味。同样，也有3株bb基因型植株的表型被鉴定是无香味的(表1)。
表 1 F2群体植株表型与基因型比较统计Table 1. Comparison of phenotypes and genotypes between F2 progenies individuals项目item 香味株数
number of fragrance plants无香味株数
number of non-fragrance plants基因型
genotypesBB Bb bb BB Bb bb 植株数
plant numbers2 12 14 17 40 3 3. 讨论
由于在产量和抗性等性状上的优势，杂交水稻获得了广泛的应用。在生产中，杂交水稻利用的是2个亲本杂交产生的F1代植株。要分析杂交水稻香味的分子遗传基础，就有必要搞清2个亲本香味的相关基因情况。因此，我们首先从杂交粳稻滇禾优34的2个亲本不育系H479A和恢复系南34中分别克隆了与稻米香味相关的甜菜碱脱氢酶基因OsBADH2。本试验结果与现有研究均认为OsBADH2基因功能缺失是稻米产生香味的原因，即不育系H479A基因组中甜菜碱脱氢酶基因的突变是其产生香味的主要遗传基础[24-26]。
虽然香稻的很多组织均可产生香味，但对于水稻香味的商品价值而言，籽粒(米粒)中的香味是最主要的。因此，研究籽粒中香味产生的机制是水稻香味研究的最主要课题。对于杂交水稻而言，其收获的具有商品价值的产品已是F2代籽粒，从遗传上看，其每颗籽粒的基因型均不相同，是一个包含各种不同基因型稻谷籽粒的混合体。另外，由于表型鉴定方法的限制，对单颗籽粒香味进行准确的鉴定存在较大困难。因此，本研究利用与每一颗籽粒胚基因型相同的由其萌发长成的植株进行基因型鉴定，同时用该植株叶片进行香味表型的鉴定，研究香味遗传规律以及香味与植株中OsBADH2基因型的关系，阐明杂交粳稻中香味产生的机制。
本研究表明：滇禾优34的香味受1对基因控制，且该基因就是Osbadh2-E7。由于杂交粳稻收获的籽粒已是F2代，理论上仅有1/4的具有纯合bb基因型籽粒才具有香味。但本试验发现表型与基因型并不完全吻合，对于这一现象可从两方面进行分析。首先，由于香味鉴定有一定的主观性，不能排除存在鉴定误差的可能[27-28]，因此，少数BB和bb基因型植株检测到相反的表型可以认为是由于鉴定误差所致。其次，对于多达12株的Bb基因型植株具有香味这一现象，鉴定误差显然是无法解释的。在滇禾优34种植稻田中，很多时期也会产生香味，而这些植株均是Bb基因型的F1代植株。因此对于滇禾优34而言，部分Bb基因型植株可产生香味是可以肯定的。虽然现有的关于稻米香味研究结果认为功能缺失的OsBADH2基因是水稻产生香味的最为关键的因素，但不能排除有其他基因参与调控稻米香味的可能。很多关于香味遗传研究的结果表明香味性状可能由多个基因控制[29]，香味基因的定位研究显示：至少有7条染色体上定位到与香味相关的位点[30-31]。因此对于部分Bb基因型植株产生香味的原因有可能是其他基因参与调控的结果，同时也有可能存在其他生化调控的可能。而对于籽粒来说这个问题就更加复杂，因为籽粒的主要成分胚乳是一个三倍体组织(3n)，因此会产生BBb和Bbb 2种类型的杂合基因型籽粒，而这2种类型的籽粒在香味产生上是否存在差别，还有待于更深入的研究。
本研究对杂交粳稻香味产生机理的初步探索为杂合基因型(Bb)籽粒香味产生的分子遗传机制奠定了基础；同时也为选育香味杂交稻新品种提供了理论基础，即仅需选育具有香味的不育系或恢复系就有可能组配成香型杂交粳稻品种，这可有效地减轻香型杂交粳稻选育的工作量，提高育种效率。
-
![]()
图 1 南34与H479A中OsBADH2基因第7外显子序列分析
Figure 1. Analysis of the sequence for OsBADH2 gene of 7 exon in Nan 34 and H479A
![]()
图 2 滇禾优34 F2代群体单株基因型分析
注：M. Marker；H. H479A；N. 南34；1~88. F2群体的88个单株。
Figure 2. Analysis of genotypes of F2 progenies individuals in Dianheyou34
Note: M. Marker; H. H479A; N. Nan 34; 1-88. 88 individuals of F2 progenies.
表 1 F2群体植株表型与基因型比较统计
Table 1 Comparison of phenotypes and genotypes between F2 progenies individuals
项目item 香味株数
number of fragrance plants无香味株数
number of non-fragrance plants基因型
genotypesBB Bb bb BB Bb bb 植株数
plant numbers2 12 14 17 40 3 
下载: 导出CSV
-
[1] 郭震华, 张淑华, 刘传雪, 等. 水稻稻米香味基因的遗传研究及其在育种中应用的研究进展[J]. 黑龙江农业科学, 2013(3): 144. [2] 傅军如, 高珍珠, 朱昌兰, 等. 水稻优质恢复系昌恢121香味基因的初步定位[C]// 中国作物学会. 中国作物学会50周年庆祝会暨2011年学术年会论文集, 2011. [3] 李金华, 王丰, 柳武革,等. 水稻粤丰B的香味遗传分析与SSR标记定位[J]. 分子植物育种, 2006, 4(1): 56. [4] 张江丽, 李娟, 张春龙, 等. 云南优质软米品种‘滇屯502’香味性状的遗传分析[J]. 分子植物育种, 2018(16): 5397. DOI: 10.13271/j.mpb.016.005397. [5] 马利奋. 水稻香味性状的遗传分析及基因定位研究[D]. 银川: 宁夏大学, 2012. [6] 孙淑霞, 高方远, 陆贤军, 等. 水稻香味及其分子生物学研究进展[J]. 西南农业学报, 2005, 18(增): 81. [7] 黄英金, 刘宜柏, 饶治祥, 等. 香稻品种香味性状的遗传研究[J]. 江西农业学报, 1995, 7(2): 88. DOI: 10.19386/j.cnki.jxnyxb.1995.02.003. [8] SHAO G N, TANG A, TANG S Q, et al. A new deletion mutation of fragrant gene and the development of three molecular markers for fragrance in rice[J]. Plant Breeding, 2011, 130(2): 173. DOI: 10.1111/j.1439-0523.2009.01764.x.
[9] JIN Q S, WATERS D, CORDEIRO G M, et al. A single nucleotide polymorphism (SNP) marker linked to the fragrance gene in rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Science, 2003, 165(2): 360. DOI: 10.1016/S0168-9452(03)00195-X.
[10] DONG Y J, TSUZUKI E, TERAO H. Trisomic genetic analysis of aroma in three Japanese native rice varieties (Oryza sativa L.)[J]. Euphytica, 2001, 117(3): 191. DOI: 10.1023/a:1026502115436.
[11] LORIEUX M, PETROV M, HUANG N, et al. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1996, 93(7): 1145. DOI: 10.1007/bf00230138.
[12] 江青山. 香型优质不育系宜香1A的选育及应用研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2008. [13] 吴玉双, 李静, 吴翼, 等. 香水椰子主要香味化合物2AP的研究进展[J]. 热带农业科学, 2018, 38(3): 73. DOI: 10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.015. [14] BRADBURY L M, FITZGERALD T L, HENRY R J, et al. The gene for fragrance in rice[J]. Plant Biotechnology Journal, 2005, 3(3): 363. DOI: 10.1111/j.1467-7652.2005.00131.x.
[15] 王付华, 薛华政, 王亚, 等. 利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质[J]. 作物杂志, 2018(6): 40. DOI: 10.16035/j.issn.1001-7283.2018.06.006. [16] WAKTE K, ZANAN R, HINGE V, et al. Thirty-three years of 2-acetyl-1-pyrroline, a principal basmati aroma compound in scented rice (Oryza sativa L.): a status review[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2017, 97(2): 384. DOI: 10.1002/jsfa.7875.
[17] 彭波, 孙艳芳, 袁红雨, 等. 一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用[J]. 西南农业学报, 2017, 30(8): 1695. DOI: 10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.001. [18] SHI W W, YANG Y, CHEN S H, et al. Discovery of a new fragrance allele and the development of functional markers for the breeding of fragrant rice varieties[J]. Molecular Breeding, 2008, 22(2): 185. DOI: 10.1007/s11032-008-9165-7.
[19] BINDUSREE G, NATARAJAN P, KALVA S, et al. Whole genome sequencing of Oryza sativa L.cv. Seeragasamba identifies a new fragrance allele in rice[J]. PLoS ONE, 2017, 12(11): e0188920. DOI: 10.1371/journal.pone.0188920.
[20] KOVACH M J, CALINGACION M N, FITZGERALD M A, et al. The origin and evolution of fragrance in rice (Oryza sativa L.)[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(34): 14448. DOI: 10.1073/pnas.0904077106.
[21] 洪汝科, 李铮友, 王樨, 等. 抗病优质滇型恢复系南34的选育及应用[J]. 种子, 2004, 23(6): 75. DOI: 10.3969/j.issn.1001-4705.2004.06.026. [22] 刘化龙, 张宇, 邹德堂, 等. 香稻种质资源筛选及香味基因遗传研究[J]. 作物杂志, 2014(6): 21. DOI: 10.16035/j.issn.1001-7283.2014.06.004. [23] HE Q, PARK Y J. Discovery of a novel fragrant allele and development of functional markers for fragrance in rice[J]. Molecular Breeding, 2015, 35(11): 217. DOI: 10.1007/s11032-015-0412-4.
[24] 邹茜, 蒋聪, 寇姝燕, 等. 云南粳稻主栽品种的香味基因鉴定和不同检测方法的比较分析[J]. 分子植物育种, 2017, 15(10): 3877. [25] NIU X L, TANG W, HUANG W Z, et al. RNAi-directed downregulation of OsBADH2 results in aroma (2-acetyl-1-pyrroline) production in rice (Oryza sativa L.)[J]. BMC Plant Biology, 2018, 8(1): 100. DOI: 10.1186/1471-2229-8-100.
[26] SHAN Q W, WANG Y P, CHEN K L, et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs[J]. Molecular Plant, 2013, 6(4): 1365. DOI: 10.1093/mp/sss162.
[27] 张羽, 王胜宝, 冯志峰, 等. 陕西省水稻种质资源的香味基因检测[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2011, 39(4): 55. DOI: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2011.04.020. [28] 刘洪, 饶得花, 任永浩, 等. 香稻香气特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉测定方法的建立[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2015, 41(3): 234. DOI: 10.13331/j.cnki.jhau.2015.03.002. [29] SAKTHIVEL K, SUNDARAM R M, RANI N S, et al. Genetic and molecular basis of fragrance in rice[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(4): 471. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2009.04.001.
[30] QIANG H, JIE Y, KIM T S, et al. Resequencing reveals different domestication rate for BADH1 and BADH2 in rice (Oryza sativa)[J]. PLoS ONE, 2015, 10(8): e0134801. DOI: 10.1371/journal.pone.0134801.
[31] CHEN S H, YANG Y, SHI W W, et al. Badh2, encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice fragrance[J]. Plant Cell, 2008, 20(7): 1850. DOI: 10.1105/tpc.108.058917.
计量
- 文章访问数: 2334
- PDF下载量: 31
