高效液相色谱（HPLC）法测定紫花苜蓿叶片中叶黄素循环组分的含量
Determination of the Content of Xanthophyll Cycle Components in Leaves of Medicago sativa L. by HPLC
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Keywords:
- HPLC /
- xanthophyll cycle /
- alfalfa
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高效液相色谱法(HPLC)被广泛运用于植物的硫代葡萄糖苷类化合物[1]、中草药有效成分[2]、茶叶中的游离氨基酸[3]、叶黄素[4]和有机酸[5-6]等成分含量的测定，且具有方法简便、数据准确和重复性好的特点，但未见有此法测定紫花苜蓿叶黄素循环组分含量的研究。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科多年生草本植物，堪称“牧草之王”，既是中国草地农业的主要作物，也是生态治理的重要草种，更是畜牧业赖以发展的物质基础[7-8]。植物在环境胁迫下各项生理活动能力都会降低，尤其是光合能力。一般情况下，植物体能够通过自身调节来避免过量光能对植物的伤害，其中植物体叶黄素循环保护机制与热耗散密切相关，是光保护的主要机制[9]。植物依靠叶黄素循环(xanthophyll cycle)进行热耗散被认为是光保护的主要途径[10]。YAMAMOT[11]提出，叶黄素循环即为叶黄素的3种组分：紫黄质(violaxanthin，V)、环氧玉米黄质(antheraxanthin，A)和玉米黄质(zeaxanthin，Z)在不同的光强和pH条件下，通过环氧和脱环氧化作用相互转化的循环机制。植物能通过叶黄素循环的热耗散，在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下，紫黄质(V)经中间物环氧玉米黄质(A)可转变成玉米黄质(Z)[12]，从而抵抗逆境对植物的伤害。本试验通过建立适合紫花苜蓿叶片中叶黄素循环组分含量测定的HPLC法，为进一步研究紫花苜蓿的耐热机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
云南野生紫花苜蓿种子是本研究团队繁殖的种子，为采自云南迪庆州德钦县奔子栏乡干热河谷地区的野生种；阿尔冈金紫花苜蓿种子引自加拿大。试验用0.1% HgCl2对2个紫花苜蓿种子消毒 30 min，然后将其置于人工气候箱中催芽24 h，白天(14 h)温度为25 ℃，夜间(10 h)温度为18 ℃。将发芽的种子种在介质为腐殖土和红土(对其进行高温高压灭菌)为2∶1的花盆中，3~4 d浇灌1次50%的Hoagland营养液，在植株高约10 cm时，选择长势较一致的幼苗，将其移栽到较大的花盆中，每个种设3个重复，每盆8株。在其生长至150 d时取成熟叶片，以HPLC法测定叶黄素循环组分。
叶黄素循环V、A和Z组分标准品购于CaroteNature公司，纯度99%。
1.2 试验方法
1.2.1 标准品溶液的配制
称取叶黄素(V)标准品0.768 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为76.8 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.076 8、0.153 6、0.307 2和1.536 0 μg/mL的溶液。称取叶黄素(A)标准品0.564 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为56.4 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.056 4、0.112 8、0.225 6和1.128 0 μg/mL的溶液。称取叶黄素(Z)标准品4.8 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为480 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.048 0、0.096 0、0.192 0和0.960 0 μg/mL的溶液。
1.2.2 高效液相色谱(HPLC)条件
用Agilent 1100高效液相色谱仪(美国：G1322A DEGASSER、G1311A QuatPump、G1316A COLCOM、G1315B DAD)进行测定。Agilent Hypersil ODS (4.0×250 mm，4.6 μm)色谱柱(美国)，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，体积分数线性梯度洗脱程序为90% A液 + 10% B液洗脱15 min，接着在5 min内，90% A液体积分数线性递增至100%，之后再洗脱20 min，流速1 mL/min，检测波长445 nm，柱子温度30 ℃，取10 μL样品进样到色谱仪。
1.2.3 样品液的制备
取紫花苜蓿鲜叶0.1 g，倒入液氮研磨至粉末状，加入4 mL 85%丙酮，匀浆2~3 min，再加入1 mL 100%丙酮，匀浆1 min之后置于冰上15 min，1 200 g离心10 min，取上清液用 0.45 μm微孔滤膜过滤后即得样品液，色素提取的全过程在黑暗中进行[13]。
1.2.4 标准曲线的建立
分别取10 μL质量浓度为3、10、50、100和200 μg/mL的标准品溶液，按照上述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标y，质量浓度为横坐标x，建立回归方程。
1.2.5 精密度试验
精密吸取质量浓度为1.92 μg/mL的叶黄素V标准品溶液、质量浓度为1.41 μg/mL的叶黄素A标准品溶液和质量浓度为9.6 μg/mL的叶黄素Z标准品溶液，平行测定5次，每次进样10 μL，按照1.2.2节色谱条件，测定3种叶黄素循环组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.6 稳定性试验
取质量浓度为1.92 μg/mL的叶黄素V标准品溶液、质量浓度为1.41 μg/mL的叶黄素A标准品溶液和质量浓度为12 μg/mL的叶黄素Z标准品溶液，分别在制备后的0、3、6、9、12、18和24 h进样，每次进样10 μL，按照1.2.2节色谱条件，测定3种叶黄素循环组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.7 重现性试验
称取同一样品5份，按1.2.3节方法制备样品溶液，每次进样10 μL，测定叶黄素循环各组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.8 回收率试验
按1.2.3节方法制备样品溶液，测定样品中叶黄素循环各个组分(V、A和Z)的峰面积，通过标准曲线分别计算出质量分数。再分别精确量取样品溶液适量，依次加入叶黄素循环各组分(V、A和Z)的标准品溶液各3份。按照1.2.2节色谱条件进行检测，每次进样10 μL，记录图谱，通过计算得出加标回收率以及RSD值[14-16]。
$ {\rm{RSD}} = \left[ {{\rm{Spr}}{{\left( {\sum {{{{x}}_{{n}}} - {\bar{{x}}}} } \right)}^2}/\left( {{{n}} - 1} \right)} \right]/{\bar{{x}}} \times 100\text{%} ; $
( ) 回收率=加标后测量值/(样品测定值+加标量)×100%。
1.2.9 数据分析
紫花苜蓿叶片叶黄素循环组分的试验数据均以“平均值±标准误”表示，利用统计学软件(SPSS 20.0)进行单因素方差分析(ANOVA)及差异显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 3种物质的标准图谱
叶黄素循环组分紫黄质(V)、环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)的标准图谱见图1~3。由图1~3可知：3种物质的保留时间分别为6.706、9.945和14.852 min。
2.2 紫花苜蓿叶片叶黄素循环组分分离图谱
吸取样品溶液10 μL进入液相色谱仪，在1.2.2节色谱条件下，测定其峰面积，以标准品为对照，测定样品中叶黄素循环组分的含量，V、A和Z含量分别为9.868、6.978和5.771 μg/mL。色谱图如图4所示。
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图 4 紫花苜蓿叶片紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质的分离图谱Figure 4. Chromatogram of violaxanthin, antheraxanthin and zeaxanthin2.3 3种物质标准曲线的绘制
通过梯度质量浓度标准品溶液的测定，色谱峰面积与质量浓度之间呈良好的线性关系(图5~7)，可以得到3种物质的线性回归方程：
V物质的回归方程为y=77 032.972 61x−2.113 31 (r=0.999 49)。
A物质的回归方程为y=76 728.788 71x−1.498 57 (r=0.999 61)。
Z物质的回归方程为y=911 43.207 69x−1.345 47 (r=0.999 60)。
由此，可通过测定3种物质的色谱峰面积，准确计算出样品中3种物质的浓度。
2.4 方法验证
按照1.2.5节的方法进行精密度试验，测定V、A和Z标准品溶液平均(n=5)峰面积(mAU·s)分别为140 7.17、102 0.50和948.55，RSD分别为0.96%、0.39%和0.87%，符合常规定量分析要求，表明仪器精密度良好。
按照1.2.6节的方法进行稳定性试验，测定室温下叶黄素循环各组分V、A和Z标准品溶液(n=7)的峰面积(mAU·s)，结果分别在1 241.97~1 378.39、1 077.32~1 040.56和1 180.41~1 123.47范围内，且0~24 h叶黄素循环3种组分峰面积的RSD值分别为3.33%、1.42%和1.86%，符合常规定量分析要求，表明供试样品溶液在24 h内稳定。
按照1.2.7节的方法进行重现性试验，测得样品溶液(n=5) V、A和Z的平均峰面积(mAU·s)分别为176.27、4.28和8.98，RSD分别为0.48%、3.98%和2.59%，符合常规定量分析要求，表明该方法的重复性良好。
取已知质量浓度的3种物质(V、A和Z)样品，分别对应加入低、中、高[17]3个不同质量浓度水平的标准品溶液进行回收率测定(n=3)，通过各自的回归方程得出相应的质量浓度，并计算回收率，结果见表1，各组分回收率试验均良好，RSD值符合常规定量分析要求。
表 1 加标回收实验结果Table 1. The results of standard addition recovery叶黄素循环的3个组分
three components of
xanthophyll cycle${\;\rho}$ (样品)/(μg·mL−1)
sample mass concentration加标量/(μg·mL−1)
adding standard
matter amount加标后测定值/
(μg·mL−1)
measured value回收率/%
rate of recovery平均回收率/%
average recovery相对标准差/%
RSDV 2.123 6.144 8.304 100.44 99.55 0.96 7.680 9.771 99.67 9.216 1.117 98.53 A 1.098 4.512 5.318 94.80 96.04 1.38 5.640 6.462 95.91 6.768 7.664 97.43 Z 1.332 3.840 4.888 94.52 94.08 0.51 4.800 5.774 94.17 5.760 6.635 93.57 2.5 样品叶黄素循环3个组分含量的测定
按1.2.3节方法制备样品溶液，在1.2.2节色谱条件下测定2个样品叶黄素循环组分的峰面积，再以各组分的标准方程计算出质量比，结果见表2。从表2可见：2种紫花苜蓿的叶黄素循环组分V和Z、A+Z与V+A+Z及其比值没有差异(P>0.05)，只有A含量云南野生种显著高于阿尔冈金。
表 2This page contains the following errors:
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品种 w(V)/(mg·g−1) w(A)/(mg·g−1) w(Z)/(mg·g−1) w(A+Z)/(mg·g−1) w(V+A+Z)/(mg·g−1) [(A+Z)/(V+A+Z)]/% 云南野生种wild species 0.168 83±0.014 98 a 0.006 77±0.000 55 a 0.010 72±0.001 48 a 0.017 48±0.001 64 a 0.186 31±0.016 59 a 9.38±0.14 a 阿尔冈金Algonquin 0.157 84±0.010 85 a 0.005 55±0.000 45 b 0.011 42±0.000 62 a 0.016 97±0.000 97 a 0.174 81±0.011 19 a 9.73±0.64 a 注：同列中不同小写字母表示在5%水平上差异显著。
Note: Small letters indicate significant difference in the same column at 5% level.3. 讨论
植物叶黄素的3种组分在一定条件下相互转化，可以减轻逆境胁迫对其造成的光抑制，因此，对3种组分含量的测定有利于了解植物光抑制的情况。有研究表明：Z和A有耗散过剩光能和猝灭激发能的作用[18]。本试验中，相同条件下的云南野生种和阿尔冈金的叶黄素循环组分V和Z、A+Z与V+A+Z及其比值没有差异(P>0.05)，是因为样品的生长条件正常，未受到环境胁迫。但云南野生紫花苜蓿叶黄素循环所产生的V、A和Z+A均大于阿尔冈金，可能是因为该种质资源较耐干热，光耗散能力较强[19]。叶黄素循环对过剩能量的耗散能力可以用叶黄素循环组分转化状态(DPS)表示，即DPS=(A+Z)/(V+A+Z)[20]。本试验中，云南野生种的DPS值小于阿尔冈金，是由于二者的A+Z转化量相近，但云南野生紫花苜蓿的叶黄素循环库(V+A+Z)含量较高。有研究表明：在高光胁迫条件下，转基因拟南芥的(A+Z)/(V+A+Z)和NPQ降低，其叶黄素循环功能减弱，对光抑制的敏感性增强[21]。在逆境条件下叶黄素循环的过剩能量耗散能力、光保护作用及机制等方面还有待进一步研究。
4. 结论
云南野生紫花苜蓿叶黄素循环所产生的V、A和Z+A均大于阿尔冈金，表明该种质资源具有较好的耐干热性。本研究利用HPLC法测定紫花苜蓿中叶黄素组分的含量，建立了相应标准曲线测定叶黄素循环各组分含量的方法。该方法能依据保留时间准确有效的区分组分峰和杂峰，在一定质量浓度范围内各组分均具有良好的线性关系，稳定性、重复性好，回收率高，能准确测量叶黄素循环组分的含量，且简单易操作。通过对2种紫花苜蓿叶片叶黄素循环3个组分含量的分析可知，该方法测得的数据符合叶黄素循环相关理论研究，适用于紫花苜蓿叶片中叶黄素循环3个组分含量的测定。
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图 4 紫花苜蓿叶片紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质的分离图谱
Figure 4. Chromatogram of violaxanthin, antheraxanthin and zeaxanthin
表 1 加标回收实验结果
Table 1 The results of standard addition recovery
叶黄素循环的3个组分
three components of
xanthophyll cycle${\;\rho}$ (样品)/(μg·mL−1)
sample mass concentration加标量/(μg·mL−1)
adding standard
matter amount加标后测定值/
(μg·mL−1)
measured value回收率/%
rate of recovery平均回收率/%
average recovery相对标准差/%
RSDV 2.123 6.144 8.304 100.44 99.55 0.96 7.680 9.771 99.67 9.216 1.117 98.53 A 1.098 4.512 5.318 94.80 96.04 1.38 5.640 6.462 95.91 6.768 7.664 97.43 Z 1.332 3.840 4.888 94.52 94.08 0.51 4.800 5.774 94.17 5.760 6.635 93.57 
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表 2
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Table 2
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品种 w(V)/(mg·g−1) w(A)/(mg·g−1) w(Z)/(mg·g−1) w(A+Z)/(mg·g−1) w(V+A+Z)/(mg·g−1) [(A+Z)/(V+A+Z)]/% 云南野生种wild species 0.168 83±0.014 98 a 0.006 77±0.000 55 a 0.010 72±0.001 48 a 0.017 48±0.001 64 a 0.186 31±0.016 59 a 9.38±0.14 a 阿尔冈金Algonquin 0.157 84±0.010 85 a 0.005 55±0.000 45 b 0.011 42±0.000 62 a 0.016 97±0.000 97 a 0.174 81±0.011 19 a 9.73±0.64 a 注：同列中不同小写字母表示在5%水平上差异显著。
Note: Small letters indicate significant difference in the same column at 5% level.
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