16种药用植物提取物抗凝血酶诱导的血小板聚集活性及辣木活性部位的GC-MS分析
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关键词:
- 凝血酶 /
- 抗血小板聚集活性 /
- 辣木 /
- 气相色谱−质谱(GC-MS)联用
Inhibitory Activity of Extracts from 16 Medicininal Plants against Platelet Aggregation Induced by Thrombin and Analysis of the Active Fraction from Moringa oleifera by GC-MS
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光叶紫花苕(Vicia villosa Roth var. glabrescens)为豆科野豌豆属(Vicia)一年生或多年生自花传粉的二倍体植物，是中国重要的豆科牧草之一[1]。它是富含蛋白质、氨基酸和无机盐的饲用绿肥及倒茬作物，既可固氮增加土壤肥力，又能提高其他茬口作物的产量，在农业和畜牧业的可持续发展中扮演着十分重要的角色[2]。光叶紫花苕在云南具有较大的种植面积，因其根系深长，营养价值高，既可作为绿肥作物又能喂养家畜，特别是与其他禾本科植物混合调制的干草不仅可以充分保留青干草中粗蛋白含量，而且还能解决冬春季节牧草不足的问题[3]。
染色体是细胞内具有遗传性质的物质，是遗传信息的载体。染色体的数量、大小和特征等差异是研究物种进化的重要依据，因此进行染色体核型分析，是牧草种质资源研究的重要工作，在鉴定亲缘关系及判定变异程度上具有重要意义[4-5]。野豌豆属中大部分植物为优质牧草和绿肥植物，经济价值较高，全世界约150种[6]，染色体的数目和结构变化较多，数目有2n=10、12、14、24和28等，其染色体基数分别为n=5、6、7、9和11等[7]。目前国内外学者已在窄叶野豌豆(Vicia angustifolia)、箭筈豌豆(Vicia sativa)、广布野豌豆(Vicia cracca)、山野豌豆(Vicia amoena)、多茎野豌豆(Vicia multicaulis)、歪头菜(Vicia unijuga)、四籽野豌豆(Vicia tetrasperma)及毛苕子(Vicia villosa)等[8-15]多种野豌豆属植物中开展过染色体核型研究，但对光叶紫花苕核型分析的研究却较少，仅见冉雪琴等[16]的报道，认为光叶紫花苕染色体核型多数由近中部着丝点(sm) 构成。为了能够进一步探究光叶紫花苕核型的变化，本研究分析了光叶紫花苕的体细胞染色体数目、染色体相对长度、相对长度系数和臂比，从细胞学水平对光叶紫花苕的遗传背景进行研究，以期为揭示野豌豆属的染色体进化规律提供相关的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本研究以云光早光叶紫花苕为研究材料，选取外观完好、活力高、无病虫害且大小均匀的种子。
1.2 试验方法
1.2.1 染色体制片方法
将清选好的种子放入蒸馏水中，室温下浸泡24 h后，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，室温下培养，待幼根长至2~3 mm (豆科牧草种子发芽时有下胚轴伸长的习性，以上长度不包括下胚轴长度)时，在9：00—11：00选取材料；将选取的根尖放入二氯苯和8-羟基喹啉的混合液中，在15 ℃处理3~4 h，蒸馏水多次冲洗后，转入卡诺氏固定液中固定24 h；再用蒸馏水将材料冲洗干净，在1 mol/L盐酸溶液中于60 ℃水浴解离14 min。用卡宝品红溶液和45%醋酸染色30 min，压片制成临时片，并观察染色体，对分裂中期的细胞染色体进行观察。选取清晰的50个细胞进行计数和观察，明确染色体条数；制成的永久片在显微镜下进行观测并记录染色体的长度。
1.2.2 染色体核型分析
核型分析标准：按李懋学等[17]、LEVAN等[18]和STEBBINS[19]的标准进行染色体分类，按KUO等[20]提出的公式进行染色体相对长度系数的计算，最后根据染色体相对长度系数的大小，将其分为4种类型：染色体相对长度系数≥1.26的为长染色体(L)；1.25~1.01的为中长染色体(M2)；1.00~0.75的为中短染色体(M1)，染色体相对长度系数≤0.75的为短染色体(S)。染色体臂比1.0~1.7的为中部着丝点，以m表示；1.7~3.0的为近中部着丝点，以sm表示；3.0~7.0的为近端部着丝点，以st表示；7.0以上的为端部着丝点，以t表示。
染色体相对长度=每条染色体长度/染色体组总长度×100%；
染色体相对长度系数=染色体长度/最短染色体长度；
染色体臂比=长臂长度/短臂长度；
核型不对称系数=染色体长臂总长/全组染色体总长×100%。
1.3 数据统计与分析
试验数据采用SPASS 18.0进行统计分析，采用单因素方差(one-way ANOVA )分析方法进行分析。
2. 结果与分析
2.1 核型分析
对光叶紫花苕进行了染色体计数及核型分析。染色体计数结果表明：光叶紫花苕的染色体数目均为14条，染色体配对数为7，未见随体，且各组同源染色体按照长度从大到小的顺序配对方式见图1。
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图 1 光叶紫花苕同源染色体组配对图Figure 1. V. villosa var. glabrescens homologous chromosomal group pairing diagram2.2 染色体参数分析
对50个根尖细胞进行观察发现，染色体数目为2n=14的细胞有43个，占整体的86.0%。对5个细胞(来源于不同个体)的测量和统计(表1)，光叶紫花苕染色体相对长度变异范围在6.8~19.3，最长染色体是最短染色体长度的3.2倍；相对长度系数范围在0.48~1.35，光叶紫花苕的相对长度系数同源组间标准差为0.349。
表 1 光叶紫花苕染色体参数分析Table 1. Analysis of chromosome parameters of V. villosa var. glabrescens染色体序号
chromosome code相对长度/%
relative length相对长度系数
index of relative length符号标记
symbol1 19.3 1.35 L 2 19.3 1.35 L 3 17.4 1.22 M2 4 14.9 1.04 M2 5 13.0 0.91 M1 6 9.3 0.65 S 7 6.8 0.48 S 在光叶紫花苕的同源染色体组中，第1、2号染色体为长染色体，第3、4号染色体为中长染色体，第5号染色体为中短染色体，第6、7号为短染色体，相对长度组成为2n=14=4L+4M2+2M1+4S。
2.3 同源染色体长度比及类型分析
通过对细胞染色体分散较好、较清晰的片子进行测量以及染色体组型分析。由表2可知：光叶紫花苕同源染色体组染色体臂比均在1.0~1.7之间，臂比值变化范围为1.07~1.50，光叶紫花苕7对染色体全为中部着丝点 (m)。
表 2 同源染色体臂比及类型分析Table 2. Analysis of homologous chromosome length ratio and type染色体序号
chromosome code平均臂比值
mean arm ratio着丝粒类型
type1 1.07 m 2 1.21 m 3 1.33 m 4 1.40 m 5 1.50 m 6 1.16 m 7 1.25 m 综合表1、2中染色体长度和臂比均值，根据STEBBINS[19]的核型分析方法计算得出染色体长度比为3.2，属于“B”型染色体，臂比值范围为1.07~1.50，没有臂比值大于2∶1的染色体，核型不对称系数为55.9%，所以染色体类型为“1B”型。
3. 讨论
核型分析是指为阐明生物染色体组成，确定其染色体组型，从而根据材料的染色体数目、大小、着丝粒位置、臂比和随体等形态特征对生物染色体进行配对和分组等分析[21]。核型分析技术区别于传统的形态鉴别，主要是在细胞水平上研究染色体特征，并以此为依据对植物进行分类，这样会使结果更加真实准确，对于植物分类、演化过程以及种属间亲缘关系的分析等具有重要作用[22]。通过分析染色体形态、数目及结构差异，为物种之间的遗传距离、进化和亲缘关系在细胞学水平上提供了理论依据[2]。
研究表明：野豌豆属植物的染色体一般由3种染色体构成，分别是中部着丝点染色体m、近中部着丝点染色体sm和近端部着丝点染色体st，其中近中部着丝点染色体sm和近端部着丝点染色体st是由中部着丝点染色体m进化而来的，且数目上由2n=14→2n=12的方向进行演化[6-8]。本试验中云光早光叶紫花苕的染色体数目为2n=14，染色体基数为x=7，7对染色体的着丝点均为中部着丝粒m，染色体组的染色体长度比为3.20，臂比值>2的染色体的占比为0.0%，核型不对称系数为55.9%，核型不对称性标准应为1B。因此云光早光叶紫花苕的核型公式为2n=14=14m (1B)，说明该供试材料属于进化程度较低、较原始的类群。虽然云光早光叶紫花苕的染色体数目与冉雪琴等[16]研究的贵州光叶紫花苕、杨根凤等[15]研究的内蒙古毛苕子的染色体数目相同都为14条，但核型却存在显著差异。贵州光叶紫花苕核型公式是2n=14=4m (2SAT)+10sm，第7对染色体有随体；内蒙古毛苕子的核型公式是2n=14=8m (2SAT)+6sm，第3对染色体有随体；而本研究中云光早光叶紫花苕核型公式是2n=14=14m，无随体。本研究中光叶紫花苕的核型结构与前人研究有所差异的原因可能是由以下3个方面造成的。一是由于细胞内染色体结构变异，造成染色体的配对和排列不同；二是由于自然环境不同，为了适应不同的生长环境核型发生了变化；三是由于在试验过程中三者设定的预处理时间、解离时间及试剂不同造成的。且本试验中云光早光叶紫花苕染色体无随体，可能由于随体太小未发现，也有可能是在制片过程中造成丢失，具体原因仍需进一步综合分析。
4. 结论
云光早光叶紫花苕是染色体数目为2n=2x=14的二倍体植物，其核型公式为2n=14=14m，染色体类型为“1B”型，臂比指数主要集中在中部着丝粒m。从核型不对称程度和染色体大小可得出云光早光叶紫花苕属于进化上较为原始的种类。
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图 2 抗小板聚集活性部位PXS58-3-1中化合物1~10的结构式
Figure 2. Chemical structures of compounds 1-10 in the antiplatelet fraction of PXS58-3-1
表 1 缅甸药用植物乙醇提取物对凝血酶诱导家兔血小板聚集的影响(X±SD, n=4)
Table 1 Effects of the ethanol extracts of medicinal plants collected from Myanmar on rabbit platelet aggregation induced by thrombin
处理
treatment植物名
plant name部位
part提取率/%
yield rate聚集率/%
aggregation rate抑制率/%
inhibition rate正常对照 normal control — — — 95.6±4.9 — 溶剂对照 solvent control — — — 2.1±1.1*** — 比伐卢定 bivalirudin — — — 28.7±18.9*** 70.2±22.0*** MMV201 辣木 Moringa oleifera Lam. 花 flower 13.74 81.2±11.6* 17.1±3.9* MMV201-1 辣木 Moringa oleifera Lam. 叶 leaf 10.97 71.2±6.3*** 27.0±4.2*** MMV201-2 辣木 Moringa oleifera Lam. 果荚 pod 11.72 82.0±16.0 15.8±11.1 正常对照 normal control — — — 93.4±4.9 — 溶剂对照 solvent control — — — 3.1±1.2*** — 比伐卢定 bivalirudin — — — 1.9±1.7*** 97.9±1.9*** MY35 Caladium lindenii (André) Madison 根茎 root and shoot 20.81 83.3±4.9* 11.1±8.4* MY38 姜 Zingiber officinale Rosc. 根茎 root and shoot 11.45 85.7±4.0* 8.8±2.9* MY40 耳叶马兜铃 Aristolochia tagala Cham. 根 root 5.70 88.7±0.6* 5.5±4.8* MY42 胡椒 Piper nigrum L. 种子 seed 14.30 85.7±1.2* 8.7±3.8* MY44 茴香 Foeniculum vulgare Mill. 种子 seed 12.48 79.7±8.5** 15.2±9.4** MY46 家独行菜 Lepidium sativum L. 种子 seed 15.09 75.0±10.6** 20.0±12.7** MY48-2 Nigella sativa L. 种子 seed 11.90 83.7±8.7* 11.0±8.8* MY50 Oldenlandia corymbosa L. 全株 whole plant 7.50 81.3±5.5** 13.4±5.0** MY53 Aconitum ferox Wall. ex Ser. 根 root 12.10 74.7±2.9** 20.4±6.0*** MY56 欧亚水龙骨 Polypodium vulgare L. 根茎 root and shoot 2.03 82.7±1.5** 11.9±5.2** MY57 中华青牛胆 Tinospora sinensis (Lour.) Merr. 茎 shoot 8.73 82.7±4.9* 12.7±3.6* MY78 云木香 Saussurea costus (Falc.) Lipsch. 根茎 root and shoot 28.74 80.3±7.6** 16.7±9.9** MY84 蛇根木 Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz 根 root 14.16 79.7±8.1** 16.6±9.8** MY89 积雪草 Centella asiatica (L.) Urb. 全株 whole plant 12.12 76.0±0.0*** 20.5±1.3*** MY107 Aristolochia indica L. 全株 whole plant 7.85 79.7±9.5** 16.6±10.9** 注：提取率按植物材料干质量计算；提取物终质量浓度为 1 500 µg/mL。比伐卢定为阳性对照；与溶媒对照 (1% DMSO) 比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同。
Note: The yield is calculated according to dry weight of plant materials; the extract’s final mass concentration was 1 500 µg/mL. Bivalirudin as positive control; compared with solvent control (1% DMSO), *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001; the same as below.
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表 2 中国产辣木提取物对凝血酶诱导家兔血小板聚集的影响(X±SD, n=4)
Table 2 Effects of the extracts of M. oleifera collected in China on rabbit platelet aggregation induced by thrombin
处理
treatment产地
collection place部位
part提取物
extract提取率/%
yield rate聚集率/%
aggregation rate抑制率/%
inhibition rate正常对照
normal control— — — — 96.5±3.1 — 溶剂对照
solvent control— — — — 1.8±1.0*** — 比伐卢定
bivalirudin— — — — 1.0±0.8*** 99.0±0.8*** PXS58-1 元江 Yuanjiang 叶 leaf 乙醇提取物
ethanol extract22.41 82.0±2.2*** 15.0±3.5*** PXS58-2 元江 Yuanjiang 叶 leaf 精油
essential oil0.004 2 99.3±1.5 −2.9±2.4 PXS58-3 德宏 Dehong 叶 leaf 乙醇提取物
ethanol extract18.63 83.3±2.5*** 13.7±2.8*** PXS58-4 德宏 Dehong 树皮 bark 乙醇提取物
ethanol extract2.10 79.8±10.1* 17.3±10.5* PXS58-5 德宏 Dehong 茎 shoot 乙醇提取物
ethanol extract2.84 98.8±2.5 −2.4±2.2 正常对照
normal control— — — — 88.2±5.1 — 溶剂对照
solvent control— — — — 1.4±0.5*** — 比伐卢定
bivalirudin— — — — 1.8±0.*** 98.0±1.0*** PXS58-3-1 德宏 Dehong 叶 leaf 二氯甲烷萃取部位
dichloromethane extract0.45 64.0±18.8* 28.2±17.8* PXS58-4-1 德宏 Dehong 树皮 bark 二氯甲烷萃取部位
dichloromethane extract0.55 83.4±6.4 5.4±5.1 正常对照
normal control— — — — 98.3±1.5 — 溶剂对照
solvent control— — — — 0.8±0.5 *** — 比伐卢定
bivalirudin— — — — 18.5±7.1*** 81.2±7.2 *** PXS58-3-2 德宏 Dehong 叶 leaf 乙酸乙酯萃取部位
ethyl acetate extract17.04 94.0±4.1 4.3±4.8 PXS58-4-2 德宏 Dehong 树皮 bark 乙酸乙酯萃取部位
ethyl acetate extract6.44 82.0±7.3* 16.6±6.2* 注：提取率按植物材料干质量计算；提取物终浓度为 1 000 µg/mL。
Note: The yield is calculated according to dry weight of plant materials; the extract’s final concentration was 1 000 µg/mL.
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表 3 GC-MS检测出的抗血小板聚集活性部位PXS58-3-1中的化合物
Table 3 Compounds in the antiplatelet fraction PXS58-3-1detected by GC-MS
序号
No.保留时间/min
retention time相对含量/%
relative contentCAS号
CAS No.化合物名称
name of compound分子量
molecular weight分子式
molecular formula1 6.935 1.84 103-71-9 异氰酸苯酯 isocyanatobenzene 119.12 C7H5NO 2 8.400 44.58 616-45-5 2-吡咯烷酮 2-pyrrolidinone 85.10 C4H7NO 3 14.875 23.05 98-92-0 烟酰胺 nicotinamide 122.12 C6H6N2O 4 16.635 0.10 14191-95-8 对羟基苯乙腈 4-hydroxybenzeneacetonitril 133.15 C8H7NO 5 17.448 4.36 96-76-4 2,4-二叔丁基苯酚 2,4-bis (1,1-dimethylethyl) phenol 206.32 C14H22O 6 19.952 5.40 38818-55-2 (E)-4-(buta-1,3-dien-1-yl)-3,5,5-trimethylcyclohex-2-enone 190.28 C13H18O 7 21.731 8.22 458-35-5 松柏醇 coniferyl alcohol 180.20 C10H12O3 8 24.284 1.24 112-39-0 棕榈酸甲酯 methyl palmitate 270.45 C17H34O2 9 24.748 9.74 57-10-3 棕榈酸 palmitic acid 256.42 C16H32O2 10 26.623 1.48 620-92-8 双酚F 4,4′-methylene diphenol 200.23 C13H12O2
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