白蜡虫泌蜡初期全长转录组测序及FAR在雌雄虫中蛋白表达分析
Full-length Transcriptome Sequencing of Ericerus pela at the Early Stage of Wax Secretion and Protein Expression Analysis of FAR in Males and Females
-
白蜡虫(Ericerus pela)是中国一种传统养殖的独特资源昆虫，其二龄雄幼虫分泌的白蜡熔点高、光泽好、理化性质稳定、隔水防热、润滑保湿，被广泛应用于纺织蜡染、食品包装、精密仪器润滑固封、医药以及化妆品等行业[1-7]。白蜡虫雌雄二型，雌虫经卵、幼虫(一龄定叶期、二龄定杆期)、成虫三阶段发育成熟，在寄主树上营固定寄生生活，其体壁会发育成高度角质化的几丁质外壳，起到防御天敌和病原菌、维持体内水分、保护虫体远离阳光灼伤等作用；雄虫则经过卵、幼虫(一龄定叶期、二龄定杆期)、蛹(前蛹、真蛹)、成虫等阶段发育成熟，在一龄幼虫时有较少蜡丝分泌，到二龄时大量分泌蜡丝形成蜡被覆盖虫体，在体壁角质化程度很弱的雄虫外围形成一保护层，起到防御天敌、隔绝外界不良气候等作用，维持虫体的正常生理代谢[8-10]。泌蜡高峰期主要集中在雄虫的二龄前期和中后期[4]。泌蜡也是蚧科昆虫最显著的特点，泌蜡量可达虫体总质量的58%~98%，是介壳虫在暴露的生存环境中进化形成的特殊适应机制[11]。
目前已明确，在动植物中蜡酯的合成途径是保守的，脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase，FAR)是该途径的关键酶之一，FAR以酰基化的脂肪酸为底物，催化脂酰辅酶A还原为相应脂肪醇，FAR催化生成的脂肪醇是生物体内脂肪醇的主要来源[5,10,12-14]。实验室前期对白蜡虫泌蜡高峰期的二代转录组数据进行分析和实时定量PCR检测，筛选出了一些参与白蜡虫泌蜡的far候选基因[10]。但由于白蜡成分较多，还有一些成分对应的far并没有被鉴定。而且far基因在泌蜡高峰期之前(泌蜡初期)应该已经大量表达；此外，二代测序获得的基因全长序列较少，不利于基因的分析；而基于PacBio的三代转录组测序可以获得更多全长基因以及更全面的基因转录情况，有效避免了二代测序中基因片段较多的情况，更方便进行基因功能研究[15-20]，因此，本研究选取泌蜡初期的二龄雄虫进行三代全长转录组测序，筛选在泌蜡初期已经大量表达的FAR，尽量获得所有参与白蜡合成的FAR酶基因。
在同一物种内存在多个far基因，它们在生物体内表达部位不同，参与的生理过程不同，也可能多个far基因参与相同的生理过程[21-23]。由于FAR的定位和参与的生理功能紧密相关，因此，对FAR进行表达特点分析，在一定程度上可以说明其参与的生理功能。前期采用荧光定量PCR分析far基因转录情况发现：far基因主要在白蜡虫二龄雄虫表达，在雄虫的其他一些时期以及雌虫的一些发育阶段也有表达。由于基因转录和蛋白表达可能不完全一致，通过抗体进行FAR蛋白表达分析更能反映FAR的表达特点。
为全面了解白蜡虫参与泌蜡的FAR基因，明确参与泌蜡FAR在白蜡虫雌雄虫中的表达情况，本研究拟采用三代全长转录组测序获得更多的FAR全长，与前期转录组数据进行比较，筛选参与白蜡虫泌蜡的FAR候选基因，对关注的FAR通过免疫小鼠制备单克隆抗体，利用该单克隆抗体初步分析该FAR在白蜡虫雌雄虫中的表达情况。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
试验所用昆虫为白蜡虫泌蜡初期二龄雄虫，采集于云南省昆明市中国林业科学研究院资源昆虫研究所人工大棚所种女贞(Ligustrum lucidum)树上。
1.2 白蜡虫二龄雄虫总RNA提取和PacBio ISO-Seq转录组测序
收集的白蜡虫二龄雄虫置于1.5 mL离心管中，依照Trizol试剂盒(Invitrogen，美国)操作说明提取总RNA，并以此为模板，按照Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit操作说明合成第1链cDNA，利用第1链cDNA通过PCR扩增合成第2链cDNA，之后，二次PCR扩增双链DNA，将此样品用于SMRTbell建库，之后将BluePippinTM片段选择的文库与不分片段的文库混合，进行后续转录组测序，一般片段选择范围不大于4 kb。
将Pacific Biosiences Sequel下机后获得的数据采用SMrT analysis套件进行如下操作：插入片段识别(reads of insert，ROI)，各条插入片段通过下机suberads数据来识别，之后整合生成consensus形式的插入片段序列；Reads分类(classify)，将插入片段序列去ployA接头，然后对插入片段进行分类，包括嵌合(chimeric)、非嵌合(nonchimeric)、全长(full-length)、非全长(non- full-length)序列分类；Reads聚类和校正(cluster，quvier)，采用ICE (interative clustering and error correction)算法对Isoforms进行de novo预测，通过Quiver算法校正Isoforms，最后输出high QV和low QV的Isoforms，其中，Isoforms长度小于3 k、3~6 k以及5~10 k的文库中Quvier质量值分别>0.99、>0.98、>0.95的都分类为high QV。
之后使用cd-hit对聚类和纠错后的转录本进行去冗余操作，将各个文库中高质量的全长序列合并在一起，对转录本NT、NR、KOG、KEGG和SwissProt的注释使用Blast进行，GO注释通过Blast2GO以及NR注释结果进行，InterPro注释则采用InterProScan5进行。
转录本的CDS预测使用TransDecoder进行，首先对Unigene.fa采用TransDecoder.LongOrfs搜索开放读码框，将长读码框序列进行提取，之后利用Diamond Blastp根据序列相似性将Unigene.fa 比对到SwissProt数据库上，对Blast结果在Pfam数据库中采用Hmmscan筛选，最后Unigene.fa编码序列的预测通过TransDecoder.Predict进行。
1.3 单克隆抗体制备
1.3.1 抗原来源
从转录组中鉴定与白蜡虫泌蜡相关的far基因，并与以前研究结果进行分析比较，将本研究关注的1条FAR命名为far3基因，通过比对转录组Isoform和cDNA末端快速扩增(RACE)的结果克隆CDS部分，进行原核表达[24]，以前期诱导表达获得的目的蛋白为单克隆抗体制备的抗原。
1.3.2 抗原纯化
取far3基因已构建好的原核表达菌株诱导表达目的蛋白，对该目的蛋白进行复性，通过透析方式纯化蛋白，采用SDS质控方式确定抗原纯化质量。
1.3.3 动物免疫与ELISA检测免疫效价
将1.3.1节中提纯的抗原分2次共免疫8只小鼠，每只进行3次免疫，第1批次免疫小鼠编号为：1-左、1-右、1-中、1-无，第2次免疫小鼠分别为：2-左、2-右、2-中、2-无。第1次免疫在每只小鼠皮下注射抗原(50 μg，完全弗佐与PBS以1∶1比例混合溶解)，经历3 d免疫反应时间后，在小鼠皮下注射抗原(50 μg，不完全弗佐与PBS以1∶1比例混合溶解)进行二次免疫，再次免疫反应3 d时间，重复二次免疫操作。对经历3次免疫的小鼠抽取血清，采用间接ELSIA手段检测免疫效价。
1.3.4 单克隆抗体筛选
采用半固体和液体相结合的方式经历5~10 d进行细胞融合，构建杂交瘤细胞，利用间接ELISA手段检测培养融合细胞的上清液，选择检测的效价和亲和力均较高的细胞株进行下一步亚克隆，同样采取间接ELISA检测亚克隆细胞株效价，选取效价与亲和力均较高的细胞株再次进行亚克隆，收集二次亚克隆上清，通过抗原重组蛋白进行Western-blot验证，操作如下：将抗原重组蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，孵育抗体，一抗为收集的细胞株亚克隆上清，二抗为山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(ABCam，美国)，洗膜后将超敏化学发光试剂(Affinity，美国)A液与B液等量混合滴于膜上，在ChemiDoc XRS仪(Bio-Rad，美国)中观察。
对Western-blot筛选成功的以及间接ELISA检测二次亚克隆细胞培养上清为全阳性的细胞株扩大培养，获得可以稳定分泌阳性抗体的细胞定株，并进一步扩大培养，鉴定该上清亚型。
1.3.5 小鼠腹水纯化
选取1.3.3节中获得的细胞注射到小鼠上进行腹水制备，获得的腹水进行如下操作进行纯化：采用ProteinG (GE Healthcare)进行亲和层析，对ProteinG选用10倍于柱床体积的ddH2O和1% NaAc均以1 mL/ min流速冲洗1.5 h，对待纯化样品选用0.22 μm过滤膜过滤，并加入40 mL的1% NaAc，以0.5 mL/ min的流速进行上样，反应3.5 h，之后，采用1% NaAc以1 mL/min流速冲洗层析柱，至再没有蛋白流出；选用3.5%冰乙酸冲洗层析柱，收集洗脱产物至无蛋白流出，并使用饱和的碳酸钠调节收取的洗脱产物的pH至中性，通过10 ku超滤管浓缩蛋白，并将其放入5 L PBS缓冲液中进行过夜透析，次日更换新鲜PBS溶液，第2天换液1次，收取最终样品。将腹水纯化获得的抗体进行SDS质控监测和以抗原重组蛋白为包被源进行间接ELISA检测。
1.3.6 白蜡虫雌雄虫蛋白表达分析
选取白蜡虫成熟未育卵的雌虫和泌蜡期的二龄雄虫抽提蛋白，通过Western-blot进行蛋白表达分析，操作同上。
2. 结果与分析
2.1 三代全长转录组测序基础数据结果
利用PacBio Sequel平台对白蜡虫样本进行测序，建立1个PacBio ISO-Seq文库，共获得聚合酶读取(Polymerase Reads)序列610 775条，N50长度为46 230 bp。测序共获得Subreads 9 583 278条，平均长度为1 548.68 bp，N50长度为1 768 bp。在SMRTbell测序中得到了1 199 884 781 bp、590 087 reads CCS (reads of insert)数据量，插入片段平均长度为2 033 bp，平均读取质量为0.94，Passes数量为12。经reads聚类和纠正后，共获得Isoforms 131 414条，平均长度为1 817 bp，N50为2 020 bp (图1)。
2.2 转录本功能注释
131 414条Isoforms转录本中共有76 603条转录本被注释到Nr (69 613条)、Nt (16 141条)、Swissprot (58 226条)、KEGG (58 857条)、KOG (57 292条)、Iterpro (55 633条)以及GO (27 583条)七大数据库中，有3 400条Isoforms在每一数据库中均得到注释(表1)。
表 1 功能注释结果汇总Table 1. Function annotation results summary基因总数
total非冗余蛋白
数据库 Nr非冗余核酸
数据库Ntswissprot 京都基因与基因组
百科全书 KEGG真核生物同源
蛋白簇 KOGiterpro 基因本体
GO共有数量
intersection注释总数
overall数量number 131 414 69 613 16 141 58 226 58 857 57 292 55 633 27 583 3 400 76 603 百分比/% percentage 100 52.97 12.28 44.31 44.79 43.60 42.33 20.00 2.59 58.29 注：Intersection指被七大数据库中所有数据库注释上的转录本总数及比例；overall指被七大数据库中任意一个数据库注释上的转录本总数及比例。
Note: Intersection means the total number and proportion of transcripts annotated on all databases in the seven databases; overall means the total number and proportion of transcripts annotated by any of the seven databases.2.2.1 Nr功能注释
在Nr数据库中有69 613条Isoforms被注释，其中有14.25%被注释到烟粉虱(Bemisia tabaci)上，9.86%被注释到内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)上，另有8.52%与4.52%被分别注释到褐飞虱(Nilaparvata lugens)与桃蚜(Myzus per-sicae)上(图2)。
2.2.2 KOG功能注释
在KOG数据库中共有57 292条Isoforms被注释，分别注释到25个功能分类中，其中，在一般功能预测分类中被注释到的Isoforms最多，其次依序为信号转导机制、翻译后修饰/蛋白质周转/伴侣、转录、未知功能分类、碳水化合物运输与代谢、RNA处理与修饰等，在细胞活性功能分类注释最少。
2.2.3 GO功能注释
Isoforms在GO数据库中共有27 583条被注释到，分为GO生物过程、分子功能和细胞组成三大分支中。在生物过程分支内26个小功能分类中以细胞过程和代谢过程分类中注释最多；细胞组成分类中以膜、膜部分、细胞、细胞部分得到注释的Isoforms最多；在分子功能分支下催化活性与binding被注释的Isoforms最多，并且是GO所有小功能分类中被注释最多的(图3)。
2.2.4 KEGG功能注释
KEGG注释Isoforms分布包含了细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病以及代谢和有机系统等五大方面，以代谢分类中注释的Isoforms最多。代谢分类中以Global and overview maps注释的Isoforms最多，其次为碳水化合物代谢和脂质代谢。环境信息处理分支下以信号转导Isoforms被注释最多。细胞过程以运输和代谢小功能分类注释到的Isoforms最多，遗传信息处理以翻译注释最多，有机系统中以内分泌系统和免疫系统注释的Isoforms最多(图4)。
2.3 far基因鉴定与筛选
本三代全长转录组测序共获得81个far基因，其中13个基因的FPKM值在1.0以上，明显高于其他far基因。对这13个基因与前期的10个表达谱数据进行分析比较，发现有6个基因的表达谱与白蜡虫泌蜡较为一致，其中1个表达量非常高，且表达谱与白蜡虫泌蜡特点非常一致的far基因，与前期筛选的far3基因片段重叠部分一致，将全长转录组中该far基因命名为far3。去冗余后发现该基因有3个不同的Isoform。
2.4 抗原纯化
对前期已构建好的far3原核表达菌株诱导表达目的蛋白，提取该蛋白作为抗原并进行纯化。经SDS质控检测，结果如图5所示：纯化获得的抗原质量浓度约为0.8 mg/ mL，纯度为80 %，可以进行下一步免疫试验。
2.5 免疫效价间接ELISA检测结果
经过间接ELISA检测免疫的8只Balb/c小鼠，其血清抗体效价在不同稀释度平行变化，在较低稀释度时，免疫效价大于1，且空白对照均小于0.2，因此，每只免疫小鼠血清都满足要求，可以进行下一步抗体筛选试验。
2.6 单克隆抗体筛选
对融合后的杂交瘤细胞定株进行亚型检测，其中编号为3B10 1C1、2C3 2D7、1C11 3E5、6F10 3H6和2B8 4G5等定株为IgG1亚型，2B4 2D2定株为IgG2b亚型，3B9 3F8和5F8 4A7定株为IgG2a亚型。选取3B10 1C1与1C11 3E5定株的细胞培养上清原液，以及空白SP2/0培养上清原液、无关杂交瘤细胞株的培养上清原液对抗原重组蛋白进行Western-blot验证，其中，3B10 1C1和1C11 3E5杂交瘤细胞培养上清均与抗原重组蛋白结合，其蛋白条带与目的蛋白大小相同(图6)。由上结果，选择3B10 1C1杂交瘤细胞定株扩大培养以及后续腹水制备试验。
![]()
图 6 杂交瘤细胞株培养上清Western-blot验证抗原重组蛋白结果注：M为Marker；泳道1. 无关杂交瘤细胞株培养上清原液；泳道2. SP2/0培养上清原液；泳道3. 杂交瘤细胞培养上清1C11 3E5原液；泳道4. 杂交瘤细胞培养上清3B10 1C1原液。Figure 6. Western-blot validation of recombinant antigen protein with supernatant of hybridoma cell lineNote: M was Marker; Lane 1. supernatant solution for culture of unrelated hybridoma cell lines; Lane 2. SP2/0 culture supernatant solution; Lane 3. supernatant 1C11 3E5 concentrate of hybridoma cell culture; Lane 4. hybridoma cell culture supernatant 3B10 1C1 concentrate.2.7 腹水纯化及抗体效价检测
对腹水纯化后获得3B10 1C1抗体，通过SDS质控检测，其质量浓度约为7.5 mg/ mL，纯度90 %，经效价检测结果显示具有较高亲和力(图7)，证明抗体制备成功。
2.8 白蜡虫雌雄虫中蛋白表达分析
选取3B10 1C1杂交瘤细胞以及GAPDH内参抗体分别与白蜡虫定杆雌虫和雄虫内源蛋白进行Western-blot验证，其中，3B10 1C1杂交瘤细胞定株的培养上清与雌虫、雄虫内源蛋白都有结合，且雄虫偏多，而内参抗体未与雌虫或雄虫蛋白有结合(图8)，同时说明FAR3的抗体制备成功。
![]()
图 8 杂交瘤细胞株培养上清Western-blot验证雌(a)雄(b)虫内源蛋白结果注：M为Marker；泳道1、3一抗为GAPDH内参抗体；泳道2、4一抗为杂交瘤细胞培养上清3B10 1C1原液。Figure 8. Western-blot analysis of hybridoma cell lines was performed to the results of endogenous proteins in female (a) and male (b)Note: M was Marker; Lane 1 and 3 were endogenous reference antibodies of GAPDH; Lane 2 and 4 were endogenous protein of 3B10 1C1 in supernatant of hybridoma cell culture.3. 讨论
与二代测序相比，依靠PacBio平台进行的三代转录组测序，获得片段长，转录本大部分可以被测通，经分析可以直接获得全长转录本，能更全面地了解基因转录情况，方便进行基因功能研究。由于蛋白表达是在基因转录之后，在白蜡虫泌蜡初期白蜡合成的基因已经大量转录。所以本次转录组测序对象为白蜡虫泌蜡初期的二龄雄虫，在测序技术上选用了PacBio平台进行三代全长转录组测序，获得更多的全长，有利于基因的统计和表达动态分析。在本次转录组测序中获得去冗余后的Isoform 131 414条，平均长度为1 817 bp，N50为2 020 bp，说明本次转录组数据获得良好，并可进行功能基因的筛选。
far基因在生物体内普遍存在，但参与的生理功能不同。拟南芥已鉴定的8个基因中far3参与根茎叶角质层蜡的形成，far1、far4和far5则在根内皮细胞中参与软木脂的合成[21,23]。在希蒙得木(Simmondsia chinensis)中主要鉴定到参与希蒙得木油的合成的far[25]；而家蚕(Bombyx mori)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)以及意大利蜜蜂(Apis mellifera)等昆虫中鉴定到的far参与信息素的合成[26-28]。在昆虫中，FAR的研究主要集中在性信息素合成方面[26-29]，而昆虫蜡酯合成的FAR基因相关信息较少。实验室在前期转录组分析发现在白蜡虫中多达40多种far，筛选获得有5种far极可能参与白蜡的分泌。本研究以经济昆虫白蜡虫泌蜡初期雄虫为研究对象，通过三代全长转录组测序共获得81个白蜡虫far基因，远远高于二代测序的泌蜡高峰期的转录组获得的far基因。经筛选发现有6个基因的表达谱与白蜡虫泌蜡较为一致，其中1个far基因与前期筛选的far3基因片段重叠部分序列一致，分析认为该基因可能是白蜡虫泌蜡的关键酶基因之一，因此，将全长转录组中该far基因名为far3，并对其功能特点进行初步探索。
far生理功能与其在物种中的表达部位密切相关。如对家禽2种far在不同组织中的表达量进行荧光定量PCR分析，结果显示在尾脂腺中far1表达最高，在大脑组织中far2表达量最高[30]。另通过免疫荧光技术确定了果蝇(Drosophila melanogaster) Waterproof基因表达的far定位于胚胎气管部位，其表达时期伴随了整个气管发育过程[31]。一般采用荧光定量PCR方式对基因表达情况进行分析，但基因表达可能与蛋白表达不是同步的，不能直接反映蛋白的表达情况，通过抗体则可以直接分析蛋白的表达情况。此外，相比较多克隆抗体而言，单抗具有更强的特异性。因此，本研究利用原核表达的蛋白为抗原免疫小鼠制备far3的抗体，通过抗体特异性的免疫结合分析白蜡虫定杆时期雌虫和雄虫的far3的表达情况，该结果显示：雌虫中FAR3表达较少，雄虫中FAR3大量表达，FAR3的蛋白表达与白蜡虫泌蜡特点一致。单克隆抗体的成功制备以及虫体内源蛋白的表达分析确定FAR3在虫体内表达，为进一步免疫荧光明确FAR3的组织表达部位奠定了基础。
本研究通过对泌蜡初期的白蜡虫二龄雄虫进行三代全长转录组测序获得了与白蜡虫泌蜡相关的far3基因，确定FAR3在二龄雄虫分泌白蜡期高量表达，这为白蜡虫其他far基因功能研究以及探索白蜡虫泌蜡分子机理奠定了基础，也为其他昆虫的类似研究提供了一定的参考价值。
-
![]()
图 6 杂交瘤细胞株培养上清Western-blot验证抗原重组蛋白结果
注：M为Marker；泳道1. 无关杂交瘤细胞株培养上清原液；泳道2. SP2/0培养上清原液；泳道3. 杂交瘤细胞培养上清1C11 3E5原液；泳道4. 杂交瘤细胞培养上清3B10 1C1原液。
Figure 6. Western-blot validation of recombinant antigen protein with supernatant of hybridoma cell line
Note: M was Marker; Lane 1. supernatant solution for culture of unrelated hybridoma cell lines; Lane 2. SP2/0 culture supernatant solution; Lane 3. supernatant 1C11 3E5 concentrate of hybridoma cell culture; Lane 4. hybridoma cell culture supernatant 3B10 1C1 concentrate.
![]()
图 8 杂交瘤细胞株培养上清Western-blot验证雌(a)雄(b)虫内源蛋白结果
注：M为Marker；泳道1、3一抗为GAPDH内参抗体；泳道2、4一抗为杂交瘤细胞培养上清3B10 1C1原液。
Figure 8. Western-blot analysis of hybridoma cell lines was performed to the results of endogenous proteins in female (a) and male (b)
Note: M was Marker; Lane 1 and 3 were endogenous reference antibodies of GAPDH; Lane 2 and 4 were endogenous protein of 3B10 1C1 in supernatant of hybridoma cell culture.
表 1 功能注释结果汇总
Table 1 Function annotation results summary
基因总数
total非冗余蛋白
数据库 Nr非冗余核酸
数据库Ntswissprot 京都基因与基因组
百科全书 KEGG真核生物同源
蛋白簇 KOGiterpro 基因本体
GO共有数量
intersection注释总数
overall数量number 131 414 69 613 16 141 58 226 58 857 57 292 55 633 27 583 3 400 76 603 百分比/% percentage 100 52.97 12.28 44.31 44.79 43.60 42.33 20.00 2.59 58.29 注：Intersection指被七大数据库中所有数据库注释上的转录本总数及比例；overall指被七大数据库中任意一个数据库注释上的转录本总数及比例。
Note: Intersection means the total number and proportion of transcripts annotated on all databases in the seven databases; overall means the total number and proportion of transcripts annotated by any of the seven databases.
下载: 导出CSV
-
[1] 吴次彬. 白蜡虫及白蜡生产[M]. 北京: 中国林业出版社, 1989. [2] 龙村倪. 中国白蜡虫的养殖及白蜡的西传[J]. 中国农史, 2004, 23(4): 18. DOI: 10.3969/j.issn.1000-4459.2004.04.003. [3] 何晨柳, 孔任秋, 胡晗华. 产蜡酯聚球藻PCC7002的构建[J]. 水生生物学报, 2010, 34(6): 1202. DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.01202. [4] 陈晓鸣. 白蜡虫自然种群生态学[M]. 北京: 科学出版社, 2011. [5] 杨璞, 徐冬丽, 陈晓鸣, 等. 蜡酯合成途径及关键酶的研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2012, 34(7): 695. [6] YANG P, CHEN X M, LIU W W, et al. Transcriptome analysis of sexually dimorphic Chinese white wax scale insects reveals key differences in developmental programs and transcription factor expression[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 8141. DOI: 10.1038/srep08141.
[7] YU S H, YANG P, SUN T, et al. Identification and evaluation of reference genes in the Chinese white wax scale insect Ericerus pela[J]. Springerplus, 2016, 5(1): 791. DOI: 10.1186/s40064-016-2548-z.
[8] 陈晓鸣, 冯颖. 资源昆虫学概论[M]. 北京: 科学出版社, 2009. [9] STÖVEKEN T, KALSCHEUER R, MALKUS U, et al. The wax ester synthase/acyl coenzyme A: diacylglycerol acyl tansferase from Acinetobacter sp. Strain ADP1: characterization of a novel type of acyl transferase[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(4): 1369. DOI: 10.1128/JB.187.4.1369-1376.2005.
[10] YANG P, ZHU J Y, GONG Z J, et al. Transcriptome analysis of the Chinese white wax scale Ericerus pela with focus on genes involved in wax biosynthesis[J]. PLoS One, 2012, 7(4): e35719. DOI: 10.1371/journal.pone.0035719.
[11] 谢映平, 薛皎亮, 郑乐怡. 蚧科昆虫的蜡泌物超微结构和化学成分[M]. 北京: 中国林业出版社, 2006. [12] LARDIZABAL K D, METZ J G, SAKAMOTO T, et al. Purification of a jojoba embryo wax synthase, cloning of its cDNA, and production of high levels of wax in seeds of transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2000, 122(3): 645. DOI: 10.1104/pp.122.3.645.
[13] METZ J G, POLLARD M R, ANDERSON L, et al. Purification of a jojoba embryo fatty acyl-coenzyme A reductase and expression of its cDNA in high erucic acid rapeseed[J]. Plant Physiology, 2000, 122(3): 635. DOI: 10.2307/4279138.
[14] CHENG J B, RUSSELL D W. Mammalian wax biosynthesis. I. Identification of two fatty acyl-coenzyme A reductases with different substrate specificities and tissue distributions[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(36): 37789. DOI: 10.1074/jbc.M406225200.
[15] SUN W, YOU X, GOGOL-DÖRING A, et al. Ultra-deep profiling of alternatively spliced Drosophila dscam isoforms by circularization-assisted multi-segment sequencing[J]. The EMBO Journal, 2013, 32(14): 2029. DOI: 10.1038/emboj.2013.144.
[16] SHARON D, TILGNER H, GRUBERT F, et al. A single-molecule long-read survey of the human transcriptome[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(11): 1009. DOI: 10.1038/nbt.2705.
[17] ZHANG W, CICLITIRA P, MESSING J. PacBio sequencing of gene families-a case study with wheat gluten genes[J]. Gene, 2014, 533(2): 541. DOI: 10.1016/j.gene.2013.10.009.
[18] TILGNER H, GRUBERT F, SHARON D, et al. Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(27): 9869. DOI: 10.1073/pnas.1400447111.
[19] THOMAS S, UNDERWOOD J G, TSENG E, et al. Long-read sequencing of chicken transcripts and identification of new transcript isoforms[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e94650. DOI: 10.1371/journal.pone.0094650.
[20] XU Z, PETERS R J, WEIRATHER J, et al. Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis[J]. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology, 2015, 82(6): 951. DOI: 10.1111/tpj.12865.
[21] ROWLAND O, ZHENG H Q, HEPWORTH S R, et al. CER4 encodes an alcohol-forming fatty acyl-coenzyme A reductase involved in cuticular wax production in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2006, 142(3): 866. DOI: 10.1104/pp.106.086785.
[22] LI F L, WU X M, LAM P, et al. Identification of the wax ester synthase/acyl-coenzyme A: dia cylglycerol acyltransferase WSD1 required for stem wax ester biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2008, 148(1): 97. DOI: 10.1104/pp.108.123471.
[23] DOMERGUE F, VISHWANATH S J, JOUBÈS J, et al. Three Arabidopsis fatty acyl-coenzyme A reductases, FAR1, FAR4, and FAR5, generate primary fatty alcohols associated with suberin deposition[J]. Plant Physiology, 2010, 153(4): 1539. DOI: 10.1104/pp.110.158238.
[24] 赵遵岭, 王雪庆, 杨璞. 白蜡虫far3基因cDNA全长克隆、原核表达和酶活分析[J]. 四川动物, 2019, 38(2): 149. DOI: 10.11984/j.issn.1000-7083.20180328. [25] KALSCHEUER R, STÖVEKEN T, LUFTMANN H, et al. Neutral lipid biosynthesis in engineered Escherichia coli: jojoba oil-like wax esters and fatty acid butyl esters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(2): 1373. DOI: 10.1128/AEM.72.2.1373-1379.2006.
[26] MOTO K, YOSHIGA T, YAMAMOTO M, et al. Pheromone gland-specific fatty-acyl reductase of the silkmoth, Bombyx mori[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(16): 9156. DOI: 10.1073/pnas.1531993100.
[27] ANTONY B, FUJII T, MOTO K, et al. Pheromone-gland-specific fatty-acyl reductase in the adzuki bean borer, Ostrinia scapulalis (Lepidoptera: Crambidae)[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 39(2): 90. DOI: 10.1016/j.ibmb.2008.10.008.
[28] TEERAWANICHPAN P, ROBERTSON A J, QIU X. A fatty acyl-CoA reductase highly expressed in the head of honey bee (Apis mellifera) involves biosynthesis of a wide range of aliphatic fatty alcohols[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40(9): 641. DOI: 10.1016/j.ibmb.2010.06.004.
[29] LIÉNARD M A, HAGSTRÖM A K, LASSANCE J M, et al. Evolution of multicomponent pheromone signals in small ermine moths involves a single fatty-acyl reductase gene[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(24): 10955. DOI: 10.1073/pnas.1000823107.
[30] HELLENBRAND J, BIESTER E M, GRUBER J, et al. Fatty acyl-CoA reductases of birds[J]. BMC Biochemistry, 2011, 12: 64. DOI: 10.1186/1471-2091-12-64.
[31] MARTIN H. J. J, RALF P, DIETMAR R, et al. The fatty acyl-CoA reductase waterproof mediates airway clearance in Drosophila[J]. Developmental Biology, 2014, 385(1): 23. DOI: 10.1016/j.ydbio.2013.10.022.
-
期刊类型引用(2)
1. 李媛媛，德力格尔，张博，林晨，石凯. 伞裙追寄蝇滞育和非滞育蛹在脂代谢中的差异表达基因分析. 应用昆虫学报. 2022(04): 824-832 . 
百度学术
2. 李敏，刘志琦. 六类常见泌蜡昆虫的蜡腺和蜡泌物研究进展. 环境昆虫学报. 2022(05): 1154-1162 . 百度学术
其他类型引用(3)
计量
- 文章访问数: 2458
- PDF下载量: 26
- 被引次数: 5
