云南省不同地区烟草上TSWV NSs氨基酸序列分析
NSs Amino Acid Sequence Analysis of TSWV on Tobacco from Different Areas of Yunnan Province
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Keywords:
- tobacco /
- TSWV /
- NSs /
- amino acid sequence /
- geographic source
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朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)是泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒，2013年在中国云南被首次发现并报道[1]，本课题组首次报道了朱顶红褪绿环斑病毒的全基因组序列[2-3]。朱顶红褪绿环斑病毒能系统侵染一点红、番茄、莴苣、旱金莲和豇豆等经济作物，主要症状为同心环纹、叶片畸形、局部褪绿和坏死[4]，对农业生产造成了严重的威胁。HCRV为三分子基因组，分别是L RNA、M RNA和S RNA。L RNA仅有1个开放阅读框，正向编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；M RNA正向编码非结构蛋白(non-structural protein of M RNA，NSm)，互补链编码糖蛋白前体(glycoproteins，Gn/Gc)；S RNA正向编码非结构蛋白NSs (non-structural protein of S RNA，NSs)，互补链编码核壳体蛋白 (nucleocapsid protein，N)[5]，N蛋白序列保守程度较高[6]，因此通常被用于进行Tospovirus属病毒的分类检测和鉴定[7]，N蛋白也可能与病毒粒子装配有关[8]。本研究通过RT-PCR鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草感染HCRV的4份样品。为研究核壳体蛋白序列特征，通过RT-PCR、克隆和测序得到样品完整的HCRV S RNA序列，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得其N蛋白序列并进行分析，为HCRV的后续研究提供基础。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
2016年在云南省昆明市主要园林景区进行了调查，采集到八角金盘(Fatsia japonica)、葱莲(Zephyranthes candida)、酢浆草(Oxalis corniculata)、旱金莲(Tropaeolum majus)、蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和鸢尾(Iris tectorum)等疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品(图1)，主要表现为褪绿、坏死斑和皱缩等症状，将采集回来的样品用RT-PCR进行鉴定。
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图 1 疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品注：a) 葱莲；b) 喜林芋；c) 酢浆草；d) 八角金盘。Figure 1. Samples suspected infection with Tospovirus virusNote: a) Zephyranthes candida; b) Philodendron schott; c) Oxalis corniculata; d) Fatsia japonica.1.2 总RNA提取
采用去除多糖多酚的TransZol Plant (全式金生物技术有限公司，北京)试剂盒提取RNA，以RNA为模板，采用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (宝生物技术有限公司，大连)进行反转录合成cDNA。
1.3 RT-PCR扩增、克隆及测序
利用Primer Premier 6.0软件，以GenBank中公布的HCRV S RNA序列(序列号：JX833564.1)设计引物，S RNA扩增引物为：F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′。50 μL PCR反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，FastPfu 1 μL，Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，40个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反应产物用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的PCR产物进行纯化以及加A反应。将已纯化的PCR产物连接在pEASY-T1载体上，将连接产物导入T1感受态细胞中，经过菌液PCR鉴定出阳性重组子并送到公司进行测序。
1.4 生物信息学分析
通过ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得4个HCRV分离物的N蛋白序列，利用DNAMAN 8.0与分离自云南省蜘蛛兰上的HLS1-2 N蛋白(登录号：AFX74694)进行序列比对分析；利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的分离自云南、广东、广西和福建地区蜘蛛兰上的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白进行系统进化分析。
2. 结果与分析
2.1 RT-PCR结果
通过RT-PCR技术鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4份感染HCRV的样品并扩增出HCRV S RNA序列，电泳检测条带大小约为2 700 bp (图2)。
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图 2 HCRV S RNA扩增结果注：M. Marker；1. 酢浆草；2. 葱莲；3. 文殊兰；4. 喜林芋。Figure 2. Amplification of HCRV S RNANote: M. Marker; 1. O. corniculata; 2. Z. candida; 3. C. asiaticum; 4. P. schott.2.2 不同株系HCRV N蛋白序列比对分析
本研究获得的葱莲YN-ZCH、文殊兰YN-CA、喜林芋YN-PS和酢浆草YN-OC的N蛋白，通过DNAMAN 8.0与首个公布的HLS1-2 N蛋白进行序列比对，一致性达到99.34%。YN-ZCH存在6个突变位点，YN-CA存在5个突变位点，YN-PS存在4个突变位点，YN-OC存在6个突变位点(表1)。
表 1 氨基酸突变位点Table 1. Amino acid mutation sites病毒株系 virus strains 氨基酸位点 amino acid site 2 9 50 82 113 118 178 241 249 HCRV-HLS1-2 S A N A N Q I E V HCRV-YN-ZCH T V N V S Q V E A HCRV-YN-CA T V N V N Q V G V HCRV-YN-PS T V N V N Q V E V HCRV-YN-OC T V S V N R V E V 2.3 不同株系HCRV N蛋白系统进化分析
利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白构建系统发育树，建树方法选择邻接法(neighbor-joining，NJ)。结果显示：本研究获得的4个HCRV分离物的N蛋白与分离自云南省的HCRV N蛋白聚为1支，来自广东、广西和福建地区的聚为1支(图3)。
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图 3 HCRV N蛋白氨基酸序列系统进化树Figure 3. Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence3. 讨论
云南省丰富的植物资源和复杂的气候以及丰富的传播介体种类为Tospovirus病毒的发生和流行提供了条件，该属病毒在云南的发生呈逐年上升趋势[9]。自2013年首次在云南省发现HCRV至今，国内外对其研究较少，目前已知寄主包括蜘蛛兰、烟草、番茄、君子兰[10]和葱莲[11]等，仍有许多寄主尚未被发现。本研究鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4个感染HCRV样品，其中文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV寄主。研究结果表明：4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次公布的HLS1-2 N蛋白有较高的同源性，从系统发育分析可知不同株系的分离物聚类现象与寄主无明显关联，推测可能环境因子对病毒进化的影响强于寄主的影响。
4. 结论
本研究通过采集疑似感染番茄斑萎病毒属病毒的样本，应用症状学和分子生物学方法鉴定出了葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草 4 个感染 HCRV 样品，对 4个寄主植物 S RNA 序列中 N 蛋白进行序列比对和系统进化分析，结果表明 4 个HCRV 分离物 N 蛋白与 NCBI 公布的 HLS1-2 N 蛋白有较高的同源性，HCRV 病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。研究结果为 HCRV 的进化研究提供基础，也为进一步探究番茄斑萎病毒属病毒的扩散和进化策略提供参考。
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图 2 S片段扩增PCR结果
注：M. Marker；A1~A8为来自云南不同地区的8个烟草样品。
Figure 2. The results of S fragment amplification PCR
Note: M. Marker; A1-A8 were eight tobacco samples from different areas of Yunnan Province.
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图 3 根据TSWV NSs氨基酸序列构建的系统发育树
Figure 3. The phylogenentc tree based on amino acid sequences of TSWV NSs
表 1 TSWV NSs氨基酸序列登录号
Table 1 The accession numbers of amino acid sequences of TSWV NSs
GenBank 登录号
GenBank accession No.分离地
location寄主
hostGenBank 登录号
GenBank accession No.分离地
location寄主
hostHQ 402595.1 中国云南 Yunnan, China 烟草 tobacco AKM 21266.1 西班牙 Spain 番茄 tomato AEI 70835.1 中国云南 Yunnan, China 番茄 tomato AAU 95408.1 西班牙 Spain 番茄 tomato AEK 28761.1 中国云南 Yunnan, China 番茄 tomato AAU 95406.1 西班牙 Spain 番茄 tomato AIY 28456.1 中国云南 Yunnan, China 辣椒 pepper CBX 24121.1 西班牙 Spain 番茄 tomato AGM 53720.1 韩国 Korea 番茄 tomato CBX 24122.1 西班牙 Spain 番茄 tomato AEB 33894.1 韩国 Korea 番茄 tomato CCD 61121.1 西班牙 Spain 辣椒 pepper HM 581936.1 韩国 Korea 番茄 tomato CBX 24113.1 西班牙 Spain 辣椒 pepper AWI 66332.1 韩国 Korea 辣椒 pepper CBX 24120.1 西班牙 Spain 辣椒 pepper ATJ 03402.1 韩国 Korea 辣椒 pepper CBX 24108.1 西班牙 Spain 辣椒 pepper BAK 52046.1 韩国 Korea 辣椒 pepper APG 79525.1 美国 USA 辣椒 pepper FR 692821.1 阿尔及利亚 Algeria 辣椒 pepper APG 79475.1 美国 USA 辣椒 pepper AMH 38318.1 澳大利亚 Australia 辣椒 pepper APG 79497.1 美国 USA 番茄 tomato KY 250490.1 南非 South Africa 番茄 tomato APG 79487.1 美国 USA 番茄 tomato MH 367502.1 土耳其 Turkey 番茄 tomato CAD 11449.1 保加利亚 Bulgaria 烟草 tobacco CAD 11447.1 保加利亚 Bulgaria 烟草 tobacco CAD 11445.1 保加利亚 Bulgaria 烟草 tobacco CAD 11443.1 保加利亚 Bulgaria 烟草 tobacco 
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期刊类型引用(2)
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百度学术
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