侵染昆明园林植物的4个HCRV分离株核壳体蛋白氨基酸序列分析
Amino Acid Sequence Analysis of Four Isolates of Hippeastrum Chlorotic Ringspot Virus Nucleocapsid Protein in Several Garden Plants in Kunming
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朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)是泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒，2013年在中国云南被首次发现并报道[1]，本课题组首次报道了朱顶红褪绿环斑病毒的全基因组序列[2-3]。朱顶红褪绿环斑病毒能系统侵染一点红、番茄、莴苣、旱金莲和豇豆等经济作物，主要症状为同心环纹、叶片畸形、局部褪绿和坏死[4]，对农业生产造成了严重的威胁。HCRV为三分子基因组，分别是L RNA、M RNA和S RNA。L RNA仅有1个开放阅读框，正向编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；M RNA正向编码非结构蛋白(non-structural protein of M RNA，NSm)，互补链编码糖蛋白前体(glycoproteins，Gn/Gc)；S RNA正向编码非结构蛋白NSs (non-structural protein of S RNA，NSs)，互补链编码核壳体蛋白 (nucleocapsid protein，N)[5]，N蛋白序列保守程度较高[6]，因此通常被用于进行Tospovirus属病毒的分类检测和鉴定[7]，N蛋白也可能与病毒粒子装配有关[8]。本研究通过RT-PCR鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草感染HCRV的4份样品。为研究核壳体蛋白序列特征，通过RT-PCR、克隆和测序得到样品完整的HCRV S RNA序列，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得其N蛋白序列并进行分析，为HCRV的后续研究提供基础。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
2016年在云南省昆明市主要园林景区进行了调查，采集到八角金盘(Fatsia japonica)、葱莲(Zephyranthes candida)、酢浆草(Oxalis corniculata)、旱金莲(Tropaeolum majus)、蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和鸢尾(Iris tectorum)等疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品(图1)，主要表现为褪绿、坏死斑和皱缩等症状，将采集回来的样品用RT-PCR进行鉴定。
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图 1 疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品注：a) 葱莲；b) 喜林芋；c) 酢浆草；d) 八角金盘。Figure 1. Samples suspected infection with Tospovirus virusNote: a) Zephyranthes candida; b) Philodendron schott; c) Oxalis corniculata; d) Fatsia japonica.1.2 总RNA提取
采用去除多糖多酚的TransZol Plant (全式金生物技术有限公司，北京)试剂盒提取RNA，以RNA为模板，采用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (宝生物技术有限公司，大连)进行反转录合成cDNA。
1.3 RT-PCR扩增、克隆及测序
利用Primer Premier 6.0软件，以GenBank中公布的HCRV S RNA序列(序列号：JX833564.1)设计引物，S RNA扩增引物为：F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′。50 μL PCR反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，FastPfu 1 μL，Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，40个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反应产物用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的PCR产物进行纯化以及加A反应。将已纯化的PCR产物连接在pEASY-T1载体上，将连接产物导入T1感受态细胞中，经过菌液PCR鉴定出阳性重组子并送到公司进行测序。
1.4 生物信息学分析
通过ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得4个HCRV分离物的N蛋白序列，利用DNAMAN 8.0与分离自云南省蜘蛛兰上的HLS1-2 N蛋白(登录号：AFX74694)进行序列比对分析；利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的分离自云南、广东、广西和福建地区蜘蛛兰上的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白进行系统进化分析。
2. 结果与分析
2.1 RT-PCR结果
通过RT-PCR技术鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4份感染HCRV的样品并扩增出HCRV S RNA序列，电泳检测条带大小约为2 700 bp (图2)。
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图 2 HCRV S RNA扩增结果注：M. Marker；1. 酢浆草；2. 葱莲；3. 文殊兰；4. 喜林芋。Figure 2. Amplification of HCRV S RNANote: M. Marker; 1. O. corniculata; 2. Z. candida; 3. C. asiaticum; 4. P. schott.2.2 不同株系HCRV N蛋白序列比对分析
本研究获得的葱莲YN-ZCH、文殊兰YN-CA、喜林芋YN-PS和酢浆草YN-OC的N蛋白，通过DNAMAN 8.0与首个公布的HLS1-2 N蛋白进行序列比对，一致性达到99.34%。YN-ZCH存在6个突变位点，YN-CA存在5个突变位点，YN-PS存在4个突变位点，YN-OC存在6个突变位点(表1)。
表 1 氨基酸突变位点Table 1. Amino acid mutation sites病毒株系 virus strains 氨基酸位点 amino acid site 2 9 50 82 113 118 178 241 249 HCRV-HLS1-2 S A N A N Q I E V HCRV-YN-ZCH T V N V S Q V E A HCRV-YN-CA T V N V N Q V G V HCRV-YN-PS T V N V N Q V E V HCRV-YN-OC T V S V N R V E V 2.3 不同株系HCRV N蛋白系统进化分析
利用MEGA 6.06软件对NCBI数据库中已公布的HCRV的N蛋白以及本研究获得的4个寄主的N蛋白构建系统发育树，建树方法选择邻接法(neighbor-joining，NJ)。结果显示：本研究获得的4个HCRV分离物的N蛋白与分离自云南省的HCRV N蛋白聚为1支，来自广东、广西和福建地区的聚为1支(图3)。
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图 3 HCRV N蛋白氨基酸序列系统进化树Figure 3. Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence3. 讨论
云南省丰富的植物资源和复杂的气候以及丰富的传播介体种类为Tospovirus病毒的发生和流行提供了条件，该属病毒在云南的发生呈逐年上升趋势[9]。自2013年首次在云南省发现HCRV至今，国内外对其研究较少，目前已知寄主包括蜘蛛兰、烟草、番茄、君子兰[10]和葱莲[11]等，仍有许多寄主尚未被发现。本研究鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4个感染HCRV样品，其中文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV寄主。研究结果表明：4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次公布的HLS1-2 N蛋白有较高的同源性，从系统发育分析可知不同株系的分离物聚类现象与寄主无明显关联，推测可能环境因子对病毒进化的影响强于寄主的影响。
4. 结论
本研究通过采集疑似感染番茄斑萎病毒属病毒的样本，应用症状学和分子生物学方法鉴定出了葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草 4 个感染 HCRV 样品，对 4个寄主植物 S RNA 序列中 N 蛋白进行序列比对和系统进化分析，结果表明 4 个HCRV 分离物 N 蛋白与 NCBI 公布的 HLS1-2 N 蛋白有较高的同源性，HCRV 病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。研究结果为 HCRV 的进化研究提供基础，也为进一步探究番茄斑萎病毒属病毒的扩散和进化策略提供参考。
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图 1 疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品
注：a) 葱莲；b) 喜林芋；c) 酢浆草；d) 八角金盘。
Figure 1. Samples suspected infection with Tospovirus virus
Note: a) Zephyranthes candida; b) Philodendron schott; c) Oxalis corniculata; d) Fatsia japonica.
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图 2 HCRV S RNA扩增结果
注：M. Marker；1. 酢浆草；2. 葱莲；3. 文殊兰；4. 喜林芋。
Figure 2. Amplification of HCRV S RNA
Note: M. Marker; 1. O. corniculata; 2. Z. candida; 3. C. asiaticum; 4. P. schott.
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图 3 HCRV N蛋白氨基酸序列系统进化树
Figure 3. Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence
表 1 氨基酸突变位点
Table 1 Amino acid mutation sites
病毒株系 virus strains 氨基酸位点 amino acid site 2 9 50 82 113 118 178 241 249 HCRV-HLS1-2 S A N A N Q I E V HCRV-YN-ZCH T V N V S Q V E A HCRV-YN-CA T V N V N Q V G V HCRV-YN-PS T V N V N Q V E V HCRV-YN-OC T V S V N R V E V 
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期刊类型引用(2)
1. 赵正婷，盖晓彤，张俊蕾，夏振远，姜宁，刘雅婷. 朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP快速检测体系的建立. 中国烟草科学. 2023(03): 39-46 . 
百度学术
2. 许云玉，李浩，陈敏，贾志强，高雪，陈增敏，赵于丁，刘雅婷，李永忠. 病毒载体介导的基因沉默体系对朱顶红褪绿环斑病毒NSm基因的沉默效应. 植物保护学报. 2023(04): 923-931 . 百度学术
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