基于ITS高通量测序技术研究果寡糖对奶牛瘤胃真菌菌群的影响
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关键词:
- ITS高通量测序技术 /
- 奶牛 /
- 果寡糖 /
- 瘤胃真菌菌群
Effect of Fructooligosaccharide on the Rumen Fungi Flora of Dairy Cows by ITS High-throughput Sequencing Technology
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自从1975年ORPIN[1]首次证实山羊瘤胃中存在厌氧真菌后，国内外学者又陆续从其他草食动物的消化道和环境中广泛发现并分离出10多种厌氧真菌[2]。厌氧真菌在超显微结构和生物化学性质上与需氧真菌有严格的区分，根据菌丝体形成孢子囊的个数，可将厌氧真菌划分为多中心和单中心2个类型[3-4]。真菌通过产生不同种类的木质纤维素降解酶以及真菌菌丝对植物组织细胞壁的穿透作用，在瘤胃对纤维降解中发挥重要作用[5]。魏亚琴[6]通过研究牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养表明瘤胃壶菌属和甲烷菌共培养在不同程度上提高了真菌对秸秆的降解能力。而瘤胃厌氧真菌对纤维素的降解主要通过从孢子囊中释放出的游动孢子游动到易于集聚的植物组织部位，穿透牧草角质层屏障，降解无法被细菌和纤毛虫降解的木质素纤维物质[7-9]，还可以通过合成纤维素酶来降解纤维素[10]。果寡糖(fructooligosaccharides，FOS)是由1个葡萄糖基和2~5个果糖基以果糖基—果糖连接而成的一组低聚糖的总称[11]。有研究表明FOS具有改善畜禽生产性能、提高机体免疫力等生物学功能[12-13]。FOS作为益生元类饲料添加剂改善肠道组织形态[14]，调节动物肠道中菌群结构[15]，对脂质代谢以及矿物吸收有一定的调控作用[16]，广泛用于肉鸡[14-15]、鹌鹑[16]、羊[17]、猪[18]和奶牛[19]等动物生产上。本试验通过对泌乳期奶牛日粮添加果寡糖，研究果寡糖对奶牛瘤胃真菌菌群结构的影响，为生产实践中奶牛的饲养提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
果寡糖购自河南三化生物科技公司，纯度为99%。
1.2 试验动物与管理
本试验选用2×2交叉试验设计。选择体况良好，泌乳天数一致，日产奶量30 kg左右，体重(550±35) kg的4头经产(二胎)中国荷斯坦泌乳奶牛，随机分为2组，对照组和试验组。对照组饲喂基础日粮(表1)，试验组在基础日粮中添加果寡糖，添加量为60 g/(cow·d)。饲喂方式采用TMR，饮水自由。整个试验期分为2个阶段共21 d，其中预饲期14 d，正式采样期7 d。
表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1. Composition and nutrient levels of the basal diet (dry matter basis)原料
ingredients含量/% content 营养水平
nutrient levels含量/% content 苜蓿干草 alfalfa 21.53 粗蛋白质CP 17.35 羊草
Leymus chinensis3.14 产奶净能NEL/(MJ·kg−1) 7.23 玉米青贮 corn silage 27.65 中性洗涤纤维NDF 31.25 玉米 corn 24.47 酸性洗涤纤维ADF 22.63 豆粕 soybean meal 14.68 钙 Ca 0.84 麦麸 wheat 1.48 磷 P 0.40 全棉籽
whole cottonseed4.20 预混料 premix 0.91 磷酸氢钙 0.91 食盐 NaCl 0.80 氧化镁 MgO 0.23 合计 total 100.00 1.3 样品采集与处理
奶牛瘤胃液的采集方法：将软管从口腔导管送入瘤胃内，使用牛鼻夹固定牛头，牛咀嚼过程中瘤胃液顺导管自然流出，对流出的瘤胃液进行收集即可。采集瘤胃液时间为饲喂前(0 h)和饲喂后(2、6 和12 h)，每期连续采样3 d (16、17和18 d)。将采集的瘤胃液立即用4层纱布过滤，每天4个时间点所采集的瘤胃液样品经混匀后各取5 mL，置于离心管中，作为该样本的代表性样品。将收集的样本快速放入液氮中，转移到试验室，于−80 ℃冰箱冷冻保存，用于瘤胃真菌菌群结构的分析。
1.4 DNA样品提取与扩增
1.4.1 DNA提取
DNA采用试剂盒提取，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，提取步骤参照试剂盒中的说明书操作。
1.4.2 PCR扩增
从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增ITS rDNA的ITS2区。引物序列为：
F：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′；
R：5′-ATATGTAGGATGAAGAACGYAGYRAA-3′。
1.5 Hiseq测序
将PCR扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序(广州基迪奥公司)。
1.6 数据统计分析
数据采用Excel 2007进行初步处理，采用SAS 8.2统计软件进行数据处理分析。数据由平均值±标准误(mean±SE)表示。以P<0.05作为差异显著性判定标准。
2. 结果与分析
2.1 OTU丰度分析
为了更好地获得样品中物种的多样性信息，剔除低质量片段后，对片段进行OTU (Operating Taxonomic Unit)聚类，并利用Mothur (v.1.34.0)计算0.03距离下(97%的相似度)的OTU数量。根据2组所共有和特有OTUs绘制韦恩图(图1)。由图1可知：试验组(FT)的OTU总数为295，对照组(CK)的OTU总数为317，2组共有OTU数目为138。对照组瘤胃真菌菌群多样性大于试验组，但差异不显著(P>0.05)。
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图 1 对照组和试验组瘤胃中真菌OTUs韦恩图Figure 1. Venn graph of fungus OTUs in the rumen of the control group and the experimental group2.2 样品OTU多样性分析
基于OTU聚类分析结果，进行瘤胃菌群的Alpha多样性分析。Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括Chao1值、ACE值、Shannon以及Simpson指数等。Chao1、ACE值是通过不同的算法对样本进行OTU数目的估算预测，ACE、Chao1值越大表示样本的物种多样性越高。Shannon指数越大，Simpson指数越接近于0，则表示该样品中的物种越丰富。由表2可知：试验组的ACE趋于大于对照组(P<0.75)，试验组的Chao1值小于对照组，但差异不显著(P>0.05)。试验组和对照组的Simpson和Shannon指数相近。表明在日粮中添加果寡糖对奶牛瘤胃真菌菌群结构的多样性没有明显影响。
表 2 对照组和试验组瘤胃真菌菌群多样性指数Table 2. Rumen fungi diversity indexes of control group and test group指标 index 对照组(CK) control group 试验组(FT) experimental group SEM P值P-value 丰富度指数
richness indexACE 521.44 564.96 128.49 0.64 Chao1 407.67 386.58 83.93 0.75 多样性指数
diversity indexShannon 2.27 2.33 0.86 0.92 Simpson 0.26 0.23 0.24 0.87 覆盖率 coverage 0.99 0.99 0.006 0.57 2.3 奶牛瘤胃真菌菌群结构的变化
2.3.1 瘤胃真菌在门水平上的结构分析
门水平上，试验组与对照组奶牛瘤胃液共涉及子囊菌门(Ascomycota)、新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、未注释菌门(Fungi_NA) 5个菌门(表3)。由表3可知：子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是对照组的优势菌门，占总菌群比例的96%，而试验组的优势菌门是子囊菌门(Ascomycota)、新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，占到总菌群比例的99%以上。日粮中果寡糖的添加使奶牛瘤胃真菌中担子菌门(Basidiomycota)、新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)丰度升高。
表 3 试验组与对照组奶牛瘤胃真菌门水平的变化Table 3. Changes in rumen fungal phylum level of cows in the experimental group and the control group% 门类
phylum对照组
control group试验组experimental group P值
P-value差异倍数log2-fold 子囊菌门 Ascomycota 83.16 66.83 0.14 −0.31 新丽鞭毛菌门 Neocallimastigomycota 2.22 16.18 0.21 2.86 接合菌门 Zygomycota 0.42 0 0.28 −7.28 担子菌门 Basidiomycota 13.82 16.47 0.69 0.25 未注释菌门 Fungi_NA 0.36 0.50 0.67 0.43 2.3.2 瘤胃真菌在属水平上的结构分析
在属水平上，2组共涉及107个属，其中相对丰度在0.01%以上的有30个。2组中丰度较高的属有柄孢壳属(Zopfiella)、曲霉属(Aspergillus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、枝孢属(Cladosporium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、假丝酵母(Candida)。由表4可知：试验组假丝酵母属(Candida)和平革菌属(Phanerochaete)丰度极显著高于对照组(P<0.01)，试验组毛壳属(Chaetomidium)丰度显著增加(P<0.05)。表明日粮中果寡糖的添加显著增加了假丝酵母属(Candida)、平革菌属(Phanerochaete)和毛壳属(Chaetomidium)的丰度。
表 4 试验组与对照组奶牛瘤胃真菌属水平的变化Table 4. Changes of rumen fungi genus level in cows in the experimental group and the control group% 属类
genus对照组
control group试验组experimental group P值
P-value差异倍数log2-fold 柄孢壳属Zopfiella 20.76 0.19 0.523 −6.75 曲霉属Aspergillus 11.29 14.08 0.940 0.31 德巴利酵母属
Debaryomyces8.59 3.08 0.671 −1.47 酵母属Saccharomyces 5.81 6.71 0.936 0.20 枝孢属Cladosporium 4.80 19.24 0.734 2.00 青霉菌属Penicillium 1.42 0.84 0.884 −0.75 刺革菌属Hymenochaete 1.23 0 0.308 −26.87 未注释虫草科属
Cordycipitaceae_NA1.17 0.51 0.741 −1.17 侧齿霉属Engyodontium 0.81 0 0.078 −7.11 瘤胃壶菌属Piromyces 0.70 9.14 0.135 3.69 未注释新丽鞭毛菌属
Neocallimastigaceae_NA0.68 1.97 0.798 1.52 刺皮耳属Heterochaete 0.63 0 0.345 −25.92 新丽鞭菌属Neocallimastix 0.59 1.05 0.877 0.81 假丝酵母属Candida 0.003 5.00 0.001 4.23 平革菌属Phanerochaete 0 0.09 0.003 23.19 毛壳属Chaetomidium 0 0.01 0.037 20.01 3. 讨论
本试验是基于Hiseq2500 PE250高通量测序平台对8个样本的瘤胃液真菌区系的ITS2区进行测序，对奶牛瘤胃真菌菌群的多样性进行分析，从测序深度和覆盖度两个方面对测序结果进行评估。本试验8个样本的优质序列数总和为157 212条，平均每个样本19 52条，高于KUMAR等[20]对围生期奶牛瘤胃真菌测序深度(3 558条)；同时本试验的8个样本的真菌区系测序覆盖度均超过了98.2%，与张红涛[21]对荷斯坦后备牛瘤胃真菌区系测序覆盖度(98%)相当，因此，从测序深度和覆盖度两个角度来看，本试验取样充分合理并且测序结果得到了大量代表荷斯坦奶牛瘤胃液真菌的绝大多数物种，可以较真实地反映出瘤胃液真菌菌群的微生物组成情况。
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本研究表明：从奶牛瘤胃真菌门水平分析，子囊菌门、新丽鞭毛菌门在试验组和对照组中均为优势菌门，这与张红涛[21]以及LIGGENSTOFFER等[25]研究结果相一致。本试验在日粮中添加果寡糖使新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)丰度比对照组增加了628.28%。果寡糖可以被有益菌利用产生菌毒素和有机酸而不能被有害菌利用[26]，且大量学者研究表明：新丽鞭毛菌门是广泛存在于奶牛、羊等反刍动物瘤胃中真菌区系的优势菌门[25]，在对纤维和木质素的消化分解过程中起着重要的作用，其不仅通过假根对植物组织的细胞壁进行物理降解，也通过产生大量的碳水化合物活性酶(CAZymes)、纤维素体和细胞外蛋白酶，降解木质纤维素，并穿透菌丝，破坏植物细胞壁的超微结构[27-28]。果寡糖能够被新丽鞭毛菌门利用代谢合成自身所需营养物质，促使其丰度增加，同时产生相应的分泌物，促进对粗饲料纤维的降解，提高日粮的利用效率。试验结果表明：奶牛瘤胃液真菌菌群中柄孢壳属、曲霉属、德巴利酵母属、酵母菌属是对照组的优势菌属，而枝孢属、曲霉属、瘤胃壶菌属、酵母属、假丝酵母属是试验组的优势菌属。试验组和对照组的优势菌属发生变化的原因可能是部分真菌可以吸收利用果寡糖，促进自身的增殖，而部分真菌不会因为果寡糖的添加促进生长，甚至因此生长受到抑制。假丝酵母属由检出菌变为优势菌属且增加极显著。李亚丹等[29]研究发现：饲喂混合饲料的瘤胃真菌中含有假丝酵母属，而在单一饲喂芒草厌氧的牛瘤胃真菌中未检出。瘤胃壶菌属的相对丰度相比较对照组增加了1 205.71%，但差异不显著。SOLOMON等[28]研究表明：从食草动物中分离出来的厌氧肠道真菌所产生大量的生物降解酶协同降解未经处理的生物质，瘤胃壶菌属所产生的木聚糖酶活性是工业上广泛应用的木霉和曲霉的3倍以上。同样有研究表明：瘤胃壶菌属和新丽鞭毛菌属对植物秸秆有较强降解作用，主要因为瘤胃壶菌属的丝状假根可以穿透植物细胞壁，使植物纤维类多糖的降解阻力降低，让瘤胃微生物更有效的降解纤维素、半纤维素和果胶等[30]。WANG等[31]结合转录组学和蛋白组学研究发现新丽鞭毛菌属分泌木聚糖酶，对纤维的降解发挥重要作用。而在本试验条件下，日粮中添加果寡糖对瘤胃新丽鞭毛菌属和瘤胃壹菌属丰度并无显著影响，但较对照组菌增加，尤其瘤胃壹菌属增加明显，表明果寡糖的添加提高了瘤胃真菌对纤维的降解能力。
4. 结论
(1)日粮中果寡糖的添加对奶牛瘤胃真菌菌群的多样性并未产生明显的影响，优势菌比例发生变化，能够小幅度改变真菌菌群某些菌的相对丰度，却不能对瘤胃液真菌菌群的基本组成产生重大影响。
(2)添加果寡糖能够提高瘤胃中瘤胃壶菌属、平革菌属等纤维降解菌的相对丰度，增强了瘤胃真菌菌群对纤维的降解能力。
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图 1 对照组和试验组瘤胃中真菌OTUs韦恩图
Figure 1. Venn graph of fungus OTUs in the rumen of the control group and the experimental group
表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (dry matter basis)
原料
ingredients含量/% content 营养水平
nutrient levels含量/% content 苜蓿干草 alfalfa 21.53 粗蛋白质CP 17.35 羊草
Leymus chinensis3.14 产奶净能NEL/(MJ·kg−1) 7.23 玉米青贮 corn silage 27.65 中性洗涤纤维NDF 31.25 玉米 corn 24.47 酸性洗涤纤维ADF 22.63 豆粕 soybean meal 14.68 钙 Ca 0.84 麦麸 wheat 1.48 磷 P 0.40 全棉籽
whole cottonseed4.20 预混料 premix 0.91 磷酸氢钙 0.91 食盐 NaCl 0.80 氧化镁 MgO 0.23 合计 total 100.00 
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表 2 对照组和试验组瘤胃真菌菌群多样性指数
Table 2 Rumen fungi diversity indexes of control group and test group
指标 index 对照组(CK) control group 试验组(FT) experimental group SEM P值P-value 丰富度指数
richness indexACE 521.44 564.96 128.49 0.64 Chao1 407.67 386.58 83.93 0.75 多样性指数
diversity indexShannon 2.27 2.33 0.86 0.92 Simpson 0.26 0.23 0.24 0.87 覆盖率 coverage 0.99 0.99 0.006 0.57
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表 3 试验组与对照组奶牛瘤胃真菌门水平的变化
Table 3 Changes in rumen fungal phylum level of cows in the experimental group and the control group
% 门类
phylum对照组
control group试验组experimental group P值
P-value差异倍数log2-fold 子囊菌门 Ascomycota 83.16 66.83 0.14 −0.31 新丽鞭毛菌门 Neocallimastigomycota 2.22 16.18 0.21 2.86 接合菌门 Zygomycota 0.42 0 0.28 −7.28 担子菌门 Basidiomycota 13.82 16.47 0.69 0.25 未注释菌门 Fungi_NA 0.36 0.50 0.67 0.43
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表 4 试验组与对照组奶牛瘤胃真菌属水平的变化
Table 4 Changes of rumen fungi genus level in cows in the experimental group and the control group
% 属类
genus对照组
control group试验组experimental group P值
P-value差异倍数log2-fold 柄孢壳属Zopfiella 20.76 0.19 0.523 −6.75 曲霉属Aspergillus 11.29 14.08 0.940 0.31 德巴利酵母属
Debaryomyces8.59 3.08 0.671 −1.47 酵母属Saccharomyces 5.81 6.71 0.936 0.20 枝孢属Cladosporium 4.80 19.24 0.734 2.00 青霉菌属Penicillium 1.42 0.84 0.884 −0.75 刺革菌属Hymenochaete 1.23 0 0.308 −26.87 未注释虫草科属
Cordycipitaceae_NA1.17 0.51 0.741 −1.17 侧齿霉属Engyodontium 0.81 0 0.078 −7.11 瘤胃壶菌属Piromyces 0.70 9.14 0.135 3.69 未注释新丽鞭毛菌属
Neocallimastigaceae_NA0.68 1.97 0.798 1.52 刺皮耳属Heterochaete 0.63 0 0.345 −25.92 新丽鞭菌属Neocallimastix 0.59 1.05 0.877 0.81 假丝酵母属Candida 0.003 5.00 0.001 4.23 平革菌属Phanerochaete 0 0.09 0.003 23.19 毛壳属Chaetomidium 0 0.01 0.037 20.01
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