盐胁迫对TaERECTA转基因小麦种子萌发和幼苗生理特性的影响
Effect of Salt Stress on the Seeds Germination and Seedlings Physiological Traits of TaERECTA Transgenic Wheat
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Keywords:
- Triticum aestivum L. /
- TaERECTA /
- salt tolerance /
- seeds and seedlings /
- antioxidant enzyme
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土壤盐渍化严重影响作物的生长发育，制约作物产量的提升。全球一半的灌溉土地都受到不同程度的土壤盐碱化危害[1]。为充分利用盐碱化土地种植小麦，培育和筛选耐盐品种是一条重要途径[2-3]。近年来，各国小麦育种、栽培和生理学家们对小麦耐盐性鉴定进行了多方面研究，并取得了很大的进展[1]。植物在长期进化中，为应对自然逆境形成了许多抵抗逆境的生理和生化适应机制，类受体激酶就是植物生长发育和逆境防御反应的重要调节因子之一[4]。植物类受体激酶能够感受外界环境胁迫信号，通过跨膜区将信号传递到细胞内，利用胞内激酶域激活下游应答分子活性，使植物产生抵抗逆境的能力。CHEN等[5]发现受体类激酶OsSIK2参与调控水稻的非生物胁迫反应，可以提高水稻盐胁迫和干旱胁迫耐力；ZHOU等[4]发现水稻类受体胞质激酶STRK1过表达株系的耐盐性明显提高，并显著降低盐胁迫造成的产量损失。可见，类受体激酶与调控植物盐胁迫有密切关系。
ERECTA蛋白属于类受体激酶(RLKs)，参与调控植物细胞分裂和组织发育，提高植物对生物胁迫(病害等)和非生物(高温等)胁迫的抗性[6-7]。成功分离出的小麦TaERECTA基因对植物激素、Mg2+离子和干旱胁迫强烈响应[8-9]，其超量表达可增强高温胁迫下小麦幼苗的抗氧化酶活性[10]。为鉴定TaERECTA基因对盐胁迫下小麦种子和幼苗的影响，本研究以T4代TaERECTA转基因小麦为材料，测定盐胁迫下转基因小麦芽期种子萌发和苗期幼苗生理特性，初步明确TaERECTA调控小麦耐盐性的生理机制，为培育小麦耐盐新品种提供优良的候选基因，也为深入研究TaERECTA介导调控小麦耐盐性的分子机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
TaERECTA转基因小麦株系由英国洛桑研究所的小麦遗传转化平台完成，受体是半冬性小麦品种Cadenza(野生型WT)。2015—2018年，本实验室对TaERECTA转基因小麦T0~T3代进行了连续4年的PCR阳性检测和过表达鉴定，并结合田间表型筛选，获得稳定遗传的转基因株系26个。2018年，选取5个超表达水平较高的转基因株系(L10、L21、L22、L24和L30)和野生型(WT)株系，在安徽科技学院利用光照培养箱(种子在培养皿进行发芽试验)和人工气候温室(幼苗温室内盆栽)隔离种植。
1.2 试验方法
1.2.1 转基因材料超表达分析
RNA提取步骤参见总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP432)，后反转录为cDNA (TaKaRa，6110A)。采用实时定量(qRT-PCR)检测转基因小麦TaERECTA超表达水平，仪器为ABI ViiA7实时荧光定量PCR仪。目标基因TaERECTA的引物为TaERECTAQ-F：CAACGAGTACGTGAGCCTGCG和TaERECTAQ-R：GACTGACTACCTGCTTGCTGCATC；内参基因TaActin的引物为TaActin-F：TTGCTGACCGTATGAGCAAG和TaActin-R：ACCCTCCAATCCAGACACTG。实施定量操作步骤和数据分析方法参见ZHENG等[9]的方法。
1.2.2 转基因小麦芽期耐盐性鉴定
试验按照农业部行业标准NY/PZT 001—2002《小麦耐盐性鉴定评价技术规范》进行，有6个小麦株系(5个转基因株系和1个WT株系)，每个株系6次重复，分为2组(处理组和对照组，各3次重复)，处理组浇灌10 mL 1.5% NaCl溶液，对照组浇灌10 mL去离子水。挑选的小麦种子要求籽粒饱满、无破损，先用70%酒精清洗3 min，无菌水清洗3次，再用0.5% Nacl溶液清洗15 min，无菌水清洗3次。每个重复20粒种子，均匀置于铺有2层滤纸的培养皿中(直径为7 cm)。培养皿放置光照培养箱[温度22~25 ℃，白天光照16 h，光强250 µmol/(s·m2)，夜间暗培养8 h]培养，3 d后开始调查发芽种子数，以后每天调查1次，到第10天为止，计算发芽势、发芽率、发芽指数和盐害系数[11-12]。
发芽势= (第4天内发芽种子数/供试种子数)×100；
发芽率= (第7天发芽种子数/供试种子数)×100%；
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发芽期相对盐害指数=(对照组发芽率－处理组发芽率)/对照组发芽率×100%。
1.2.3 高盐胁迫对转基因小麦幼苗生长及生理指标的影响
(1) 转基因小麦苗期高盐胁迫处理
小麦种子消毒后，放置育苗盘中，在光照培养箱内发芽培养。7 d后，选择发芽一致的种子移栽花盆(营养土预先消毒处理，每盆营养土称重，保持花盆重量一致)。共6个株系(5个转基因和1个WT株系)，每个株系种6盆，分为2组(处理组和对照组，各3盆)，每盆20苗。温室培养[温度22~25 ℃，白天光照16 h，夜间暗培养8 h，光强525 μmol/(s·m2)]，适时添加等量去离子水。待小麦生长到3叶2个分蘖时(Z13)[13]，处理组每盆浇灌100 mL 1.5% NaCl溶液[8]，对照组每盆浇灌100 mL去离子水，每间隔2 d浇灌1次。处理30 d后，取样测定幼苗枯萎株数、抗氧化酶活性和丙二醛含量。
(2) 小麦枯萎数、抗氧化酶活性和丙二醛含量测定
超氧化物酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[14]，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法[15]，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收比色法[16]，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法[17]。枯萎数=(发生幼苗枯萎的株数/每盆成活小麦株数)×100%。
1.2.4 盐胁迫后转基因株系聚类分析
根据不同小麦株系的TaERECTA基因表达量，芽期盐胁迫后小麦种子的发芽势、发芽率和相对盐害指数，以及苗期盐胁迫后小麦幼苗的SOD、POD、CAT活性和MDA含量，取全部调查个体各指标的平均值，利用SPSS 18.0统计软件的“组间连接”系统聚类方法，以欧式距离的平方为度量标准，开展转基因小麦株系的聚类分析。
1.3 数据处理
实时定量检测、数据分析参考ZHENG等[9]的方法，采用Microsoft Excel 2010进行数据处理和图表绘制，采用SPSS 18.0统计软件进行差异显著性分析和耐盐性的聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 转基因小麦超表达水平分析
由图1可知：TaERECTA基因在5个转基因株系(L10、L21、L22、L24和L30)中的平均表达量为野生型(WT)株系的34倍(P<0.001)，其中，L21和L24株系表达量最高，分别为WT株系44倍和39倍。说明TaERECTA超表达重组载体转入小麦后，在后代材料中TaERECTA基因可以显著稳定提高转录水平，这与前几代TaERECTA转基因材料的鉴定结果一致。
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图 1 转基因小麦TaERECTA基因超表达水平分析注：“***”表示转基因株系与野生型(WT)株系之间有极显著差异(P<0.001)。Figure 1. Overexpression identification of TaERECTA gene in transgenic wheat linesNote: “***” means significant difference between transgenic lines and wild type plants at 0.001 level.2.2 转基因小麦芽期耐盐性分析
由表1可知：与去离子水浇灌相比，浇灌盐水后，小麦种子的发芽率和发芽势均极显著降低(P<0.01)，说明高盐处理对种子的毒害作用很大。
表 1 不同处理小麦种子的发芽率和发芽势(mean±SE, n=3)Table 1. Germination rate and germination energy of wheat seeds under different treatments处理
treatments发芽率/%
germination rate发芽势
germination energy去离子水
deionized water48±6 32±5 盐水 saline solution 38±6** 16±5** 注：“**”表示差异极显著(P<0.01)。
Note:“**” means the highly significant difference (P<0.01).由表2可知：盐胁迫下，与WT株系相比，转基因株系具有较高的发芽势、发芽率和发芽指数，除L21株系之外，其他转基因株系的发芽势与WT株系间差异均达到显著水平(P<0.05)，而发芽率和发芽指数在所有转基因株系中都显著高于Wt株系(P<0.05)。
表 2 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦的发芽势、发芽率、发芽指数和相对盐害指数(mean±SE, n=3)Table 2. Germination energy, germination rate, germination index and relative salt stress index of TaERECTA transgenic wheat under salt stress小麦株系 wheat lines 发芽势 germination energy 发芽率/% germination rate 发芽指数 germination index 相对盐害指数/%
relative salt stress indexWT 5±0.6 c 15±5.7 d 0.43±0.1 c 42.0±10.6 a L10 40±3.5 a 60±13.8 a 1.71±0.1 a 7.7±0.4 f L21 5±0.5 c 35±7.1 c 1.00±0.2 b 36.4±4.2 b L22 15±1.4 b 45±10.6 b 1.29±0.2 a 25.0±7.5 c L24 15±4.8 b 35±3.5 c 1.00±0.1 b 22.2±7.1 d L30 15±2.2 b 35±10.6 c 1.00±0.1 b 12.5±1.4 e 注：同列数据后小写字母不同表示在0.05水平上差异显著(P<0.05)；下同。
Note:The lower-case letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level; the same as below.进一步分析发现：转基因株系的相对盐害指数在7.7%~36.4%之间，参照吴纪中等[18]的小麦耐盐性分级标准，转基因小麦属于高耐盐和耐盐品种，而野生型小麦Cadenza属于中耐盐品种。说明TaERECTA转基因小麦材料对盐胁迫具有抗性，在一定盐胁迫下，TaERECTA基因过表达可以增加小麦芽期耐盐性，特别是对小麦发芽率和发芽指数具有显著影响。
2.3 高盐胁迫对转基因小麦幼苗生长和丙二醛含量的影响
持续浇灌盐水30 d后，盐水处理组小麦幼苗部分枯萎，去离子水浇灌组小麦幼苗生长正常。与转基因植株相比，WT株系植株生长明显受到抑制，叶片萎蔫较多，叶尖发黄，植株相对矮小，盐胁迫表型明显；而转基因植株生长基本正常，植株挺拔健壮，叶色深绿。植株枯萎数分析表明(表3)：WT株系平均枯萎株数达到20%，TaERECTA转基因幼苗平均枯萎株数仅为9.4%，其中，L22和L24株系幼苗无枯萎现象，与WT株系间差异显著(P<0.05)，说明TaERECTA转基因小麦植株具有抵抗盐胁迫的能力。丙二醛(MDA)含量分析表明：盐胁迫下，转基因株系L10、L21和L24丙二醛含量显著低于WT株系(P<0.05)，L22和L30株系与WT株系间差异不显著。说明在盐胁迫下，小麦植株发生脂膜过氧化作用，但转基因株系遭受逆境伤害的程度较小。
表 3 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦枯萎数和幼苗丙二醛含量(mean±SE, n=3)Table 3. Wilting plant numbers and MDA content of TaERECTA transgenic wheat under salt stress小麦株系
wheat lines植株枯萎数/%
plant wilting numbers丙二醛含量/(μmol·g−1)
content of MDAWT 20.00±0.0 a 0.6± 0.11 a L10 10.53±10.0 a 0.4± 0.01 b L21 21.05±10.0 a 0.4± 0.03 b L22 0.00±0.0 b 0.6± 0.02 a L24 0.00±0.0 b 0.4± 0.09 b L30 11.76±23.3 a 0.6± 0.29 ab 2.4 高盐胁迫对苗期转基因小麦过氧化酶活性的影响
由表4可知：高盐胁迫后，5个转基因小麦株系幼苗的抗氧化酶活性明显高于WT株系。其中，SOD活性在5个转基因株系中均显著高于WT株系(P<0.05)，5个转基因株系平均SOD活性达到551.6 U/(g·min)，WT株系为364.9 U/(g·min)；POD活性在转基因株系L10和L30中较高，与WT株系达到显著性差异(P<0.05)，其他3个株系与WT株系间差异不显著；CAT活性在L21株系中与WT株系间没有显著差异，其他4个转基因株系CAT活性均显著高于WT株系(P<0.05)。植物内SOD、POD和CAT活性反映植物体受到逆境胁迫后，自身应对外界伤害能力大小的一种调节机制。TaERECTA基因超表达后，可调控小麦组织细胞内维持较高SOD活性水平，而不同转基因株系的POD和CAT活性水平有差异。
表 4 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦的SOD、POD和CAT活性(mean±SE, n=3)Table 4. SOD, POD and CAT activity of TaERECTA transgenic wheat under salt stress小麦株系
wheat lines超氧化物歧化酶/
(U·g−1·min−1) SOD过氧化物酶/
(U·g−1·min−1) POD过氧化氢酶/
(U·g−1·min−1) CATWT 364.9± 50.2 b 3.2± 0.4 c 2.0± 0.7 c L10 572.1± 9.3 a 13.8± 2.0 a 2.8± 0.7 b L21 608.7± 7.2 a 6.7± 0.5 bc 2.5± 0.6 c L22 503.0± 52.6 a 5.0± 0.5 bc 5.6± 0.3 a L24 558.4± 4.7 a 3.6± 0.3 c 3.8± 0.6 b L30 515.7± 20.6 a 8.8± 0.1 b 5.0± 0.9 a 2.5 盐胁迫后转基因株系聚类分析
盐胁迫后，根据TaERECTA基因表达量和相关生理指标聚类分析(图2)，表明6个小麦株系可明显被分为转基因株系和WT株系，说明转基因株系和WT株系的抗盐能力有显著差异，结合盐胁迫后6个小麦株系生理特性，进一步证实转基因材料具有较高的抗盐能力。以欧氏距离2作为临界值，转基因株系可被分为两类：L22、L30株系和L10、L21和L24株系。分析表明：L10、L21和L24株系SOD活性较高，丙二醛的含量相对较少，推测耐盐性较好。其中，L10株系相对盐害指数较小，综合抗盐能力较强，可以作为后续转基因材料抗盐性研究中的重点对象。同一分组中各转基因株系抗盐生理指标表现不一致，可能是由于TaERECTA基因在小麦基因组中整合位点有差异，产生调控效应有区别。
3. 讨论
本研究表明：芽期盐胁迫下，TaERECTA转基因小麦种子平均发芽势和发芽率显著高于野生型(WT)株系，而盐害系数显著低于对照株系，说明TaERECTA基因超表达后，小麦芽期抗盐能力增强，且不同株系的抗盐能力存在差异显著；苗期盐胁迫下，与WT株系相比，转基因小麦幼苗平均枯萎数较低，且转基因小麦幼苗SOD、POD和CAT活性均高于WT株系，说明TaERECTA转基因小麦苗期的抗盐能力可能较强，推测是由于TaERECTA基因参与调控小麦幼苗组织内抗氧化酶活性，在小麦遇到盐胁迫时，组织内的SOD等活性迅速升高，缓解外界逆境带来的伤害。丙二醛是植物器官遭受逆境时脂膜过氧化作用的产物之一，转基因小麦株系平均丙二醛含量较低，进一步证实TaERECTA基因具有参与调控小麦盐胁迫下组织细胞抗氧化酶活性的功能。
活性氧(reaction oxygen species, ROS)是植物新陈代谢的主要产物，在植物遭受外界逆境时，组织细胞内大量积累活性氧，导致脂膜过氧化，诱导细胞程序性死亡[19]。盐胁迫下，5个转基因株系幼苗的SOD活性均显著高于WT株系，说明TaERECTA基因对于调控组织细胞内SOD活性有关键作用。SOD可以通过歧化O2−离子来调节组织细胞内O2−离子和H2O2的浓度，H2O2又在CAT和POD的作用下分解为H2O和O2，消除逆境胁迫产生活性氧对细胞的伤害[20]。因此，SOD担任清除活性氧的关键步骤，TaERECTA基因参与调控SOD活性将加速下游超氧化物分解，形成SOD协同POD和CAT起保护作用的生理机制。另据报道，类受体激酶ERECTA家族影响二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的羧化速率和光电子转移能力，调节植物光合作用[21]。光能被植物叶片捕获后，主要有3种传递通路：光化学电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散。盐胁迫后，植物的光合还原力(NADPH)利用速率降低，光合电子传递能力超过消耗能力，导致多余的电子通过梅勒(Mehler)反应将O2还原为O2−，产生活性氧，诱导膜脂过氧化，促进SOD大量产生[22]。因此，TaERECTA调控小麦光合电子传递和耐盐性必然存在联系，具体机理还需进一步研究。
本研究共鉴定5个转基因株系，其中芽期除了L21株系发芽率与WT株系差异不显著，其他4个株系芽期耐盐性均较好。苗期鉴定结果表明：5个转基因株系耐盐生理指标明显优于WT株系，但5个株系抗盐指标差异较大，表现不一致，说明转基因小麦芽期的耐盐能力稳定，远远强于苗期，这与前人研究结果[1]一致。根据TaERECTA基因表达量和抗盐相关生理指标聚类，转基因株系可以被分为2组，分析发现：同一组中各转基因株系抗盐生理指标表现趋势不一致，与基因表达水平关系不密切，其中，L10株系相对盐害指数较小，综合抗盐能力较强。说明TaERECTA基因转入小麦基因组后，可能在小麦基因组中整合位点不同，产生调控效应有区别。后期耐盐性分析中，除了参照TaERECTA基因分子水平鉴定结果，还需要利用逆境胁迫下转基因株系的表型数据进行综合分析，为耐盐性小麦育种工作提供理论参考。
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图 1 转基因小麦TaERECTA基因超表达水平分析
注：“***”表示转基因株系与野生型(WT)株系之间有极显著差异(P<0.001)。
Figure 1. Overexpression identification of TaERECTA gene in transgenic wheat lines
Note: “***” means significant difference between transgenic lines and wild type plants at 0.001 level.
表 1 不同处理小麦种子的发芽率和发芽势(mean±SE, n=3)
Table 1 Germination rate and germination energy of wheat seeds under different treatments
处理
treatments发芽率/%
germination rate发芽势
germination energy去离子水
deionized water48±6 32±5 盐水 saline solution 38±6** 16±5** 注：“**”表示差异极显著(P<0.01)。
Note:“**” means the highly significant difference (P<0.01).
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表 2 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦的发芽势、发芽率、发芽指数和相对盐害指数(mean±SE, n=3)
Table 2 Germination energy, germination rate, germination index and relative salt stress index of TaERECTA transgenic wheat under salt stress
小麦株系 wheat lines 发芽势 germination energy 发芽率/% germination rate 发芽指数 germination index 相对盐害指数/%
relative salt stress indexWT 5±0.6 c 15±5.7 d 0.43±0.1 c 42.0±10.6 a L10 40±3.5 a 60±13.8 a 1.71±0.1 a 7.7±0.4 f L21 5±0.5 c 35±7.1 c 1.00±0.2 b 36.4±4.2 b L22 15±1.4 b 45±10.6 b 1.29±0.2 a 25.0±7.5 c L24 15±4.8 b 35±3.5 c 1.00±0.1 b 22.2±7.1 d L30 15±2.2 b 35±10.6 c 1.00±0.1 b 12.5±1.4 e 注：同列数据后小写字母不同表示在0.05水平上差异显著(P<0.05)；下同。
Note:The lower-case letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level; the same as below.
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表 3 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦枯萎数和幼苗丙二醛含量(mean±SE, n=3)
Table 3 Wilting plant numbers and MDA content of TaERECTA transgenic wheat under salt stress
小麦株系
wheat lines植株枯萎数/%
plant wilting numbers丙二醛含量/(μmol·g−1)
content of MDAWT 20.00±0.0 a 0.6± 0.11 a L10 10.53±10.0 a 0.4± 0.01 b L21 21.05±10.0 a 0.4± 0.03 b L22 0.00±0.0 b 0.6± 0.02 a L24 0.00±0.0 b 0.4± 0.09 b L30 11.76±23.3 a 0.6± 0.29 ab
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表 4 盐胁迫下TaERECTA转基因小麦的SOD、POD和CAT活性(mean±SE, n=3)
Table 4 SOD, POD and CAT activity of TaERECTA transgenic wheat under salt stress
小麦株系
wheat lines超氧化物歧化酶/
(U·g−1·min−1) SOD过氧化物酶/
(U·g−1·min−1) POD过氧化氢酶/
(U·g−1·min−1) CATWT 364.9± 50.2 b 3.2± 0.4 c 2.0± 0.7 c L10 572.1± 9.3 a 13.8± 2.0 a 2.8± 0.7 b L21 608.7± 7.2 a 6.7± 0.5 bc 2.5± 0.6 c L22 503.0± 52.6 a 5.0± 0.5 bc 5.6± 0.3 a L24 558.4± 4.7 a 3.6± 0.3 c 3.8± 0.6 b L30 515.7± 20.6 a 8.8± 0.1 b 5.0± 0.9 a
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百度学术
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