施加外源IBA对南川大茶树扦插生根和茶树生长素应答因子(CsARFs) mRNA表达的影响
Effect of Applying Indole-3-butyric Acid on the Rooting of Camellia sinensis Cuttings and the mRNA Expression of Auxin Response Factor (CsARFs)
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Keywords:
- IBA /
- oxidative enzymes /
- stem cutting /
- CsARFs /
- Nanchuan tea (Camellia sinensis)
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大部分农作物病害由真菌侵染引起且所致损失较大，目前植物病害的防治仍然以化学手段为主。酰胺类杀菌剂是一类常见的杀菌剂，广泛应用于作物病害防治，国内外对酰胺类杀菌剂的合成及生物活性已有大量的研究[1-3]。杂环化合物因其具有选择性好、活性高、毒性低等特点，是近年来国内外农用杀菌剂研发的热点，许多含杂环结构的化合物已作为商品化杀菌剂，被广泛用于作物病害的防治[4-6]。啶酰菌胺(boscalid)是一种由巴斯夫公司开发的高效烟酰胺类内吸性杀菌剂，对由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的真菌性病害具有较好的防治效果。啶酰菌胺是一种琥珀酸辅酶Q还原酶抑制剂，而琥珀酸辅酶Q还原酶是真菌细胞TCA循环中一种重要的酶，其功能是催化琥珀酸成为延胡索酸，一旦被抑制，将会阻碍真菌细胞正常的生理过程[7]。啶酰菌胺对菌丝生长和孢子萌发都有很强的抑制效果[8]，常用于灰霉病、白粉病、菌核病、褐腐病和根腐病等真菌性病害的防治[9-10]，具有良好的抑菌活性和广泛的应用前景，但其生产过程中所需的原料、催化剂等价格昂贵，涉及的反应条件苛刻，工业生产难度较大[10-13]。迄今为止，国内尚无完善的啶酰菌胺生产工艺。
国内对啶酰菌胺类似物的合成及活性研究主要集中于其杀菌活性，但也有对其除草等生物活性的研究，如：霍静倩等[14]合成了数个啶酰菌胺同系物并测定了其除草活性，但只有在高浓度(1 000 mg/L)下才有效果。啶酰菌胺类似物普遍具有一定的抗真菌活性。吴志兵等[15]合成了5个N-(1,4取代吡唑基)-烟酰胺类化合物，但其抑菌活性较低；于康平等[16]合成了数个啶酰菌胺及其同系物，初步杀菌活性结果表明：部分化合物在50 mg/L浓度下对供试病原菌表现出良好的活性；杜士杰等[17]在啶酰菌胺结构的基础上，设计合成了数个2-氯烟酰胺类化合物，部分化合物与啶酰菌胺抑菌效果接近。
含氟农药是近年来新农药开发的又一热点，也是新型杀菌剂研发的重要方向[18]。常见的含氟农药以含芳香族氟取代物和芳香族三氟甲基化合物为主。由于氟原子具有的特殊理化性质，可影响化合物的脂溶性、稳定性、渗透性等，使得含氟农药可能具有更好的生物学活性[19]。本试验以啶酰菌胺为母体，根据活性亚结构拼接原理，将烟酰胺和含氟的苯胺结合，通过用含氟或者三氟甲基的苯胺替代联苯结构与烟酸或2-氯烟酸反应，合成了数个含氟的啶酰菌胺类似物，并测定了这些化合物对5种常见植物病原真菌的抑菌活性，以期在化合物结构简化和降低生产成本的同时，能够筛选出具有较好抑菌活性的烟酰胺类杀菌活性成分。
1. 材料与方法
1.1 试剂
本研究所用试剂和溶剂均为市售分析纯，试剂未经进一步纯化直接使用，溶剂中三乙胺和二氯甲烷经氢化钙除水处理。
1.2 供试菌种
本研究使用的供试菌种：尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)由云南农业大学植物保护学院何月秋教授提供；稻梨孢菌(Pyricularia oryzae) 由云南农业大学植物保护学院李成云教授提供；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)由云南省农业科学院农业环境资源研究所杨勤忠研究员提供；茄链格孢菌 (Alternaria solani)为云南农业大学云南省植物病理重点实验室保藏菌种。
1.3 试验方法
1.3.1 合成路线
目标化合物的合成路线如图1所示。
1.3.2 中间体及目标化合物的合成
中间体2的合成：称取2.2 mmol的 2-氯烟酸1(或烟酸)加入到10 mL的单口瓶中，加入3 mL的氯化亚砜，加热至79 ℃回流4 h，减压蒸馏除去溶剂后得白色固体2，所得化合物2直接用于下一步反应。
目标化合物3的合成：0 ℃下，将化合物2溶解于4 mL的无水二氯甲烷中，缓慢滴加入0.6 mL三乙胺，并于冰浴下搅拌2 min，将2 mmol的苯胺加入到反应瓶中，升至室温反应2 h。将反应液倒入10 mL的冰水中淬灭反应，用二氯甲烷萃取(10 mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用石油醚:乙酸乙酯 (10:1，体积比) 柱层析纯化得到目标化合物3。
1.3.3 化合物结构鉴定
对合成的化合物3a~3g进行结构鉴定，1H NMR、13C NMR数据由BRUKER ASCEND/AVANCE III 500JEOL-500 MHz核磁共振仪(TMS为内标，CDCl3为溶剂)测定；高分辨质谱由美国Thermo Fisher Scientific公司的TSQ Endura仪测定。
目标化合物(3a~3g)的理化数据如下：N-2′-氟苯基-2-氯烟酰胺(3a)：白色固体，产率86%，M.p. 138.6~139.7 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 8.56 (s, 1H, NH), 8.54 (d, J = 7.4 Hz, 1H, pyridyl-H), 8.45 (t, J = 7.9 Hz, 1H, pyridyl-H), 8.25 (d, J = 7.5 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.42 (m, 1H, Ar-H), 7.20 (m, 1H, Ar-H), 7.16 (d, J = 7.4 Hz, 2H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 162.8, 151.5, 147.1, 140.31, 130.8, 125.3, 125.3, 124.8, 122.9, 122.0, 112.1, 114.9. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C12H9ClFN2O: 251.038 7; found: 251.038 3.
N-3′-氟苯基-2-氯烟酰胺(3b)：白色固体，产率90%，M.p. 85.4~86.5 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 8.52 (s, 1H, pyridyl-H), 8.32 (s, 1H, NH), 8.18 (m, 1H, pyridyl-H), 7.63 (d, J = 10.4 Hz, pyridyl-H), 7.41 (t, J = 6.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.34 (m, 1H, Ar-H), 7.27 (s, 1H, Ar-H), 6.91 (t, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 164.0, 162.9, 151.5, 146.9, 140.09, 130.4, 130.3, 123.0, 115.5, 112.1, 111.9, 107.9, 107.8. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C12H9ClFN2O: 251.038 7; found: 251.038 4.
N-4′-氟苯基-2-氯烟酰胺(3c)：淡黄色固体，产率85%，M.p. 103.0~104.2 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 8.51 (s, 1H, pyridyl-H), 8.23 (s, 1H, NH), 8.19 (d, J = 7.4 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.61(m, 2H, Ar-H), 7.39 (m, 1H, pyridyl-H), 7.09 (t, J = 7.9 Hz, 2H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 162.6, 160.9, 151.4, 146.9, 140.1, 140.0, 133.1, 131.2, 122.9, 122.3, 122.2, 116.1, 115.9. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C12H9ClFN2O: 251.038 7; found: 251.038 4.
N-2′-(三氟甲基)苯基-2-氯烟酰胺(3d)：淡黄色固体，产率74%，M.p. 130.8~132.6 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 8.34 (d, J = 4.5 Hz, 2H, pyridyl-H), 7.80 (s, 1H, NH), 7.78 (t, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.68 (t, J = 8.5 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.65 (t, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.55 (t, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.24 (t, J = 7.3 Hz, 1H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 166.9, 150.9, 147.1, 136.7, 133.6, 131.7, 130.9, 130.3, 127.9, 121.9. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C13H9ClF3N2O: 301.035 6; found: 301.035 6.
N-3′-(三氟甲基)苯基-2-氯烟酰胺(3e)：白色固体，产率75%，M.p. 117.7~119.4 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 8.53 (d, J = 4.4 Hz, 1H, pyridyl-H), 8.38 (s, 1H, NH), 8.21 (d, J = 7.6 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.97 (s, 1H, Ar-H), 7.84 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.52 (t, J = 7.9 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.46 (d, J = 7.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.42 (m, 1H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 162.7, 151.7, 146.9, 140.2, 137.7, 130.8, 129.8, 123.3, 123.1, 121.9, 117.0. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C13H9ClF3N2O: 301.035 6; found: 301.035 5.
N-2′-(三氟甲基)苯基-烟酰胺(3f)：淡黄色固体，产率86%，M.p. 86.2~87.9 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 9.12 (s, 1H, pyridyl-H), 8.83 (d, 1H, J = 4.6 Hz, pyridyl-H), 8.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H, pyridyl-H), 8.20 (d, J = 7.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.19 (s, 1H, NH), 7.69 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.64 (t, J = 7.8 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.48 (t, 1H, Ar-H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 163.7, 153.0, 148.1, 135.1, 134.9, 133.1, 130.0, 126.3, 126.3, 125.1, 124.6, 123.8. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C13H10F3N2O: 267.074 5; found: 267.073 8.
N-3′-(三氟甲基)苯基-烟酰胺(3g)：白色固体，产率82%，M.p. 148.2~149.6 ℃, 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 9.11 (s, 1H, pyridyl-H), 8.79 (s, 1H, pyridyl-H), 8.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H, pyridyl-H), 8.12 (s, 1H, NH), 7.96 (s, 1H, Ar-H), 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.52 (t, J = 7.4 Hz, 1H, pyridyl-H), 7.46 (m, 2H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δ: 164.0, 152.8, 147.8, 147.6, 135.4, 134.1, 130.3, 129.8, 123.8, 123.5, 121.6, 117.2. HRMS (ESI): m/z [M+H]+ calcd. C13H10F3N2O: 267.074 5; found: 267.073 5.
1.3.4 抑菌活性测定
采用菌丝生长速率法进行化合物对植物病原菌的抑菌活性测定。将上述7种待测化合物用一定量的丙酮溶解，加入与丙酮等量的吐温-80摇匀后用灭菌蒸馏水配制成含系列浓度的化合物乳浊液，待PDA培养基冷却至45 ℃时，按化合物乳浊液体积与培养基体积比为1:9的量，将化合物乳浊液加至PDA培养基中，充分混匀后移至直径为9 cm的培养皿中制成PDA含药平板，空白对照培养基加入与处理培养基等量的丙酮和吐温-80。
将经预培养的供试病原菌菌落边沿用内径5 mm的打孔器制取菌饼，分别接种到含化合物和对照PDA培养基平板上，每处理重复3次，避光培养。其中，稻梨孢菌(P. oryzae)、灰葡萄孢菌(B. cinerea)、茄链格孢菌(A. sonali)和尖镰孢菌(F. oxysporum)的培养温度为26 ℃；立枯丝核菌(R. solani)的培养温度为28 ℃。待空白对照处理的菌落生长至平板的3/4时，以十字交叉法测量菌落直径，取其平均值计算不同浓度化合物对病原菌菌丝生长的抑制率。根据化合物的剂量对数值和抑制率概率值进行线性回归分析，评价化合物的抑菌活性。
1.3.5 数据分析
用SPSS 22数据处理软件对各处理的数据，结合Student-Newman-Keuls检验进行单向ANOVA分析，评价处理间的差异显著性和重复间的离散度。
2. 结果与分析
2.1 合成
以氯烟酸(烟酸)为起始原料，与氯化亚砜反应得到烟酰氯2，化合物2在碱性条件下(三乙胺)与苯胺反应得到氯酰胺3。
2.2 抑菌活性
初步的抑菌活性测定结果表明：本研究合成的烟酰胺类化合物对尖镰孢菌 (F. oxysporum)等5种重要植物病原菌的菌丝生长，均有不同程度的抑制效果，其中对R. solani和B. cinerea的抑菌活性较高。化合物3a、3b和3e对R. solani和B. cinere表现出良好的抑菌活性(图2) 。化合物3b和3e在50 μg/mL下对R. solani的菌丝生长抑制率大于90%，其效果接近商品化的杀菌剂啶酰菌胺。化合物3b在50 μg/mL质量浓度下对B. cinerea的菌丝生长抑菌率为72.29%，是合成的7个化合物中对B. cinerea抑菌活性最高的一个化合物，但其活性与啶酰菌胺相比，仍有一定差距。
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图 2 化合物3a、3b、3e在50 μg/mL质量浓度下对2种病原真菌菌丝生长的抑制效果Figure 2. Antifungal effect of compound 3a, 3b and 3e against R. solani and B. cinerea at 50 μg/mL通过对比本研究合成的化合物和啶酰菌胺的抑菌活性可以发现：在保留啶酰菌胺的活性基团3-吡啶甲酸的前提下，引入含氟的芳环可获得与啶酰菌胺抑菌活性相当的化合物。总体来看(表1)，R1取代基为氯的化合物(3d和3e)高于无取代的化合物(3f和3g)，含氟取代基的化合物的抑菌活性3b>3a>3c，含三氟甲基取代基的化合物的抑菌活性3e>3d，3g>3f。经初步构效关系分析可知：2-氯烟酰结构是烟酰胺类化合物抑菌的活性基团，酰胺部分为邻位取代基的化合物活性最高。
表 1 化合物在50 μg/mL质量浓度下对5种植物病原真菌的抑菌活性Table 1. In vitro antifungal activity of compounds against pathogenic fungi at 50 μg/mL化合物compounds R1 R2 抑菌率/% inhibition rate R. solani F. oxysporum B. cinerea A. solani P. oryzae 3a −Cl −2-F 84.88±1.22 b −2.75±6.87 bc 68.39±0.28 c 7.13±5.36 bc 6.42±0.48 e 3b −Cl −3-F 93.98±2.46 a 18.18±13.41 ab 72.29±0.59 b 15.35±6.69 ab 13.32±0.19 d 3c −Cl −4-F 70.64±3.08 c 13.55±9.19 abc 48.85±1.43 f 5.23±3.27 bc 5.94±1.29 e 3d −Cl −2-CF3 25.71±3.42 e 35.11±0.93 a 31.24±2.86 g 19.84±4.08 a 39.71±0.06 b 3e −Cl −3-CF3 90.13±6.07 ab 12.12±5.74 abc 55.50±1.80 d 16.08±3.24 ab 15.69±1.12 cd 3f −H −2-CF3 10.88±5.48 f −7.18±4.11 c 11.48±1.73 h −2.06±4.41 c 2.49±0.76 f 3g −H −3-CF3 55.14±0.21 d 19.11±4.39 ab 33.78±1.16 g 25.29±2.70 a 60.29±2.52 a 啶酰菌胺boscalid 98.58±0.55 a 34.09±7.17 a 89.88±0.42 a 23.71±0.99 a 17.12±0.28 c 注：同列中不字母相同表示在P = 0.05水平显著差异。
Note: Different letters within a column mean significant difference at 0.05 levels.表 2 化合物对2种植物病原菌的毒力回归方程和EC50值Table 2. Regression equation and EC50 value of compounds化合物compounds 靶标菌pathogens 回归方程regression equation EC50/(mg·L−1) 95%的置信/(mg·L−1) 3a R. solani y=1.747x−1.924 12.63 10.32~15.00 B. cinerea y=2.875x−4.548 38.20 34.12~42.99 3b R. solani y=2.977x−3.822 19.21 7.94~30.04 B. cinerea y=2.831x−4.447 37.21 27.68~51.85 3e R. solani y=2.593x−2.971 13.99 12.24~15.82 B. cinerea y=1.964x−3.011 34.12 20.66~66.13 啶酰菌胺boscalid R. solani y=1.925x−1.668 7.36 1.45~12.56 B. cinerea y=2.597x−3.200 17.07 11.12~24.59 对在50 μg/mL质量浓度下活性较好的化合物3a、3b和3e进行了不同质量浓度梯度的抑菌活性测定。表2表明：上述3个化合物对R. solani和B. cinerea的菌丝生长均有较好抑制活性，其效果与对照药剂啶酰菌胺的活性接近，其中化合物3a和3e对R. solani的EC50值分别为12.63 μg/mL和13.99 μg/mL，化合物3b对R. solani的EC50值高于化合物3a，但其在高质量浓度时对R. solani的抑制效果则高于化合物3a。总体来看，3个化合物对R. solani的抑菌活性均高于对B. cinerea的抑菌活性。
3. 讨论
本研究合成了7个含氟的烟酰胺类化合物，通过抑菌活性测定，筛选出了抑菌活性较强的化合物3a，3b和3e，这3个化合物的共同特点是对立枯丝核菌(R. solani)和灰霉病菌(B. cinerea)均具有较强的抑菌活性。研究合成的具有2-氯烟酰结构的化合物，其抑菌活性明显高于其他化合物，而化合物苯胺部分的取代基不同，对抑菌活性影响差异不显著(P>0.05)，故初步推测2-氯烟酰结构是烟酰胺类化合物抑菌活性所必需的基团。由于合成的几个含氟的烟酰胺类化合物是啶酰菌胺的类似物，具有与啶酰菌胺相同的药效团，因而可能与啶酰菌胺的抑菌作用靶标相同，是一种潜在的琥珀酸辅酶Q还原酶抑制剂，从而与啶酰菌胺表现出相似的抑菌作用。
近年来，随着啶酰菌胺在中国专利保护期的结束，啶酰菌胺类似物的合成及其活性研究是国内新农药开发的一个热点。这些啶酰菌胺类似物的合成研究均是在保留啶酰菌胺活性基团的基础上，对其进行结构修饰，其合成路线较为复杂[15-18]。与这些研究不同，本研究在保留啶酰菌胺吡啶甲酸结构的基础上，通过与含氟苯胺反应，引入含氟芳环合成了数个含氟的烟酰胺类化合物。本研究合成的化合物结构简单，涉及的合成步骤反应温和，产物得率较高且易于纯化，适合工业化。
通过烟酰胺类化合物的合成及其抑菌活性研究，研究获得了3a，3b和3e这3个结构简单且抑菌活性较高的化合物，其对R. solani和B. cinerea的菌丝生长具有较好的抑制效果，有潜在的应用价值。在进一步的研究中，可考虑在现已合成的化合物的结构基础上，在苯环不同位置同时引入氟或者三氟甲基，合成多取代的含氟的烟酰胺类化合物，以期能获取具有更好抑菌活性的化合物。
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图 1 IBA处理对南川大茶树根系POD、PPO和IAAO活性(鲜质量)的影响
注：不同上标字母表示差异显著(P<0.05)。
Figure 1. The effect of IBA treatments on the POD, PPO and IAAO activity (fresh weight) in the roots of C. sinensis
Note: Different superscript letters mean significant difference (P<0.05).
表 1 CsARFs qRT-PCR引物表
Table 1 qRT-PCR primer sequences of CsARFs
基因gene 引物序列 (5′→3′) primer sequences qRTARF2-1 F：TGGCATGGTTCGTAAGATCTTC
R：CTGAAGGAGATGAGAGATTCTTCqRTARF2-2 F：ACTATTGAAACCGATCAAAGGTC
R：GAGAGCAATCCCCTGCTTATGqRTARF3-1 F：CCGCTCAAGTTTCATCTGCATA
R：ACAGCATAGAGGTCGCTTCCTqRTARF3-2 F：CACTGAAGGTGCTCAAGCTTC
R：CGTGTACCATGGAAGTTAGGAqRTARF8 F：GCCCATGGGAGGCATTTGTA
R：TCACTCCCACTGGTATTCATCqRTARF9 F：ACTAATTGGTAACCCTGAAGGC
R：TACATTGGAAGAAGATAGCCAGqRTARF11 F：GAATTCAGCCACTTAGGTAGTAC
R：AGTGGAGGAGACCAAATGCCA
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表 2 IBA处理对南川大茶树插穗生根指标的影响
Table 2 The effect of IBA treatments on the rooting indexes of C. sinensis cuttings
ρ (IBA)/(mg·L−1) 生根数
the number of rooting最长根长/cm
the longest root length平均根长/cm
average root length生根率/%
rooting rate愈伤诱导率/%
callus induction rate0 2.76±0.65 b 4.48±0.98 b 3.02±0.77 b 81.07±0.88 c 73.52±2.61 b 20 3.87±0.57 b 5.92±1.01 a 3.96±0.84 b 87.68±0.92 b 80.69±3.03 a 40 4.65±0.66 a 6.22±0.85 a 4.89±0.92 a 93.94±0.72 b 91.71±2.96 a 80 6.88±0.64 a 7.82±0.98 a 5.66±0.59 a 96.89±1.02 a 93.65±3.18 a 160 6.11±0.53 a 6.92±1.01 a 5.12±0.61 a 92.59±0.66 b 87.34±2.17 a 320 2.02±0.26 c 3.02±0.47 c 2.01±0.22 c 76.15±0.76 d 68.45±1.98 c 注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in the same columns mean significant difference (P<0.05).
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表 3 80mg/L IBA处理对南川大茶树根中CsARFs基因mRNA表达量的影响
Table 3 The effect of 80mg/L IBA treatment on the mRNA expression of CsARFs in the roots of C. sinensis
扦插时间/d
time after cuttingρ (IBA)/
(mg·L−1)mRNA表达量 mRNA expression CsARF 2-1 CsARF 2-2 CsARF 3-1 CsARF 3-2 CsARF 8 CsARF 9 CsARF 11 30 80 3.22±0.22 a 2.79±0.18 a 2.22±0.14 a 2.02±0.08 a 3.31±0.17 a 2.58±0.14 a 2.42±0.15 a 0 1.01±0.09 b 1.02±0.08 b 0.99±0.07 b 1.01±0.70 b 1.01±0.10 b 0.98±0.07 b 0.99±0.08 b 60 80 2.62±0.16 a 2.21±0.11 a 1.82±0.09 a 1.67±0.05 a 2.91±0.08 a 2.19±0.12 a 2.03±0.11 a 0 1.11±0.11 b 1.16±0.09 b 1.14±0.08 b 1.21±0.12 b 1.08±0.06 b 1.21±0.13 b 1.30±0.14 b 90 80 2.11±0.11 a 1.92±0.07 a 1.62±0.12 a 1.42±0.06 a 2.47±0.12 a 2.12±0.14 a 1.78±0.12 a 0 1.21±0.14 b 1.18±0.12 b 1.32±0.16 b 1.40±0.17 a 1.21±0.12 b 1.22±0.14 b 1.28±0.11 b 120 80 1.57±0.09 a 1.22±0.11 b 1.21±0.08 b 1.23±0.12 b 2.03±0.16 a 1.89±0.18 a 1.38±0.11 a 0 1.32±0.21 b 1.41±0.22 a 1.39±0.17 a 1.45±0.23 a 1.32±0.18 b 1.37±0.20 b 1.38±0.18 a 注：同一时间段同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。
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