ABTS法研究高压脉冲电场对普洱熟茶抗氧化活性的影响
Study on Effects of High Voltage Pulsed Electric Field on the Activity of Antioxidant of Pu'er Ripe Tea by ABTS Assays
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随着现代自由基生物医学的发展，自由基与心脏病、老年痴呆等多种疾病的关系越来越受到关注，探寻高效低毒的自由基清除剂——天然抗氧化剂成为生物化学和医药学的研究热点[1]。现代农业的一个重要内容也是寻找和利用农产品的新的生物活性物质，其中，抗氧化活性的研究至关重要[2]。普洱茶属于黑茶，产于云南省西双版纳、思茅和临沧等地，因自古在普洱集散而得名[3-4]。普洱熟茶以晒青毛茶为原料经后发酵处理精制而成，含有包括茶多糖、茶多酚、咖啡因、儿茶素和茶色素等多种生物活性成分。普洱熟茶具有防治冠心病、降压减脂、抗衰老、抗疲劳、利尿和解酒等保健功效[5-8]，其抗氧化作用被认为是茶叶保健抗癌最重要的机理。
高压脉冲电场(high voltage pulsed electric field, HPEF)技术具有处理时间短、能耗低、无污染、产热少、能最大限度保持物料的品质特征等诸多优势，被普遍应用于农产品及食品加工行业。殷涌光等[9]研究表明：HPEF技术远优于传统食品加热的处理方法，因为它在很大程度上减少了食品感官和物理特性的有害变化；冯叙桥等[10]研究表明：HPEF处理食品可最好地保持食品原有的色泽和风味；PLAZA等[11]研究表明：条件为35 kV/cm、750 μs的HPEF可提高橙汁中类胡萝卜素和黄酮类物质；王艳芳等[12]研究表明：采用HPEF技术处理牛乳，其风味物质损坏不明显，并且产生较少的与蒸煮味相关的含硫化合物。目前，国内外学者利用高压脉冲电场在食品保鲜和杀菌[13-14]、天然产物的提取[15-17]、酒类陈化[18]、辅助提取[19-20]和食品解冻[21]等领域取得了一定的成果。本研究利用高压脉冲电场对普洱熟茶进行处理，提取茶样中的茶多糖与茶多酚；以ABTS自由基清除率为指标研究分析HPEF对普洱茶茶多糖与茶多酚的抗氧化活性的影响；利用Matlab对茶多糖与茶多酚氧化活性进行逐步回归分析，建立其抗氧化活性与HPEF电压、频率之间的数学模型，绘制三维关系图，找到最佳的HPEF处理参数。
1. 材料与方法
1.1 高压脉冲电场装置及作用机理
HPEF处理装置包括高压脉冲电源和处理装置两个部分，设备的核心部分为高压脉冲电源。本研究采用大连鼎通科技发展有限公司研发的DMC-200型高压脉冲电源。220 V交流电经过调压器和升压变压器产生交流高电压，通过整流电路对其主电容进行充电，并通过限流电阻对放电电容充电，从而产生直流高电压。当高压开关在触发信号控制下导通，则放电电容两端的高压通过介质迅速放电，形成高压脉冲。其主要性能参数为：输入电压AC (220±10%) V，输出电压0~60 kV，输出脉冲占空比0~70%，输出脉冲频率80~2 000 Hz，瞬间输出功率10~1 000 W。
高压脉冲电场作用机理：在HPEF作用下，细胞膜上会出现小孔，导致细胞膜正常的选择性透过屏障出现部分或完全被破坏，当外加电场强度达到一定值，则加在细胞膜上的诱导膜电位也达到了临界值，即临界膜电位，又叫细胞膜的跨膜电位。此时，细胞膜上便开始出现微孔[22]。
1.2 试验方法
1.2.1 高压脉冲电场处理普洱茶茶样
以产于临沧市的2011年三级普洱熟茶为原料，利用DMC-200型高压脉冲电源提供高压脉冲电场。试验采用控制变量依次更改影响高压脉冲电场的3个因素：电压、频率、时间，设置作用时间为55 min，频率为80、99、121、139和162 Hz，电压为12~22 kV，共11个水平(表1)。
表 1 HPEF电压、频率的设置Table 1. HPEF voltage and frequency setting组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 1 12 80 20 20 99 39 17 139 2 13 80 21 21 99 40 18 139 3 14 80 22 22 99 41 19 139 4 15 80 23 12 121 42 20 139 5 16 80 24 13 121 43 21 139 6 17 80 25 14 121 44 22 139 7 18 80 25 15 121 45 12 162 8 19 80 27 16 121 46 13 162 9 20 80 28 17 121 47 14 162 10 21 80 29 18 121 48 15 162 11 22 80 30 19 121 49 16 162 12 12 99 31 20 121 50 17 162 13 13 99 32 21 121 51 18 162 14 14 99 33 22 121 52 19 162 15 15 99 34 12 139 53 20 162 16 16 99 35 13 139 54 21 162 17 17 99 36 14 139 55 22 162 18 18 99 37 15 139 19 19 99 38 16 139 1.2.2 茶多糖与茶多酚的提取
茶多糖的提取：将茶样放入圆底烧瓶，加沸水后水浴3 h得到茶汤，利用旋转蒸发仪除去其中大量水分，加入Sevage溶液(三氯甲烷∶正丁醇体积比为4∶1的混合溶液)，震荡20~30 min，萃取上层液体，再向其中加入等体积无水乙醇，静置24 h后过滤、干燥即可得到茶多糖粗提物。
茶多酚的提取：将茶样放入回流装置，加入沸水后回流40 min得到茶汤，加入乙酸乙酯溶液，震荡后静置1.5 h，萃取上层液体，放入蒸馏装置去除乙酸乙酯，干燥后即可得到茶多酚粗提物。
1.2.3 茶多糖与茶多酚ABTS自由基清除率的测定
参照郑善元等[23]的方法，测定清除ABTS自由基的能力。首先分别配制7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的高硫酸钾溶液，然后将二者按1∶1混合，室温下避光过夜制得ABTS自由基工作液。使用时用无水乙醇将工作液稀释40~50倍，使其吸光值A734=0.7±0.02。然后分别取质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0和1.5 mg/mL的待测试样各0.2 mL，加入1.8 mL 稀释后的ABTS自由基工作液，混合后避光放置30 min，最后在波长734 nm处测定混合物吸光值A1；用等体积蒸馏水替代工作溶液，同法操作，测定吸光值A2；用同浓度的甲醇溶液替代待测试样，同法操作，测定吸光值A0。每个试样重复3次，取平均值。ABTS自由基清除率的计算公式为
$ {\text{清除率}} = \left[ 1 - ({A_1} - {A_2})/{A_0} \right] \times 100\text{%}{\text{。}} $
1.3 数据分析
利用Matlab分别对经HPEF处理后茶多糖和茶多酚对ABTS自由基的清除率进行逐步回归分析，使用二元多次方程对其清除能力(Y)与HPEF的电压(X1)、频率(X2)的关系进行多元非线性拟合，建立方程，得到最优拟合方程。
2. 结果与分析
2.1 HPEF对茶多糖清除ABTS的影响
逐步回归分析得出茶多糖对ABTS自由基清除率(Y)与HPEF电压(X1)、频率(X2)的最优拟合方程：
$ \begin{split} Y = & -7.384 + 0.851\,\,4{X_1} + 0.150 \,\,67{X_2} - 0.015\, 902{X_1}{X_2} - \\ & 0.022\,\, 889X_1^2 - 0.000\,\, 594 \,\,96X_2^2 + 0.000\,\, 425\,\, 6X_1^2{X_2} + \\ & 6.300\, \,8{{\rm e}^{ - 5}}{X_1}X_2^2 - 1.688{{\rm e}^{ - 6}}X_1^2X_2^2 {\text{。}} \end{split} $
最优回归模型其P值为3.86e−8(小于0.001)，此模型显著，且模型中截距及各系数的P值均<0.05，则可用该模型对经HPEF处理后茶样中茶多糖对ABTS自由基的清除能力进行预测分析。
根据图1可知：在本试验所设定的电压范围内(12~22 kV)，当电压小于16 kV时，茶多糖对ABTS自由基的清除率随着频率的增大呈现比较明显的先增加、再降低的趋势；当电压大于16 kV时，清除率受电压和频率的影响较小，维持在较低的数值。当频率一定时，清除率随着电压的增大先呈现明显降低趋势，直到电压大于16 kV以后趋于平缓。影响茶多糖对ABTS自由基的清除率最主要的HPEF参数是电压，且当电压为12 kV、频率约为120 Hz时，茶多糖对ABTS自由基的清除作用最强。
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图 1 茶多糖对ABTS自由基的清除率与电压、频率的三维关系图Figure 1. Three-dimensional relationship between scavenging rate of tea polysaccharide to ABTS radical, voltage and frequency2.2 HPEF对茶多酚清除ABTS的影响
逐步回归分析得出茶多酚对ABTS自由基的清除率(Y)与HPEF电压(X1)、频率(X2)的最优拟合方程：
$\begin{split} Y = &535.22 - 3.376\,\,3{X_1} - 11.624{X_2} + 0.109\,\,46X_1^2 + \\ & 0.101\,\,78X_2^2 - 0.000\,\,287X_2^3{\text{。}} \\ \end{split} $
最优回归模型其P值为7e−9(小于0.001)，此模型显著，且模型中截距及各系数的P值均<0.05，则可用该模型对经HPEF处理后茶样中茶多糖对ABTS自由基的清除能力进行预测分析。
根据图2可知：在本试验所设定的电压范围内(12~22 kV)，当电压一定时，茶多酚对ABTS自由基的清除率随着频率的增大呈现先降低、再增加、再降低的趋势。当频率一定时，清除率随着电压的增大先降低、再增加，但是变化幅度不大。影响茶多酚对ABTS清除能力最主要的HPEF参数是频率，且当频率约为140 Hz时，茶多酚对ABTS自由基的清除作用最强。
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图 2 茶多酚对ABTS自由基的清除率与电压、频率的三维关系图Figure 2. Three-dimensional relationship diagram of scavenging rate of tea polyphenols to ABTS radical, voltage and frequency3. 讨论
茶多糖与茶多酚是普洱茶中重要的活性成分，其抗氧化作用在被医疗和保健领域[24-26]广泛关注的同时，也是评价普洱茶品质的重要标准之一[27-28]。高压脉冲电场非热处理技术能明显提高普洱茶水浸出物含量[29]，促进普洱茶醇类香气的合成[30]，降低普洱茶总灰分含量[31]，并能对普洱茶中微生物进行选择灭活[32]。本研究以ABTS自由基清除率为指标测定高压脉冲电场对普洱茶中茶多糖和茶多酚抗氧化活性的影响，并利用Matlab进行逐步回归分析，建立最优回归模型，显著性检验概率P<0.01，即模型显著，因此可以利用回归模型来预测分析茶多糖与茶多酚的氧化活性与高压脉冲电场电压、频率之间的关系。结果表明：茶多糖与茶多酚的抗氧化活性随着高压脉冲电场条件的变化而变化，适合条件的脉冲电场能提高其抗氧化活性。本研究为提高普洱熟茶的抗氧化活性提供了一种安全、周期短的物理方法，为普洱茶天然抗氧化剂的提取和开发提供了新的思路，对提高普洱茶经济与药用价值有一定的借鉴意义。但本研究只探讨了茶多糖和茶多酚的体外抗氧化活性，后期可以开展高压脉冲电场对普洱茶体内抗氧化活性的研究，验证结果，并分析高压脉冲电场对茶多酚、茶多糖化学结构的影响，从分子层面探索高压脉冲电场的作用机理，更好地研究高压脉冲电场对普洱茶抗氧化活性的影响。
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图 1 茶多糖对ABTS自由基的清除率与电压、频率的三维关系图
Figure 1. Three-dimensional relationship between scavenging rate of tea polysaccharide to ABTS radical, voltage and frequency
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图 2 茶多酚对ABTS自由基的清除率与电压、频率的三维关系图
Figure 2. Three-dimensional relationship diagram of scavenging rate of tea polyphenols to ABTS radical, voltage and frequency
表 1 HPEF电压、频率的设置
Table 1 HPEF voltage and frequency setting
组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 组别 No. 电压/kV voltage 频率/Hz frequency 1 12 80 20 20 99 39 17 139 2 13 80 21 21 99 40 18 139 3 14 80 22 22 99 41 19 139 4 15 80 23 12 121 42 20 139 5 16 80 24 13 121 43 21 139 6 17 80 25 14 121 44 22 139 7 18 80 25 15 121 45 12 162 8 19 80 27 16 121 46 13 162 9 20 80 28 17 121 47 14 162 10 21 80 29 18 121 48 15 162 11 22 80 30 19 121 49 16 162 12 12 99 31 20 121 50 17 162 13 13 99 32 21 121 51 18 162 14 14 99 33 22 121 52 19 162 15 15 99 34 12 139 53 20 162 16 16 99 35 13 139 54 21 162 17 17 99 36 14 139 55 22 162 18 18 99 37 15 139 19 19 99 38 16 139 
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