通脉颗粒药渣对杜寒杂交母羊屠宰性能、器官指数及瘤胃发酵参数的影响
Effects of Tongmai Granule Residue on Slaughter Performance, Organ Index and Rumen Fermentation Parameters of Doper × Short-tail Han Ewes
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Keywords:
- sheep /
- Tongmai granule residues /
- slaughter performance /
- organ index /
- rumen fermentation
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STRA8基因(stimulated by retinoic acid gene 8)是生殖细胞有丝分裂转变为减数分裂前的特异性表达基因[1-3]，它在精子发生过程中的减数分裂前期起重要作用[4-5]。STRA8基因的表达受视黄酸(retinoic acid, RA)诱导因素的影响[6]。RA对于脊椎动物的生殖是必需的[1-2, 6]，它对睾丸的正常结构和功能起维护作用[4]。RA含量缺乏时，会导致精子发生停止和细精管退化[1, 3, 6]，因此它对精子发生的过程和细精管的正常功能非常重要；若RA活性较低，则其无法发挥作用，使STRA8基因无法表达，导致雄性生殖细胞一直停滞在有丝分裂阶段而无法进入减数分裂前期，更无法形成生殖细胞，从而影响精子发生过程[7]。STRA8在减数分裂过程中行使转录因子功能[4]，是减数分裂起始的调节蛋白，参与雌性胚胎期和雄性出生后生殖细胞的减数分裂起始过程[8-11]，其表达是雄性和雌性生殖腺及正常精子发生过程的重要条件，直接关系到RA是否有效[3, 7, 10]，对生殖细胞中的RA的转导起重要作用[2, 7, 12]。
版纳微型猪近交系(Banna Mini-pig Inbred Line，BMI)是基于云南省优良地方猪种——滇南小耳猪培育成功的世界上第一个猪近交系，因其具有很多其他猪种不具有的重要特征，且基因高度纯合、遗传背景清楚，生理学、解剖学和疾病发生机理等方面与人类极为相似，可以作为良好的人类异种移植的器官供体，对其深入研究具有重要的科研价值和应用前景[13-17]。本研究克隆了BMI STRA8基因，通过测序等方法确定了STRA8基因的核苷酸序列，然后分析了该基因的核酸序列特征；利用生物信息学和比较基因组学对STRA8蛋白质进行了功能分析；通过分析多种组织的mRNA表达谱确定其组织表达水平，进而明确其发挥功能的重要组织，为今后深入研究STRA8基因的功能提供了参考。
1. 材料与方法
1.1 试验动物
版纳微型猪近交系第29世代的成年公猪，屠宰取样，液氮速冻保存。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成
利用RNA提取试剂抽提各组织总RNA，用分光光度计测定纯度、浓度，选择合格的RNA反转录为第1链cDNA。
1.2.2 设计并合成PCR引物
根据在GenBank上下载的水牛、绵羊、犬、人、仓鼠和大鼠等物种的STRA8 mRNA序列，以及猪STRA8 mRNA序列(登录号：JQ965783)和猪EST序列，使用Oligo 7软件设计特异性引物F1/R1来扩增STRA8基因；设计F2/R2特异性引物进行荧光定量，并以GAPDH基因为内参[18]，扩增的产物长度为183 bp。引物序列及扩增信息如表1。
表 1 STRA8引物序列及扩增片段信息Table 1. STRA8 primer sequence and amplified fragment information名称
name序列 (5′→3′)
primer sequences产物大小/bp
product sizeSTRA8-F1 TGTGGGGAAGGCTGACTGAA 1 316 STRA8-R1 ACAGCCCACTCCAAAACATC STRA8-F2 AAGTACATCTAGCCCCAGTTCCG 143 STRA8-R2 GAAGGTCCGGTTCCTGTTTGA 1.2.3 PCR体系及程序
PCR反应体系为：ddH2O 5.75 μL、2×GC Buffer Ι 12.5 μL、dNTP 4 μL、睾丸cDNA模板1.5 μL、上下游引物各0.5 μL及Ex Taq酶0.25 μL，总体系25 μL。运行程序的退火温度为60 ℃，扩增产物经电泳后测序。
1.2.4 生物信息学分析
利用DNAStar软件进行序列组装、CDS预测、蛋白序列推导，利用ProtParam tool程序(http://web.expasy.org/protparam)预测蛋白质的分子量(Mw)和等电点(pI)。利用软件及网站SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测推导出STRA8蛋白质的二级结构，SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de)预测出功能域，ProtScale程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)预测出疏水性，TMHMM 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测跨膜结构，SignalP 4.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，PSORT Ⅱ程序(http://psort.hgc.jp/form2.html)进行亚细胞定位，NetPhos 3.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点、Protfun 2.2软件预测蛋白质功能。通过NCBI BLASTP程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)搜索其他物种的STRA8蛋白质序列，利用DNAStar软件中的MegAlign程序和Clustal X软件与BMI STRA8蛋白序列(KU705622)进行同源比对；基于多物种氨基酸比对结果，利用MEGA 5.2构建系统进化树。
1.2.5 STRA8基因组、mRNA分析
利用Ensembl (http://asia.ensembl.org/index.html?redirect=no)及NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找STRA8基因的外显子、内含子的数目、长度以及在基因组中的位置。
1.2.6 多组织荧光定量表达分析
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2. 结果与分析
2.1 STRA8基因PCR结果
以F1/R1为引物，睾丸组织cDNA为模板，扩增的STRA8产物片段长度为1 316 bp (图1)。
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图 1 PCR扩增结果注：M. DL2 000 Marker；1. STRA8基因。Figure 1. The PCR resultNote: M. DL2 000 Marker; 1. STRA8 gene.2.2 STRA8基因序列及氨基酸序列
测序后拼接出BMI STRA8基因的CDS区为1 101 bp，编码366个氨基酸，已提交至NCBI GenBank，mRNA登录号和氨基酸登录号分别为KU705622和AOC89040 (图2)。
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图 2 STRA8编码序列及氨基酸序列注：ATG表示转录的起始密码子；奇数行字母表示核酸序列，偶数行字母表示相对应的氨基酸序列；*表示转录的终止密码子。Figure 2. The CDS sequence and amino acids sequence of STRA8Note: ATG. start codon of transcription; the odd line letters. nucleotide sequence; the even line letters. amino acid sequences; *. stop codon of transcription.2.3 STRA8蛋白质基本特性
BMI STRA8蛋白质的一级结构信息和理化性质结果见表2。
表 2 STRA8蛋白质理化特性Table 2. The physics and chemistry properties of STRA8一级结构特性
primary structure characteristics预测结果
prediction results编码的氨基酸数number of amino acids encoded 366 等电点number of amino acids encoded (pI) 4.52 分子量/ku the molecular weight (Mw) 41.06 分子式molecular formula C1793H2821N479O591S16 正电荷残基(Arg+Lys) positive charge residue 37 负电荷残基(Asp+Glu) negative charge residue 71 平均疏水性(GRAVY) average hydrophobicity −0.537 不稳定系数(II) coefficient of instability 61.78 脂肪系数(AI) coefficient of fat 79.18 2.4 STRA8蛋白质二级结构
无规则卷曲106个氨基酸，占全部氨基酸序列的28.96%；α-螺旋191个氨基酸，占全部氨基酸序列的52.19%；延伸链结构42个氨基酸，占全部氨基酸序列的11.48%；β转角27个氨基酸，占全部氨基酸序列的7.38%。
2.5 STRA8蛋白质功能域
STRA8蛋白质有1个HLH蛋白功能域(螺旋—环—螺旋蛋白质功能域)，位于34~84 AA处。在氨基端有1个HLH结构域和1个卷曲螺旋区域，在羧基端有2个低复杂度区域，HLH结构域包括2个保守性较高的α螺旋区和1个袢环(loop)，袢环长度不定。
2.6 STRA8蛋白质疏水性
STRA8蛋白质的N末端、C末端疏水值均小于0，表明两端均亲水，而在第213 AA处具有最大疏水值1.944，第162 AA处具有最小疏水−3.589。
2.7 STRA8蛋白质跨膜螺旋、信号肽及亚细胞定位
STRA8蛋白质无跨膜螺旋和信号肽。其主要定位在细胞核，概率为87%；其次定位在细胞质，概率为8.7%。
2.8 STRA8蛋白质磷酸化位点分析
共发现34个磷酸化位点，包括23个丝氨酸位点、8个苏氨酸位点，3个酪氨酸位点(表3)。
表 3 预测的BMI STRA8蛋白质磷酸化位点Table 3. The prediction results of BMI STRA8 protein phosphorylated sites磷酸化氨基酸phosphorylated
amino acids位置position 分值score 位置position 分值score 位置position 分值score 丝氨酸serine 4 0.525 11 0.605 35 0.997 48 0.533 91 0.649 101 0.991 111 0.503 118 0.962 121 0.700 129 0.971 172 0.547 204 0.604 205 0.638 231 0.803 241 0.567 259 0.994 263 0.995 267 0.957 276 0.903 291 0.615 300 0.988 303 0.760 306 0.973 苏氨酸threonine 42 0.641 61 0.775 81 0.683 193 0.548 223 0.897 277 0.702 301 0.681 360 0.601 酪氨酸tyrosine 109 0.933 113 0.632 186 0.936 2.9 STRA8功能分析
Protfun 2.2预测结果(表4)显示：STRA8蛋白在复制和转录过程中发挥作用的可能性最大，概率达0.362。其次，在调节功能、转录、转录调节、中间代谢中枢等过程中发挥作用的可能性也较大。可见，此蛋白可能在复制和转录等方面具有重要作用。
表 4 STRA8功能预测Table 4. Prediction of STRA8 function功能分类functional category 概率probability 氨基酸合成amino acid biosynthesis 0.072 辅因子生物合成biosynthesis of cofactors 0.059 细胞被摸cell envelope 0.036 细胞过程cellular processes 0.031 中间代谢中枢central intermediary metabolism 0.144 能量代谢energy metabolism 0.032 脂肪酸代谢fatty acid metabolism 0.016 嘌呤和嘧啶purine and pyrimidine 0.171 调节功能regulatory functions $\geqslant$ 0.268
复制和转录replication and transcription 0.362 翻译translation 0.115 转运和结合transport and binding 0.017 基因本体分类gene ontology category 概率probability 信号转导signal transducer 0.087 接收器receptor 0.003 激素hormone 0.001 结构蛋白structural protein 0.001 转运transporter 0.025 离子通道ion channel 0.011 电压门控离子通道voltage-gated ion channel 0.004 阳离子通道cation channel 0.010 转录transcription $\geqslant$ 0.168
转录调节transcription regulation 0.163 应激反应stress response 0.006 免疫反应immune response 0.010 生长因子growth factor 0.005 金属离子传输metal ion transport 0.009 2.10 STRA8蛋白质系统进化分析
BMI STRA8氨基酸序列与家犬(XP_005629800)、绵羊(XP_014950882)、水牛(XP_006079922)、人(XP_011514439)、仓鼠(XP_003508946)、大鼠(XP_006224926) 6个物种STRA8氨基酸序列经同源性比对后，构建的分子系统进化树(图3、4)。
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图 3 7个物种STRA8蛋白质序列相似性比对结果注：上三角数值表示一致性百分比，下三角数值表示分歧度。Figure 3. The percent identity analysis for STRA8 protein sequences of 7 speciesNote: Upper triangular values mean percent identity, lower triangular values mean divergence.![]()
图 4 7个物种STRA8蛋白质序列构建的系统进化树Figure 4. The phylogenetic tree STRA8 protein sequences of 7 species2.11 STRA8基因组、mRNA分析
在Ensembl数据库中搜索STRA8基因组DNA，结果显示该基因位于猪18号染色体NC_010460.3的14861386~14880354位置，其全长18 968 bp，包含8个外显子和7个内含子(图5)。
2.12 STRA8 组织mRNA表达分析
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图 6 BMI STRA8基因多组织表达谱注：1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.肾；6.胃；7.脑；8.肌肉；9.十二指肠；10.结肠；11.精囊腺；12.前列腺；13.尿道球腺；14.睾丸；15.附睾；不同字母表示差异极显著(P<0.01)。Figure 6. The multi-tissue expression profile of BMI STRA8Note: 1. heart; 2. liver; 3. spleen; 4. lung; 5. kidney; 6. stomach; 7. brain; 8. muscle; 9. duodenum; 10. colon; 11. seminal vesicle; 12. prostate; 13. urethral ball glands; 14. testis; 15. epididymis; different letters mean extremely significant difference (P<0.01).3. 讨论
近年来对于STRA8基因的结构和功能的研究越来越深入[11]，目前已有人、小鼠、山羊和鸡的研究报道[19-23]，研究表明：STRA8基因在雄性和雌性动物的生殖生理中起重要作用，是生殖细胞有丝分裂转变为减数分裂前的特异表达基因。本研究采用的试验动物为BMI猪，采用电子克隆方式拼接出猪的STRA8基因序列，并设计引物，然后以BMI为试验材料进行了验证。
本研究克隆了猪STRA8基因的全长编码区序列1 316 bp，包括编码区1 101 bp；编码366个氨基酸，包含117个疏水性氨基酸、89个极性氨基酸、37个强碱性氨基酸、71个强酸性氨基酸。化学修饰是蛋白质翻译后加工的重要内容，糖基化和磷酸化是蛋白质化学修饰的两种主要方式，蛋白质磷酸化可以大大提高酶蛋白的活性，本研究发现BMI STRA8蛋白磷酸化位点共有34个，为以后的功能研究提供了参考。
蛋白质的结构是其发挥功能的基础。通过生物信息学分析获悉，BMI STRA8蛋白含有1个蛋白功能域HLH，HLH结构域是1个家族类转录因子，这类转录因子对脊椎动物和无脊椎动物发育过程中细胞的增殖、分化、生长以及细胞的生存起着重要的调控作用，该类转录因子能够形成同二聚体或者异二聚体，然后与下游目的基因调控区的DNA序列相结合，从而发挥转录调控作用[24-25]。在RA存在的情况下，HLH结构域可以开启精原细胞的减数分裂[19, 22]。在STRA8基因的二级结构中α螺旋占大多数，从而保证了STRA8蛋白的稳定性。预测结果表明：STRA8蛋白质是疏水性蛋白，通过分析氨基酸序列的亲/疏水性，从而预测蛋白质的跨膜区，这对预测蛋白是否为膜蛋白有重要意义。STRA8蛋白无信号肽序列，说明它属于非分泌性蛋白，主要在细胞质中发挥作用。STRA8蛋白无跨膜螺旋结构，说明它属于非跨膜蛋白。STRA8的功能分析显示该蛋白在复制和转录过程中发挥功能的可能性最大，在调节功能、转录、转录调节、中间代谢中枢等中发挥功能的可能性都较大，显著高于其他功能。可见，此蛋白可能在复制和转录等方面具有重要作用。
BMI与其他6个物种的STRA8蛋白序列相似性均在70%以上，说明STRA8基因在物种进化过程中保守性较高。系统进化树显示水牛与绵羊聚在一起，为一小类，这两者皆为牛科动物；然后和猪聚为一类，三者皆为偶蹄目；再与家犬聚为一类，四者都为哺乳纲动物；之后与人聚为一类，此5个物种皆为脊索动物门；中国仓鼠与大鼠聚为一类，两者皆为啮齿目；两个大的分支聚为一类，两类都为脊索动物门，符合系统进化树的分类标准。
STRA8基因在雌性和雄性成年动物的性腺中都有很高的表达[2]。在成年小鼠中，STRA8基因RNA的表达似乎被限制在睾丸中，且这个表达仅限于生殖细胞，而不是体细胞[4]。米美玲等[26]研究表明：STRA8基因仅在成年小鼠的睾丸中表达；也有研究表明：STRA8基因表达仅限于减数分裂前成人睾丸的生殖细胞[1]。MIYAMOTO等[4]研究表明：人STRA8基因也仅在睾丸中表达。本研究对BMI实时荧光定量多组织表达谱分析表明：STRA8基因在性腺睾丸组织的表达量显著高于其他14种组织，在睾丸中的表达量是其他组织表达量的8~2 302倍，推断该基因主要在猪的睾丸中发挥重要功能。在生产实践中，公猪的繁殖力高低会直接影响其后代的数量和质量，精液品质是衡量公猪繁殖力高低的重要指标。而在近交系猪生产中，公猪的繁殖力直接影响近交系的继代繁育，因为近交系相互交配的公母猪要求有血缘上的高度近亲关系，与配母猪的公猪选择余地较小，一旦公猪繁殖力有问题，会直接影响某个亚系甚至家系的继代繁育。STRA8基因在BMI睾丸组织中高表达，表明该基因与精子生成有关。研究结果将为深入研究STRA8基因在猪中的功能提供重要依据。
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表 1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (dry matter basis)
项目items 组别groups 对照组control 10% TGR 15% TGR 原料 ingredients 羊草/% guinea grass 30.00 30.00 30.00 玉米秸秆/% maize straw 10.00 10.00 10.00 通脉颗粒药渣/% Tongmai granule residues 0.00 10.00 15.00 糖蜜/% molasses 1.80 1.80 1.80 玉米/% corn 25.50 21.00 20.40 酒糟及其残渣混合物/% distiller’s grains and their residue mixture 10.95 9.52 9.35 喷浆玉米麸质饲料(玉米皮)/% corn husk 17.50 13.38 9.08 预混料/% premix1) 0.40 0.40 0.40 尿素/% urea 0.35 0.50 0.67 食盐/% NaCl 0.80 0.80 0.80 石粉/% calcium carbonate 1.50 1.50 1.50 磷酸氢钙/% dcicaluium phosphate 0.40 0.40 0.40 小苏打/% sodium bicarbonate 0.80 0.70 0.60 合计/% total 100.00 100.00 100.00 营养水平/% nutrient levles2) 干物质/% dry matter 88.6 88.8 88.9 粗蛋白/% crude protein 12.44 12.39 12.38 代谢能/(MJ·kg−1) ME 9.9 9.7 9.6 中性洗涤纤维/% NDF 41.8 45.7 46.4 酸性洗涤纤维/% ADF 25.6 27.2 28.8 钙/% Ca 0.82 0.87 0.90 磷/% P 0.5 0.46 0.42 注：1) 预混料提供：VA 15 000 U/kg，VD 2 000 U/kg，VE 55 U/kg，Fe 50 mg/kg，Co 0.2 mg/kg，Cu 12.0 mg/kg，Se 0.5 mg/kg，Mn 50 mg/kg，I 0.55 mg/kg，Zn 25 mg/kg；2) 营养水平除代谢能均为实测值。
Note: 1) The premix provided VA 15 000 U/kg, VD 2 000 U/kg, VE 55 U/kg, Fe 50 mg/kg, Co 0.2 mg/kg, Cu 12.0 mg/kg, Se 0.5 mg/kg, Mn 50 mg/kg, I 0.55 mg/kg, Zn 25 mg/kg; 2) Nutrient levels were all measured values except ME. ME. metabolizable energy; NDF. neutral detergent fiber; ADF. acid detergent fiber.
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表 2 TGR的营养成分含量
Table 2 Nutrient contents of TGR
营养成分
nutrients通脉颗粒药渣
Tongmai granule residues粗灰分/% ash 6.57 粗脂肪/% EE 1.94 粗蛋白质/% CP 11.13 粗纤维/% CF 33.62 中性洗涤纤维/% NDF 54.23 酸性洗涤木质素/% ADL 14.94 酸性洗涤纤维/% ADF 44.54 总能/(MJ·kg−1) GE 18.20 Note: EE. ether extract; CP. crude protein; CF. crude fiber; NDF. neutral detergent fiber; ADL. acid detergent lignin; ADF. acid detergent fiber; GE. gross energy.
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表 3 TGR对杜寒杂交母羊屠宰性能的影响
Table 3 Effects of TGR on the slaughter performance in Doper × Short-tail Han ewe
项目items 组别groups SEM P值P-Value 对照组control 10% TGR 15% TGR 宰前活重/kg LWBS 41.67 42.67 39.50 0.75 0.23 胴体重/kg carcass weight 17.90 18.00 17.00 0.39 0.59 屠宰率/% dressing percentage 42.99 42.29 42.99 0.85 0.94 眼肌面积/cm2 eye muscle area 21.45 a 22.47 a 17.84 b 0.83 0.02 注：同行数据标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)；下同。
Note: In the same rows, values with different letters mean significant difference (P<0.05), while values with no letter or the same letter mean no significant difference (P>0.05); LWBS. live weight before slaughter; the same as below.
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表 4 TGR对杜寒杂交母羊器官指数的影响
Table 4 Effects of TGR on the organ indexes in Doper × Short-tail Han ewe
项目items 组别groups SEM P值P-Value 对照组control 10% TGR 15% TGR 心脏指数 heart index 0.34 0.35 0.38 0.02 0.65 肝脏指数 hepatic index 1.23 1.33 1.40 0.05 0.32 脾脏指数 spleen index 0.14 0.12 0.11 0.01 0.37 肺脏指数 lungs index 0.63 0.67 0.73 0.03 0.53 肾脏指数 kidney index 0.18 b 0.25 ab 0.27 a 0.02 0.04
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表 5 TGR对杜寒杂交母羊复胃发育的影响
Table 5 Effects of TGR on the development of complex stomachs in Doper × Short-tail Han ewe
项目items 组别groups SEM P值P-Value 对照组control 10% TGR 15% TGR 瘤胃重/kg rumen weight 0.59 0.61 0.65 0.03 0.74 网胃重/kg reticulum weight 0.10 0.09 0.10 0.01 0.81 瓣胃重/kg omasum weight 0.14 0.12 0.13 0.01 0.62 皱胃重/kg abomasum weight 0.24 0.23 0.18 0.02 0.35 复胃重/kg complex stomachs weight 1.07 1.04 1.06 0.02 0.92 瘤胃重/复胃重/% rumen weight/complex stomachs weight 55.01 b 57.98 ab 60.76 a 0.98 0.02 网胃重/复胃重/% reticulum weight/complex stomachs weight 9.22 8.63 9.77 0.26 0.23 瓣胃重/复胃重/% omasum weight/complex stomachs weight 13.40 11.75 12.60 0.35 0.17 皱胃重/复胃重/% abomasum weight/complex stomachs weight 22.37 a 21.64 a 16.87 b 0.91 <0.01 瘤胃重/宰前活重/% rumen weight/LWBS 1.41 1.42 1.63 0.06 0.25 网胃重/宰前活重/% reticulum weight/LWBS 0.23 0.21 0.26 0.02 0.44 瓣胃重/宰前活重/% omasum weight/LWBS 0.34 0.29 0.34 0.02 0.47 皱胃重/宰前活重/% abomasum weight/LWBS 0.58 0.53 0.45 0.03 0.33 复胃重/宰前活重/% complex stomachs weight/LWBS 2.57 2.45 2.69 0.05 0.21
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表 6 TGR对杜寒杂交母羊瘤胃发酵参数的影响
Table 6 Effects of TGR on the rumen fermentation parameters in Doper × Short-tail Han ewe
项目items 组别groups SEM P值P-Value 对照组control 10% TGR 15% TGR pH 5.83 b 5.89 b 6.31 a 0.09 0.04 ρ (氨态氮)/(mg·dL−1) NH3-N 3.51 b 3.17 b 6.71 a 0.32 <0.01 c (总挥发性脂肪酸)/(mmol·L−1) TVFA 90.77 a 94.68 a 59.21 b 5.96 <0.01 c (乙酸)/(mmol·L−1) acetate 59.29 a 63.19 a 41.44 b 3.60 <0.01 c (丙酸)/(mmol·L−1) propionate 22.58 a 21.57 a 10.69 b 2.04 <0.01 c (丁酸)/(mmol·L−1) butyrate 8.91 a 9.92 a 7.08 b 0.45 <0.01 乙酸/丙酸acetate/propionate 2.63 b 2.97 b 3.89 a 0.21 <0.01
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