香稻品种滇屯502复壮品系稻米挥发性成分分析
Analysis of Volatile Components in Rejuvenation Lines from a Fragrant Rice Variety Diantun 502
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香米因具有怡人香味而受到消费者的喜爱，具有很高的市场价值[1-2]；所以，培育具有香味性状的水稻品种是品质育种的重要方向之一[3-4]。香稻中含有200种对香气形成具有协同作用的挥发性化合物[5-6]，包括醛类、醇类、酮类、酯类和杂环类等[7-8]。挥发性香气成分的类型和比例导致气味差异，而非香气挥发性成分有利于整体气味的形成[9-11]。
近年来，由于顶空固相微萃取(SPME)和气质联用(气相色谱—质谱法，GC-MS)技术具有容易操作、分析速度快、成本低以及不需要有机溶剂等诸多优点，是稻米挥发性成分分析的主要手段。利用该分析手段在早籼稻稻米中鉴定出265种挥发性成分[12]，从陈化过程中的苏软香型米和武育粳米中鉴定出醇类、醛类、酮类、烷烃类、醚类和杂环类挥发性成分[13]。目前，该技术已是食品、环境、化工和医药等领域被广泛应用的分析检测手段[14]。
滇屯502为云南优质米生产企业使用的主要依靠品种，是通过系谱选育法培育的籼型常规稻香软米品种[15]。从示范推广至今已使用30多年，由于种性退化严重，制约了米业企业的生产发展。为了继续发挥该香稻品种的生产使用价值，本课题组对滇屯502开展复壮研究，筛选到一系列具有香味性状的复壮品系，但这些品系稻米香气成分与滇屯502是否存在差异尚不清楚。为此，本研究利用SPME结合GC-MS技术手段分析了复壮品系稻米挥发性成分，旨在为滇屯502复壮研究提供技术参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
材料共6种，包括云南香稻品种滇屯502，以及对其开展复壮筛选出来的具有香味性状的5个复壮品系，编号依次为502-23、502-44、502-50、502-92和502-115。于2018年2月3日播种，3月18日移栽，单穴单苗，株距15 cm，行距25 cm，每份材料种植13行，每行种植34株，2次重复，7月29日收获。稻谷自然晾晒干，样品去瘪除杂，脱壳备用。
1.2 仪器与设备
分析仪器是日本岛津公司的气质联用仪(GCMS-QP2010-ultra)和美国Supelco公司的固相微萃取装置(SPME)，萃取头为50/30 μm DVB/CAR on PDMS。
1.3 挥发性成分的提取与分析
1.3.1 样品准备
萃取头老化：将萃取头放入气相色谱进样口，入口温度为250 ℃，老化时间为30 min。样品制备：准确称量大米样品5 g，放置于15 mL顶空瓶中。之后，在该瓶中放入磁子和插入SPME管，调整并固定顶空瓶中萃取头的位置。80 ℃水浴30 min，吸附萃取60 min，迅速将萃取头放入GC-MS进样口，解吸15 min。拔出萃取头，待下个样品使用。
1.3.2 GC-MS分析条件
气相色谱—质谱法(GC-MS)分析时，样品先通过0.22 μm孔径的有机过滤器。
色谱条件：采用Hp-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，载气氦气，纯度99.999%，柱流速2.54 mL/min。升温程序：在初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/ min的升温速度，至180 ℃时保持1 min，至250 ℃时保持5 min。进样量1 μL，分流比为20∶1。
质谱条件：利用电子电流源，离子源温度220 ℃，电子电离能20 eV，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟2.7 min。扫描模式为全扫描，扫描质量范围为40~500 amu，谱库NIST11。
1.3.3 数据分析
通过与NIST标准质谱库匹配，用计算机搜索获得样品中每种未知挥发性组分的表征，确认挥发性化合物的化学组成。当匹配度>80 (最大100)时，即为某种化学成分。使用峰面积归一化法确定化合物的相对含量。
2. 结果与分析
2.1 复壮品系稻米挥发性成分的相对含量
通过固相微萃取法分析滇屯502及其5个复壮品系稻米的挥发性成分，结果(图1和表1)表明：5个品系与滇屯502在挥发性成分含量和种类上都存在差异。滇屯502和5个复壮品系502-23、502-44、502-50、502-92及502-115鉴定出挥发性成分分别有76、71、77、68、72和85种。它们含有的挥发性成分包括，烃类、醇类、酮类、醛类、酯类、呋喃类、醚类、吲哚类和酚类，分别为43种、32种、27种、26种、11种、5种、3种和1种；其他类挥发性成分5种。
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图 1 滇屯502及其复壮品系挥发性成分GC-MS总离子流图Figure 1. Total ion current chromatogram of volatile compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines表 1 滇屯502及其复壮品系挥发性成分的含量和种类Table 1. The content and number of volatile components in rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines物质名称
substance names指标
index滇屯502
Diantun 502502-23 502-44 502-50 502-92 502-115 醛类aldehydes C/% 41.71 50.57 53.80 47.59 54.87 44.78 N 20 19 21 19 22 21 醇类alcohols C/% 17.69 16.92 15.06 17.61 13.70 11.16 N 17 15 12 18 14 12 酮类ketones C/% 14.83 11.56 15.36 17.31 12.44 10.60 N 16 12 15 16 11 13 酯类esters C/% 1.52 2.06 1.66 1.57 1.77 1.42 N 4 6 3 3 4 5 烃类hydrocarbons C/% 8.40 5.89 6.90 7.93 9.23 8.65 N 18 16 13 12 12 15 呋喃类furans C/% 4.73 4.72 4.92 5.50 4.83 3.11 N 4 3 2 5 1 2 醚类ethers C/% 0.61 0.78 0.17 0.50 0.51 0.64 N 2 1 1 1 1 1 吲哚类indoles C/% — — 0.27 — — — N — — 1 — — — 酚类phenols C/% 0.66 0.77 0.26 0.34 0.27 0.26 N 1 1 1 1 1 1 其他others C/% 9.77 5.17 1.60 1.65 2.38 19.38 N 3 3 2 2 2 2 注：— 表示未检出；C 表示该成分占总挥发性成分百分比； N 表示挥发性成分种类。
Note: —. undetected; C. percentage of total volatile components; N. volatile components type.有研究认为醛类成分具有很低的阈值对整体风味的影响很大[16]。与滇屯502相比，5个复壮品系稻米中的醛类物质相对含量最丰富，醛类占总挥发性成分的41.71%~54.87%，其中502-92含量最高为54.87%，滇屯502含量最低为41.71%。醇类成分占总挥发性成分的11.16%~17.69%，5个品系的含量均低于滇屯502 (17.69%)。酮类成分占总挥发性成分的10.60%~17.31%，品系502-50 (17.31%)和502-44 (15.36%)的含量高于滇屯502 (14.83%)，而且这2个品系的香叶基丙酮含量分别为3.92%和2.84%，也都高于滇屯502 (2.45%)。
烃类占总挥发性成分的5.89%~9.23%，品系502-92 (9.23%)和502-115 (8.65%)相对含量高于滇屯502 (8.40%)。呋喃类占总含量的3.11%~5.50%，其中品系502-50 (5.50%)、502-44 (4.92%)和502-92 (4.83%)的含量高于滇屯502 (4.73%)。酯类占总挥发性成分的1.42%~2.06%，品系502-23 (2.06%)、502-92 (1.77%)、502-44 (1.66%)和502-50 (1.57%)的含量都高于滇屯502 (1.52%)。醚类、酚类和吲哚类成分的含量较少，只在502-44中鉴定出吲哚类成分2,3-二氢-1,1,5-6-四甲基-1H-吲哚，相对含量为0.27%，滇屯502及其5个品系中都鉴定出香味特征性成分2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)。
2.2 复壮品系稻米中关键风味化合物含量差异
在滇屯502及其5个复壮品系稻米中鉴定出2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)、1-辛烯-3-醇、正己醇、壬醛、己醛、辛醛、庚醛、戊醛、(E)-2-壬烯醛、十一醛和2,3-二氢-1,1,5-6-四甲基-1H-吲哚等11种挥发性成分(表2)，是稻米中关键风味化合物[17-18]。醛类气味特征以水果香、青草香和甜香为主[17-19]，在5个品系中鉴定出7种醛类物质，分别为具青草香的己醛、脂肪香的壬醛、水果香的戊醛、水果味的庚醛、柑橘味的辛醛、黄瓜香的E-2-壬烯醛和玫瑰香的十一醛，它们的含量为32.22%~40.48%，都高于滇屯502 (28.83%)。其中，己醛被认为是香稻中重要的香气成分，5个品系中己醛的相对含量(8.13%~11.87%)都高于滇屯502 (7.83%)。5个品系中鉴定出具蘑菇风味的1-辛烯-3-醇[19]和水果芳香的正己醇[17]等醇类物质，它们的含量为3.51%~7.78%，其中品系502-23 (7.78%)、502-44 (5.69%)和502-50 (6.97%)的含量高于滇屯502 (4.93%)。2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)是一种具爆米花香味的成分，易溶于热水、乙醇和乙醚，被认为是香稻香味的特征化合物和主要贡献物[20-22]。在5个品系都鉴定出2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)，含量为0.26%~0.77%，其中品系502-23 (0.77%)的含量高于滇屯502 (0.66%)。吲哚类成分2,3-二氢-1,1,5-6-四甲基-1H-吲哚在品系502-44中鉴定出，并未在滇屯502中鉴定出。在香稻绥稻4号稻米中鉴定出吲哚化合物，含量虽较低却表现强烈的风味特征[23]。
表 2 滇屯502及其复壮品系关键风味化合物占总挥发性成分百分比Table 2. The key flavor compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines物质名称 substance names 滇屯502 Diantun 502 502-23 502-44 502-50 502-92 502-115 醛类 aldehydes 戊醛pentanal — 1.02 0.94 — 1.72 1.04 己醛 hexanal 7.83 11.07 11.83 10.70 9.13 8.13 庚醛 heptanal 1.93 2.45 2.04 1.74 2.99 2.23 辛醛octanal 3.33 3.59 3.80 3.37 4.65 3.39 壬醛 nonanal 13.45 18.36 18.37 15.54 19.01 15.94 (E)-2-壬烯醛 (E)-2-nonenal 1.32 1.87 2.03 2.09 1.00 1.16 十一醛 undecanal 0.97 0.16 0.79 0.42 1.98 0.33 合计 total 28.83 38.52 39.80 33.86 40.48 32.22 醇类 alcohols 正己醇1-hexanol 2.89 4.11 3.30 4.14 2.49 1.92 1-辛烯-3-醇1-octen-3-ol 2.04 3.67 2.39 2.83 1.39 1.59 合计 total 4.93 7.78 5.69 6.97 3.88 3.51 吲哚类 indoles 2,3-二氢-1,1,5-6-四甲基-1H-吲哚
2,3-dihydro-1,1,5,6-tetramethyl-1H-Indene— — 0.27 — — — 酚类 phenols 2-乙酰-1-吡咯啉2-acetyl-1-pyrroline 0.66 0.77 0.26 0.34 0.27 0.26 总计 sum 34.42 47.07 46.02 41.17 44.63 35.99 在稻米关键风味化合物上，与滇屯502比较，品系502-23的醛类、醇类和2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量均较高，品系502-44的醛类、醇类、酮类和吲哚类含量较高，品系502-50的醛类、醇类和酮类含量较高，502-92和502-115仅在醛类含量上较高。总体上，5个复壮品系稻米中的关键香气成分都高于滇屯502，说明复壮研究获得的5个香稻品系香味更浓郁。
3. 讨论
本研究采用顶空固相微萃取结合气质联用技术分析了滇屯502及其5个复壮品系稻米的挥发性成分，挥发性成分中醛类、醇类和酮类含量最为丰富。但不同香味挥发性成分对香米香气贡献不同，仅靠成分高低并不能确定该成分对整体香气的贡献程度，相同浓度下阈值越低对香气的贡献就越大[24]，如香稻香味特征性成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)阈值非常低(0.1 μg/kg)，可赋予香稻显著的香味[25]。醛类关键化合物中，壬醛含量最高，这与张文灿等[23]的研究结果一致，壬醛阈值低(1 μg/kg)，是众多香米的关键香味成分[5]。醇类中，正己醇含量最高，正己醇阈值低(90 μg/kg)，具有水果香气，天然存在于水果中[23]。吲哚含量高时产生不愉快气味，但低含量时产生优雅的茉莉花香[26]，502-44中含低含量的吲哚，有助于整体形成特殊的香味。以上几种香味成分阈值较低，在含量低时也能呈现强烈的风味特征，对整体风味的形成影响较大。
复壮品系11种关键香味成分总量均高于滇屯502，但有些复壮品系个别香味关键性成分低于滇屯502。如502-23的十一醛含量，502-44的十一醛和2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量，502-50的庚醛、十一醛和2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量，502-92的(E)-2-壬烯醛、正己醇、1-辛烯-3-醇和2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量，502-115的(E)-2-壬烯醛、十一醛、正己醇、1-辛烯-3-醇和2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量均低于滇屯502，尤其关键香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)只在502-23中高于滇屯502，可能是环境因素造成的，具体原因还需进一步研究。
MATHURE等[27]对91种香稻的挥发性成分进行定量分析，发现2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量和吲哚呈正相关，本研究中只在502-44中发现吲哚，其2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量仅为0.26%。香叶基丙酮是酮类挥发性成分中重要的香气成分，已在多种植物研究中被报道，如在云南蒸熏茶的香气成分中发现了30种挥发性化合物，其中香叶基丙酮是主要的香味成分，具木兰香气[28]；在药材广金钱草中鉴定出10种主要挥发性成分，香叶基丙酮含量为1.75%[29]。有研究表明：香禾糯烹饪前并未产生香叶基丙酮，烹饪后却出现了新的香味成分香叶基丙酮，但其含量较低[30]，滇屯502及其5个复壮品系中都鉴定出香气成分香叶基丙酮，相对含量较高，该成分在香稻滇屯502中是否是一种关键的香味成分还有待研究。如图2所示：只在滇屯502中发现了低含量苯类化合物，杨洁等[31]认为香味强度与苯类化合物的含量有关，即苯类化合物含量越高，香米香味强度越强，这与本研究结果不相符。
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图 2 滇屯502及其复壮品系苯类化合物占总挥发性成分百分比Figure 2. The benzene compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines复壮品系稻米含有非常丰富的香气成分。除了香味性状外，营养价值也是评价水稻品质的重要标准，进一步对滇屯502及其复壮品系的营养指标(蛋白质、维生素和矿物质元素等)进行鉴定，以期为云南香稻育种研究提供优质的水稻资源。
4. 结论
采用SPME结合GC-MS技术分析，在滇屯502及其5个复壮品系(502-23、502-44、502-50、502-92和502-115)稻米中鉴定出挥发性成分分别有85、76、71、77、68和72种，包括烃类、醇类、酮类、醛类、酯类、呋喃类、醚类、吲哚类和酚类等，其中醛类、醇类和酮类成分含量最丰富。发现含有香稻关键香味化合物11种，含量为34.42%~47.07%，5个复壮品系的含量均高于滇屯502，其中502-23含量最高，较滇屯502高36.75%，其他4个品系502-44、502-50、502-92和502-115分别高33.70%、19.61%、29.66%和4.56%。在5个品系中都鉴定出香稻香味的特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)，502-23的含量较滇屯502高16.67%。滇502及其5个复壮品系中都鉴定出香叶基丙酮含量为1.50%~3.92%，在稻米中很少报道鉴定出该酮类成分。
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图 1 滇屯502及其复壮品系挥发性成分GC-MS总离子流图
Figure 1. Total ion current chromatogram of volatile compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines
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图 2 滇屯502及其复壮品系苯类化合物占总挥发性成分百分比
Figure 2. The benzene compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines
表 1 滇屯502及其复壮品系挥发性成分的含量和种类
Table 1 The content and number of volatile components in rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines
物质名称
substance names指标
index滇屯502
Diantun 502502-23 502-44 502-50 502-92 502-115 醛类aldehydes C/% 41.71 50.57 53.80 47.59 54.87 44.78 N 20 19 21 19 22 21 醇类alcohols C/% 17.69 16.92 15.06 17.61 13.70 11.16 N 17 15 12 18 14 12 酮类ketones C/% 14.83 11.56 15.36 17.31 12.44 10.60 N 16 12 15 16 11 13 酯类esters C/% 1.52 2.06 1.66 1.57 1.77 1.42 N 4 6 3 3 4 5 烃类hydrocarbons C/% 8.40 5.89 6.90 7.93 9.23 8.65 N 18 16 13 12 12 15 呋喃类furans C/% 4.73 4.72 4.92 5.50 4.83 3.11 N 4 3 2 5 1 2 醚类ethers C/% 0.61 0.78 0.17 0.50 0.51 0.64 N 2 1 1 1 1 1 吲哚类indoles C/% — — 0.27 — — — N — — 1 — — — 酚类phenols C/% 0.66 0.77 0.26 0.34 0.27 0.26 N 1 1 1 1 1 1 其他others C/% 9.77 5.17 1.60 1.65 2.38 19.38 N 3 3 2 2 2 2 注：— 表示未检出；C 表示该成分占总挥发性成分百分比； N 表示挥发性成分种类。
Note: —. undetected; C. percentage of total volatile components; N. volatile components type.
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表 2 滇屯502及其复壮品系关键风味化合物占总挥发性成分百分比
Table 2 The key flavor compounds of rice variety Diantun 502 and its rejuvenated lines
物质名称 substance names 滇屯502 Diantun 502 502-23 502-44 502-50 502-92 502-115 醛类 aldehydes 戊醛pentanal — 1.02 0.94 — 1.72 1.04 己醛 hexanal 7.83 11.07 11.83 10.70 9.13 8.13 庚醛 heptanal 1.93 2.45 2.04 1.74 2.99 2.23 辛醛octanal 3.33 3.59 3.80 3.37 4.65 3.39 壬醛 nonanal 13.45 18.36 18.37 15.54 19.01 15.94 (E)-2-壬烯醛 (E)-2-nonenal 1.32 1.87 2.03 2.09 1.00 1.16 十一醛 undecanal 0.97 0.16 0.79 0.42 1.98 0.33 合计 total 28.83 38.52 39.80 33.86 40.48 32.22 醇类 alcohols 正己醇1-hexanol 2.89 4.11 3.30 4.14 2.49 1.92 1-辛烯-3-醇1-octen-3-ol 2.04 3.67 2.39 2.83 1.39 1.59 合计 total 4.93 7.78 5.69 6.97 3.88 3.51 吲哚类 indoles 2,3-二氢-1,1,5-6-四甲基-1H-吲哚
2,3-dihydro-1,1,5,6-tetramethyl-1H-Indene— — 0.27 — — — 酚类 phenols 2-乙酰-1-吡咯啉2-acetyl-1-pyrroline 0.66 0.77 0.26 0.34 0.27 0.26 总计 sum 34.42 47.07 46.02 41.17 44.63 35.99
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