枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是微生态制剂的常用菌种之一，因其具有较高的蛋白酶和纤维素酶活性、较强的生物夺氧能力、耐高温高压、易贮存等特点而被广泛应用^[1]。在畜禽粪便发酵有机肥的过程中，利用微生物菌剂堆肥发酵，是将畜禽粪便无害化处理的最有效的手段之一^[2]。堆肥发酵的实质是微生物通过代谢繁殖对有机质进行分解，转化为无机态养分的过程，通过添加外源微生物来增加微生物的数量，不仅可以缩短发酵时间，还可以提高有机肥的肥效^[3-4]。决定发酵效果的主要因素之一是添加的菌剂能否在一定的生态系统中定殖，并适应恶劣的环境^[5]。目前对微生物定殖能力的检测方法主要包括：外来基因标记(如绿色荧光蛋白)、DNA和RNA探针法和天然抗生素标记法等^[6]。其中，抗生素标记法具有方便快捷、消耗低、更实用等优点，且不会导致菌株其他重要特性丧失，常用来检测微生物的定殖能力。本研究的枯草芽孢杆菌GX7由发酵鸡粪中分离所得，具有良好的产酶特性，拟利用抗生素标记法检测GX7在鸡粪发酵中的定殖能力，通过鸡粪发酵中的参数变化，研究GX7在发酵过程中的作用，为畜禽粪便发酵有机肥提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

供试菌株为高温枯草芽孢杆菌GX7，由辽宁省微生物科学研究院实验室分离于鸡粪发酵高温阶段并鉴定；鸡粪为自然干燥，含水量75%~85%，由辽宁省朝阳市兴和牧业有限公司提供；复合菌剂由辽宁省微生物科学研究院实验室保藏的菌种制成菌剂与GX7混合而成，包括霉菌、放线菌和常温细菌。

1.2   16S rRNA基因序列

引物设计参照GenBank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列，用Primer Premier 5.0软件分析后，设计1对引物^[7]，16S rDNA测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。

正向引物：5′-GGAC GGCTGAGTAACACG-3′；

反向引物：5′-GACAACGCTT GCCACCTA-3′。

1.3   抗生素敏感性试验与耐药突变菌株的获得

将供试菌株均匀涂于NA培养基平板，分别放置10种抗生素[利福平(Rif)、卡那霉素(Km)、氨苄西林(Ap)、链霉素(Str)、四环素(Tet)、庆大霉素(Gen)、红霉素(Ery)、氯霉素(Cho)、环丙沙星(Cip)和新霉素(Neo)]药敏纸片，置于恒温培养箱中，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径。根据试验结果，选用抑菌圈直径最大的Rif作为标记用抗生素。分别配制Rif质量浓度为0、6.25、12.5、25和50 μg/mL的NA培养液，取纯化好的GX7单菌落接种到含Rif质量浓度为6.25 μg/mL的NA液体培养基中，按液体培养条件培养^[8]，待出现混浊后，用稀释平板法将稀释后的菌液涂匀在含相同质量浓度Rif的平板上，37 ℃培养，待长出单菌落后，挑菌转入下一高浓度Rif的NA培养液中培养，至出现菌体，依次类推^[9]。

1.4   耐药突变菌株BX7稳定性试验

1.4.1   耐药稳定性试验

将获得的耐药突变菌株BX7在不含Rif的NA培养基上连续传代培养15次后，再接种至含200 μg/mL Rif的NA培养基，观察生长情况；将BX7菌株置于低温(2~4 ℃) 保存3个月后，活化，再接种至含Rif 200 μg/mL的NA培养液中，24 h后涂NA平板，观察是否有菌落生长^[10]。

1.4.2   遗传稳定性试验

BX7与GX7的DNA同源性比较。用含Rif的NA培养基从发酵鸡粪中回收突变菌株，经多次纯化，提取其DNA，用16S rRNA基因的引物对其扩增，并与原始菌株GX7比较。

1.5   耐药突变菌株BX7生长曲线及酶活力测定

1.5.1   耐药突变菌株BX7生长曲线测定

取14个250 mL三角瓶，分别装入50 mL NA培养基，加入1 mL BX7菌种过夜培养液(37 ℃180 r/min培养24 h)，按液体培养条件培养。0~24 h每2 h取1次样；24 h以后每4 h取1次样，32 h结束。每个时间点做3个平行处理^[8]。用未接菌培养基作为空白，600 nm波长下测OD值，取平均值，绘制生长曲线。

1.5.2   突变菌株BX7酶活力分析方法

将1 mL BX7菌种分别接于装有50 mL CMC-Na液体培养基和NA液体培养基的250 mL三角瓶中，按液体培养条件培养后转入已灭菌的EP管中，40 ℃ 4 200 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。纤维素酶活力定量分析采用DNS显色法^[11]；蛋白酶活力定量分析采用福林酚法^[12]。计算各菌株粗酶液的酶活力，绘制纤维素酶活力曲线和蛋白酶活力曲线。

1.6   突变菌株BX7在鸡粪中定殖

将BX7按0.3%的比例混合至鸡粪中，发酵过程中的第1、4、7、10、13、16天取样，用含200 μg/mL Rif的NA培养基计活菌数，每个样品测3次，取平均值。

1.7   堆肥试验处理方法

设3个处理(表1)，将15%的杏鲍菇菌糠粉碎成渣与鸡粪混合，调节堆料的含水量约为65%，GX7菌剂与复合菌剂的添加量均为0.3%左右，将堆体堆成圆垛型，直径约1.5 m，高约1 m，堆置在通风的塑料大棚内发酵，堆体无须覆盖。人工进行翻堆，前14 d每2 d翻堆1次，之后每4 d翻堆1次，定时取样并记录温度。

表  1  堆肥试验的设计

Table  1.  Experiment design for the composting

处理编号 treatment No.	堆肥物料 compost material	菌剂 microbial agent
1	鸡粪+杏鲍菇菌糠 feces+ Pleurotus eryngii residue	无none
2		GX7
3		复合菌剂 multiple species inoculant
注：鸡粪参数：pH 8.56、全氮2.15%、全磷0.62%、全钾1.86%、总有机碳19.1%、C/N8.88；杏鲍菇菌糠参数：pH 5.73、全氮2.25%、全磷1.32%、全钾1.45%、总有机碳42.2%、C/N18.75。 Note：Chicken manure parameters: pH 8.56, total nitrogen 2.15%, total phosphorus 0.62%, total potassium 1.86%, total organic carbon 19.1%, C/N 8.88; parameters of P. eryngii: pH 5.73, total nitrogen 2.25%, total phosphorus 1.32%, total potassium 1.45%, total organic carbon 42.2%, C/N 18.75.

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1.8   堆肥过程温度及营养成分的测量

每天9：00和16：00测温。翻堆前测定物料温度，将温度计插入堆料中央约20 min，测定3次，取平均值，同时对环境温度进行记录^[13]。采用NY 525—2012^[14]测定营养成分的变化情况。

2.   结果与分析

2.1   GX7对不同抗生素的敏感性分析

由表2可知：Rif对细菌GX7的抑菌圈最大，说明GX7对Rif最敏感，所以选用Rif作为标记用抗生素。

表  2  不同抗生素对GX7抑菌作用的比较

Table  2.  Comparison of different antibiotics on GX7 bacteriostatic action

抗生素种类types of antibiotics	Rif	Km	Ap	Str	Tet	Gen	Ery	Cho	Cip	Neo
抑菌圈平均直径/mm antibacterial circle diameter	65.07	28.48	10.02	19.04	14.62	24.21	37.33	32.81	30.93	25.95

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2.2   不同质量浓度Rif对GX7生长的影响

由表3可知：GX7对Rif的天然耐药质量浓度为6.25 μg/mL，超过此质量浓度GX7不再生长。说明天然菌株GX7对Rif没有明显的耐药性。

表  3  不同质量浓度Rif下GX7的生长情况

Table  3.  The growth of GX7 at the different mass concentrations of Rif

ρ(Rif)/(μg·mL−1)	0	6.25	12.5	25	50
生长情况growth situation	++	+	−	−	−
注：“++”表示生长良好；“+”表示能够生长；“−”表示没有生长。 Note: “++” means good growth; “+” means can grow; “−” means no growth.

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2.3   突变菌株BX7稳定性检测

通过1.4和1.5节的方法能够获得丰满完整的抗药菌株，说明所获耐药突变体菌株BX7具有稳定性，传至15代仍保持良好的性状。

2.3.1   突变菌株BX7与GX7生长曲线及产酶比较

由图1可知：耐药突变菌株BX7的生长曲线与GX7的基本一致；纤维素酶活力与蛋白酶活力变化也基本相同，这说明突变菌株的生长特性与产酶特性和GX7相比基本一致，并没有发生明显的变化。

图  1  BX7与GX7生长曲线及产酶比较

Figure  1.  Comparison of growth curve and enzyme production between GX7 and BX7

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2.3.2   突变菌株BX7与GX7的同源性比较

2菌株的DNA条带位置基本一致，分子量约为500 bp (图2)；对扩增产物进行纯化测序，经NCBI的BLAST比对(图3)，2菌株与枯草芽孢杆菌的相似性均达到99%以上。

图  2  PCR扩增电泳图

注/Note：1. Marker；2. GX7；3. BX7。

Figure  2.  The electrophoresis map of PCR complification

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图  3  GX7与BX7的16S rDNA系统发育进化树

Figure  3.  The 16S rDNA phylogenetic evolution tree of GX7 and BX7

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2.4   突变菌株 BX7在鸡粪中的定殖情况

由表4可知：BX7在鸡粪发酵过程中，活菌数变化较大，初始活菌数为1.2×10⁶ CFU/g，加入鸡粪中菌数有所增加，到第4天可以达到1.5×10⁸ CFU/g，第7天菌数有所减少，约为2.8×10⁶ CFU/g，第10天菌数急剧降低，只有1.3×10² CFU/g，到第13天时检测不到BX7活菌。

表  4  BX7在鸡粪中活菌数的变化

Table  4.  Change of the number of living bacterium BX7 in chicken manure

天数/d days	1	4	7	10	13	16	19
活菌数/(CFU·g−1) count of the living-yeast	1.2×106	1.5×108	2.8×106	1.3×102	0	0	0

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2.5   堆肥过程中物料温度的变化

由图4可知：不同处理的堆肥物料温度有明显不同，其中处理1和处理2均在第4天左右开始升温，第9天温度升高到69 ℃，这是因为GX7属于高温细菌，在堆肥初始的升温阶段并不能有效地迅速提高温度；而处理3 明显升温较快，这是由于有大量的多种好氧微生物的存在，有机物被迅速分解，并放出大量热，导致处理3在4 d左右就开始升温，第6天温度就可达到70 ℃左右；13~16 d左右，物料温度迅速下降，降至环境温度左右，准备开始第2次发酵阶段。处理3的第2次发酵结束约是24 d左右，比处理1的发酵时间缩短了3~5 d。

图  4  堆肥物料的温度变化

Figure  4.  Change of the temperature in the composting materials

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2.6   堆肥过程物料其他营养物质的变化

如图5a所示：堆肥物料的初始含水量均在 65%左右，随着堆肥时间的增加，各处理的含水量均迅速下降。由于处理2和处理3添加了菌剂，好氧微生物的数量增多，并快速繁殖，水分蒸发的速度也相对较快，导致含水量下降速度也快。各处理的水分变化趋势整体一致，3个处理的含水量分别由初始的66.7%、65.5%和68.2%下降到29.0%、23.2%和22.1%。

图  5  堆肥物料参数变化

Figure  5.  The parameter changes of composting material

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由图5b可见：3个处理的全氮含量变化趋势基本一致，随发酵温度的升高，全氮含量下降，其中处理3的全氮含量下降速度略快于处理1和处理2，这是由于发酵前期，添加的微生物大量繁殖，消耗氮素，同时，物料温度升高，氨态氮挥发较多，使全氮含量降低；然后随发酵的继续进行，微生物的固持氮源作用导致氮素的损失减少，同时有机质的不断分解和水分的散失，堆体重量减小，产生浓缩效应，所以全氮含量又出现上升的过程；发酵过程中，由于温度的不断升高，水分蒸发也加快，加入菌剂的处理由于升温快，所以水分散失得也快，体现在含水量下降速度较快，但最终含水量均下降至25%左右；堆肥物料的全氮含量也有较明显变化，高温阶段氮素损失较多，全氮含量较低，至发酵结束总含氮量又有所增加，这与微生物的固持氮源作用和堆体减小的浓缩效应有关。

由图5c、d可见：堆肥过程中各处理的全磷和全钾含量均呈上升趋势，这与发酵过程中微生物的作用以及水分散失导致堆体重量减少有关，菌剂对物料中全磷、全钾的变化影响较小，试验中3个处理的全磷含量分别由0.67%、0.71%和0.69%提高到0.98%、1.02%和1.12%，全钾含量由初始的1.85%、1.79%和1.92%提高到2.53%、2.55%和2.65%。

由图5e可见：堆肥过程中物料的总有机碳含量呈下降趋势，且3个处理间差异不明显。有机碳含量下降是因为发酵过程中微生物将大量的有机质分解和转化，生成二氧化碳和水，并散失热量，微生物对有机质的降解是堆肥中碳元素损失的主要原因。堆肥初期，有机碳的含量变化不大，随着发酵时间的延长，物料中微生物数量和活性的不断增加，各处理有机碳的含量不断下降，到发酵结束时，3个处理的有机碳含量均下降了约10%。

3.   讨论

本试验通过对自然菌株GX7进行抗生素敏感性试验，获得最敏感抗生素为利福平(Rif)；利用Rif对其进行耐药性诱变，获得耐药质量浓度为200 μg/mL的突变菌株BX7，其耐药稳定性良好，在此质量浓度下其他细菌均不生长；通过生长曲线的比较和纤维素酶活力以及蛋白酶活力的比较，可以确定BX7的生长特性与产酶特性和GX7相比基本一致，并没有发生明显的变化；通过突变菌株BX7与GX7的同源性比较，2菌株与枯草芽孢杆菌的相似性均达到99%以上，进一步说明2株菌没有明显区别，BX7可以作为定殖试验菌种应用。通过添加BX7，并对鸡粪发酵过程中BX7活菌数的测定，确定BX7在鸡粪中有良好的定殖能力。本试验所采用的抗药性标记方法虽然不能达到特异性标记的目的，但是相对于逐步筛选、遗传学标记等方法而言，具有快速、简便且成本低的优点，此方法也不会导致原始菌株的遗传稳定性及其他重要特性变异甚至丧失^[15]。

本研究表明：加入复合菌剂的堆肥物料升温较快，其降温和二次发酵时间也提前，发酵结束时间比未加入菌剂的处理提前了3~5 d，大大提高了产肥效率；发酵过程中，由于温度的不断升高，水分蒸发也加快，加入菌剂的处理升温更快，所以水分散失得也快，体现在含水量下降速度较快，但最终含水量均下降至25%左右；堆肥物料的全氮含量也有较明显变化，高温阶段氮素损失较多，全氮含量较低，至发酵结束总含氮量又有所增加，这与微生物的固持氮源作用和堆体减小的浓缩效应有关；加入菌剂对磷、钾和有机碳的含量变化影响较小，全磷和全钾含量均呈上升趋势，总有机碳呈下降趋势。根据国家标准，堆肥物料升温至55 ℃并保持3 d以上，或50 ℃保持5~7 d，就可以杀死物料中的致病微生物和虫卵等^[14]。本试验中，3个处理均升温至65 ℃左右，并能保持此温度6~8 d，这能更有效地杀灭病原菌，更好的保证肥料的安全性，发酵结束后各项指标均符合国家标准。

通过试验结果证明：GX7作为单一菌株的菌剂，具有良好的产酶特性，同时其耐高温的特性在鸡粪堆肥发酵中起到重要作用。由于GX7只能在高温阶段起作用，发挥作用较局限，可以通过与常温菌、霉菌、放线菌等协同作用，形成复合菌剂更高效的发酵鸡粪，实现废物的再利用。