猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种猪病毒性传染病，患病的怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，其他年龄段的猪感染该病毒后出现严重的呼吸系统疾病^[1-2]。由于 PRRSV具有易变异、抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement，ADE)和免疫抑制等特点，全球养猪业以及猪肉的食品安全面临着严峻的挑战。PRRSV主要在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)中复制繁殖^[3]，因此，PAMs在PRRSV的研究中具有关键作用。

干扰素(interferon，IFN)是一类抗病毒细胞因子，在病毒感染早期，干扰素由病毒诱导细胞产生，具有较强保护力。根据分子结构、免疫原性和受体特异性的不同可将IFN分为I型、II型和III型，其中干扰素调节因子3 (interferon regulation factors 3，IRF3)和干扰素调节因子7 (interferon regulation factors 7，IRF7)在干扰素产生的信号通路中发挥着关键作用。IFN-γ作为先天性和适应性免疫反应的重要介质，能够清除外来病原体及肿瘤。 IFN-γ具有抗病毒作用，同时还能介导巨噬细胞活化，增加其吞噬作用，促进促炎细胞因子产生、增加微生物活性氧以及氮物质的产生，进而清除细胞内的病原体^[4]。有研究发现：PRRSV感染宿主细胞后仅能检测到低水平的IFN-γ^[5]，而重组pIFN-γ不但能有效抑制PRRSV，同时还对免疫抑制猪具有良好免疫调节作用，增强疫苗的免疫效果^[6]。因此，本试验就PRRSV云南株体外感染PAMs后对IFN-γ及其信号分子mRNA转录量的变化进行检测，旨在为PRRSV的免疫抑制机制和防控提供理论依据和技术支持。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   病毒

TCID₅₀为10^5.06 mL⁻¹的PRRSV云南株YN-2011由本实验室分离纯化保存(登录号：JX857698)^[7]。

1.1.2   细胞

PAMs从健康仔猪肺脏中分离得到^[8]。

1.2   方法

1.2.1   试验分组

将分离的PAMs以2×10⁶ mL⁻¹的密度铺在6孔板于37 ℃、5% CO₂培养。将培养的PAMs分为对照组和PRRSV组，PRRSV组加PRRSV病毒悬液100 μL，对照组加等量的1640培养液。分别在感染后的6、12、24、48、60 h收集 PAMs及其上清液，−80 ℃保存，每组设3个重复。

1.2.2   PAMs上清中IFN-γ的质量浓度检测

按照Swine IFN-γ ELISA Kit试剂盒说明书进行样品的处理和检测。

1.2.3   IFN-γ及其信号分子mRNA转录水平的检测

采用TRIzol提取各组细胞总RNA，按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，并以其为模板，利用本实验室建立的 qPCR 进行检测。引物由上海生工合成(表1)。

表  1  荧光定量PCR引物序列

Table  1.  Real-tine PCR primer sequences

基因gene	引物序列 primer sequence	退火温度/℃ T m	目的片段/bp fragment size
β-actin	F:5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′	52	122
	R:5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3′
PRRSV	F:5′-GTCAGACATCACTTTACCCCTAG-3′	60	123
	R:5′-CTCCACAGTGTAACTTATCCTCC-3′
IFN-γ	F:5′-GGCCATTCAAAGGAGCATGG-3′	60	147
	R:5′-AGTTCACTGATGGCTTTGCG-3′
IRF-3	F:5′-GGTGCCTACACTCCTGG-3′	60	105
	R:5′-GTGGTCCTCTGCTAAACG-3′
IRF-7	F:5′-CGCCTCCTGGAAAACCAA-3′	60	76
	R:5′-CCCTGAGTTGTCCTGCAACA-3′

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1.2.4   数据分析

所有数据用“mean±SD”表示，应用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。

2.   结果与分析

2.1   感染后第24小时不同处理组PAMs形态

图1显示：正常组贴壁的PAMs呈圆形，细胞质丰富；PRRSV感染组的PAMs在24 h可见细胞变圆、聚集，并随着时间的延长最后出现脱落、悬浮、崩解、破碎和死亡。

图  1  24 h各组细胞的观察(200×)

Figure  1.  PAMs in different treatment groups for 24 h under inverted microscope

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2.2   PAMs上清液IFN-γ的质量浓度

检测不同时间点PAMs上清液中IFN-γ的质量浓度(图2)可知：PRRSV组IFN-γ的质量浓度与对照组相比无显著性差异。PRRSV组IFN-γ的生成量在6~48 h逐渐升高，48 h达到最大值，6 h时IFN-γ的质量浓度低于对照组。

图  2  不同时间点不同处理IFN-γ质量浓度(ρ)变化

Figure  2.  The change of IFN-γ mass concentrations at different time points

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2.3   PRRSV mRNA转录水平的动态变化

由图3可知：PRRSV组PRRSV的mRNA转录水平在感染后的6~24 h逐渐升高，48 h时转录水平有所下调，60 h时再次升高。

图  3  PRRSV mRNA转录水平

注/Note: **. P<0.01。

Figure  3.  The transcription levels of PRRSV mRNA

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2.4   PAMs中IFN-γmRNA转录水平

由图4可知：PRRSV组IFN-γ的mRNA转录量在感染后6~48 h逐渐升高，48 h时达到最大值，在6 h时IFN-γ mRNA转录水平显著低于正常对照组，24、48 h时显著高于对照组IFN-γ mRNA转录水平，到60 h又恢复到正常对照组水平。

图  4  IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平

注/Note: **. P<0.01。

Figure  4.  The transcription levels of IFN-γ mRNA in each group at different time points

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2.5   PAMs中IRF3和IRF7mRNA转录水平

运用qPCR方法检测不同处理组IRF3和IRF7 mRNA相对转录量。根据2^−ΔΔCt可以得出对照组的数据为1。结果(表2)显示：PRRSV组中IRF3的mRNA转录量在6、12、24 h时低于正常对照组，48 h时转录水平高于正常对照组IRF3的 mRNA转录量，而到60 h时又显著低于正常对照组；PRRSV组IRF7的mRNA转录量在24 h时达到最大值且显著高于对照组，但在12、48、60 h时均显著低于正常对照组。

表  2  IRF3和IRF7 mRNA在各组不同时间点的转录水平

Table  2.  The transcription levels of IRF3 and IRF7 mRNA in each group at different time points

基因 gene	培养时间/h culture time
	6	12	24	48	60
IRF3	0.56±0.055	0.62±0.165	0.97±0.014	1.12±0.082	0.49±0.155*
IRF7	1.02±0.189	0.43±0.066**	1.48±0.246**	0.41±0.034**	0.55±0.038**
注：与同一时间点的对照组比较，*.P<0.05，**.P<0.01。 Note: Compared with control group at the same time, *.P<0.05, **.P<0.01.

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2.6   IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关性分析

如图5所示：PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关系数分别为|R|=0.96和|R|=0.04。根据|R|∈[0.1, 0.3)为弱相关，|R|∈[0.3, 0.5)为中等相关，|R|∈[0.5, 1.0]为强相关，得出IFN-γ与IRF3基因mRNA转录水平呈强正相关与IRF3基因呈正相关。

图  5  PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7基因转录水平相关性分析

Figure  5.  IFN-γ and IRF3 and IRF7 correlation with the transcription in PRRSV groups

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3.   讨论

PRRSV感染机体后出现的免疫学症状与适应性免疫应答的低效表达有关。研究表明：由病毒诱导产生的特异性IFN-γ可作为细胞免疫功能评价的重要指标，用于病毒感染后宿主免疫机制的研究^[9]。本研究运用qRT-PCR和ELISA检测PRRSV感染PAMs后对IFN-γ的影响发现：PRRSV组IFN-γ mRNA转录水平在24、48 h时显著高于对照组，这一结果与前人研究的用PRRSV感染从支气管肺泡灌洗液中分离得的细胞后，其IFN-γ表达水平高于感染前的表达水平的结果^[10]相类似。但IFN-γ的生成量与对照组相比却无显著性差异。研究发现：不同毒力的PRRSV毒株诱导IFN-γ的能力存在差异^[11]。PATRICIA等^[10]和HAN等^[12]的研究发现：PRRSV高致病性毒株刺激IFN-γ生成的能力显著高于PRRSV经典毒株。IFN-γ主要是由活化的CD4⁺Th₁ 、CD8⁺T细胞产生，巨噬细胞产生IFN-γ的能力较弱。

IRF3和IRF7是主要的抗病毒转录因子，无论机体通过何种模式识别受体或何种信号通路来识别病原体，最终均能活化IRF3和IRF7。研究发现：PRRSV的Nsp1、Nsp2、Nsp11、结构蛋白N和GP5蛋白可以通过不同的途径来抑制IRF3的产生，尤其对于猪肺泡巨噬细胞和单核细胞等易感细胞^[13-15]。本研究运用qRT-PCR检测PRRSV感染PAMs后对IRF3和IRF7的影响发现：PRRSV组中IRF3的mRNA转录水平随着感染时间的延长逐渐升高，但均低于对照组，IRF7mRNA转录水平在12、48、60 h时显著低于对照组，说明PRRSV体外感染PAMs后可抑制IRF3和IRF7 mRNA转录水平。另外，本研究发现PRRSV组中IFN-γ mRNA转录水平与IRF3 mRNA转录水平存在强正相关关系，与IRF7 mRNA存在弱正相关关系。研究表明：IFN-γ能增加巨噬细胞的吞噬作用和促进MHCI及II类分子的表达，提高抗原递呈功能^[16]。

本研究表明：PRRSV在感染PAMs过程中不刺激IFN-γ的分泌，但对IFN-γ mRNA的转录在24 h内抑制，后上调其转录水平，在60 h时又被抑制。