哺乳动物的精子发生是一个复杂且被严格调控的过程，包括有丝分裂、减数分裂、细胞凋亡、染色质重塑、基因表达的转录前和转录后调控等一系列过程，有成千上万的基因参与整个调控，其中超过2300个基因主要在睾丸中表达，而且这些基因多为精子发生所必须，但很多基因的作用机理目前仍然未知^[1]。鉴定参与雄性动物生精的基因的功能，可为精子发生的原理解析提供一定的启示。通过基因敲除(KO)策略，目前已阐明了400多个睾丸特异表达的基因的功能，发现这些基因多数对于雄性的生育是必不可少的，然而，也有少数基因虽然在睾丸中高表达，但将其敲除后发现并没有显著影响到精子发生^[2-3]。TEX37 (睾丸表达序列37) 是YU等^[1]采用Affymetrix芯片对人和小鼠睾丸全基因表达谱扫描而发现的基因。该基因起初被称为Tsc21，是因其是睾丸保守基因(testis-specific conserved gene)，且蛋白质分子量为21 ku命名的^[1]。通过进一步研究发现：该基因在不同日龄的小鼠睾丸中表达量不同，35日龄之后才会表达而且表达比较稳定^[1]。

睾丸表达序列37 (testis expression sequence 37，TEX37)基因虽然已在人和小鼠中有过研究，但还未在猪中有研究报道，本研究首先利用分子生物学方法克隆了版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI) TEX37基因，获得该基因一级结构的核苷酸序列；然后，对TEX37蛋白质功能进行初步分析；最后，利用qPCR技术确定TEX37基因的多组织mRNA表达水平。研究结果可为深入研究TEX37基因在精子发生方面的功能研究奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验动物

按照云南农业大学动物保护委员会的标准处死版纳微型猪近交系成年公猪3头，立即取样后液氮速冻并转移至−80 ℃超低温冰箱保存。

1.2   方法

1.2.1   PCR模板的获取

利用TaKaRa柱式RNA提取试剂盒获取各组织RNA，并进行纯度、质量浓度和完整性鉴定后，利用TaKaRa反转录试剂盒合成模板cDNA。

1.2.2   PCR引物的设计

从GenBank下载牛(NM_001099160)、绵羊(XM_012169803)、山羊(XM_005686692)及马(XM_008518646)的TEX37 mRNA序列，结合BLAST的猪EST序列(CX058868)，同时参照猪TEX37 mRNA预测序列(XM_005653038)，使用Oligo 7软件设计特异性引物(F₁：5′-GCTGTTTTCGCTGCTTGTGCT-3′；R₁：5′-CCGCGCCCTTGTAAGCTG-3′)来扩增TEX37基因637 bp，设计特异性引物(F₂：5′-AGCAAGCAAAGCTGGACACCCAA-3′；R₂：5′-CGCTGAGAAACCTGCCTTCGT-3′)进行荧光定量分析，扩增长度为195 bp，并以GAPDH基因为内参扩增183 bp。

1.2.3   PCR体系及程序

使用TaKaRa Ex TaqE推荐并优化后的50 µL体系：36.5 µL的超纯水(18.2 MΩ)，5 µL的10×含有MgCl₂的Buffer，4 µL的2.5 mmol/L dNTPs，2 µL的睾丸cDNA模板，上、下游各1 µL的10 µmol/L引物，0.5 µL的Ex TaqE。运行程序： 95 ℃ 4 min；35个循环：98 ℃ 30 s→58 ℃ 45 s→ 72 ℃ 45 s；72 ℃后延伸10 min。

1.2.4   TEX37基因多组织荧光定量表达谱分析

利用F₂/R₂特异性短引物，以BMI睾丸cDNA为扩增的模板，以GAPDH为内参对照进行多组织荧光定量mRNA表达谱分析。qPCR总体系和运行程序参照1.2.3节略微修改，包括灭RNA酶的超纯水(18.2 MΩ)、TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqE、引物F₂/R₂和模板cDNA，用统计软件SPSS 19.0方差同质性方法进行显著性检验分析。

2.   结果与分析

2.1   TEX37睾丸cDNA的PCR扩增结果

利用F₁/R₁引物，以BMI睾丸组织cDNA为PCR模板，扩增的TEX37基因长度为637 bp (图1)。

图  1  TEX37基因扩增结果

注：M. DL2 000；1. TEX37基因。

Figure  1.  The amplification result TEX37 gene

Note: M. DL2 000 DNA; 1. TEX37 gene.

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2.2   TEX37基因完整编码序列及翻译后的氨基酸序列

BMI TEX37基因的完整编码序列长561 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，翻译后共186个氨基酸，已获得的GenBank基因和氨基酸的登录号分别为KU705619和AOC89037，TEX37蛋白质TSC21结构域、核酸及蛋白质序列见图2。

图  2  TEX37核酸序列及氨基酸序列

注：$\underline{\underline {\rm ATG}} $表示起始密码子；上下行对应的字母分别为核酸和氨基酸；下划线是TSC21保守结构域；“*”表示终止密码子。

Figure  2.  The sequences of nucleic acids and amino acids of TEX37

Note: $\underline{\underline {\rm ATG}} $ means start codon; capital letters corresponding to the upper and lower rows indicate nucleic acid sequences and amino acid sequences, respectively; underlines means conserved domains TSC21; “*” means stop codon.

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2.3   TEX37染色体定位、mRNA编码和蛋白质保守结构域

TEX37基因位于猪3号染色体CU464187.2序列的60132947~60136805位置，全长3858 bp，包含3个外显子和2个内含子。BMI TEX37的基因组结构及特征、mRNA编码区和蛋白保守结构域见图3。

图  3  TEX37染色体定位、mRNA编码和蛋白保守结构域

Figure  3.  Chromosome location, encoding mRNA and conserved protein domain of TEX37 gene

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2.4   qPCR结果

由图4可知：TEX37基因在BMI睾丸组织中表达量极显著高于其他组织(P<0.01)；在精囊腺、尿道球腺和前列腺三大副性腺中也呈现相对中度表达(由高到低)；在其他组织中相对低表达。

图  4  TEX37基因多组织表达模式

注：不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01) 。

Figure  4.  The expression patterns of multi-tissues on TEX37 gene

Note: Different capitals mean extremely significant difference (P<0.01) .

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2.5   TEX37蛋白质一级结构信息

BMI TEX37编码186个氨基酸，分子量M为21.19 ku，分子式C₉₅₂H₁₄₅₈N₂₆₄O₂₆₇S₁₀，等电点pI为8.58，正电荷残基(Arg+Lys)数为22，负电荷残基(Asp+Glu)数为19，平均疏水性(GRAVY)为−0.460，不稳定系数(II)为71.82，脂肪系数(AI)为70.22。

2.6   TEX37蛋白质二级结构

BMI TEX37蛋白质二级结构为含51.61%的无规则卷曲(96个氨基酸)、20.43%的延伸链结构(38个氨基酸)、17.20%的α-螺旋(32个氨基酸)和10.75%的β-转角(20个氨基酸)。

2.7   TEX37蛋白质疏水性

TEX37蛋白质在N末端疏水，相反其C末端却亲水，且其最大疏水值1.544位于第160氨基酸位置，其最小疏水值−2.556位于第34氨基酸位置处。

2.8   TEX37蛋白质功能分析

功能分析结果表明：TEX37蛋白在细胞被膜(≥0.804)、转运和结合(>0.20)、信号转导(>0.20)和应激反应(>0.20)等方面发挥作用。TEX37含有2类功能活性位点：蛋白酶C磷酸化位点，序列号PS00005，在83~85和169~171氨基酸处；酪蛋白激酶II磷酸化位点，序列号PS00006，在83~86、100~103和101~104氨基酸处。

2.9   TEX37蛋白质跨膜螺旋及信号肽

TEX37蛋白质无跨膜螺旋和前端信号肽序列，是非跨膜非分泌蛋白。

2.10   TEX37蛋白质系统进化分析

BMI TEX37氨基酸序列与普通猪 (XP_013848206)、牛 (XP_005910959)、羊 (XP_012025185)、猫 (XP_003984300)、人(NP_689883)和小鼠(EDK98928) 6个物种氨基酸序列同源性比对结果表明：相似度分别为80.6%、78.9%、76.9%、71.0%、69.4%和67.0%。构建的分子系统进化树如图5所示。

图  5  TEX37蛋白质系统进化树

Figure  5.  The phylogenetic tree of TEX37 protein

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3.   讨论

在商业化猪生产中，目前主要通过人工授精技术来繁育猪群，因1头公猪可以给几十甚至上百头母猪提供精液，公猪的精液品质就显得尤为重要。而在近交系猪群的遗传繁育中，虽仍采用本交方式繁育，但公猪的繁殖力也关系到1个亚系甚至家系的继代问题。影响雄性动物精子生成的3 000多个基因中有1000多个是睾丸特异表达的^[3]，截至目前，TEX37基因已在人类和小鼠中有研究报道^[4-8]，在猪中尚未见报道。本研究确定了TEX37基因位于猪的3号染色体之上，qPCR结果表明：睾丸组织mRNA表达量甚至高于一些其他组织1500倍(P<0.01)，推测该基因主要与精子发生和雄激素分泌等相关。小鼠TEX37基因主要在睾丸和附睾中高表达，人类该基因在睾丸中特异性表达^[1]。为了研究TEX37基因是否是影响精子发生过程的主效基因，KHAN等^[9]利用CRISPR/Cas9技术在小鼠中敲除了TEX37基因，发现敲除TEX37的公鼠的睾丸形态、质量、精子数量和交配行为以及配母鼠的产仔数等指标与野生型小鼠均无显著差异，说明该基因重要性不能仅根据其表达模式来确定，也许小鼠中TEX37基因的功能是冗余的，敲除该基因后其旁系同源物基因可以补偿其功能，可能导致该基因虽被敲除但功能没有明显受到影响，这需要以后同时敲除多个与其协调互作的基因来进行深入研究，抑或TEX37基因只有在某些刺激条件下才能发挥作用，目前还未知^[9]。本研究发现：TEX37基因在BMI猪睾丸组织中同样呈最高表达，与小鼠和人中表达趋势基本一致，但其功能是否与小鼠中一样存在冗余，需要进一步通过基因敲除或基因编辑等手段深入研究才能确定。

功能生物信息学分析显示：BMI TEX37蛋白不包含跨膜螺旋和N端信号肽序列，表明其属于非跨膜蛋白和非分泌性蛋白。功能分析显示：TEX37蛋白主要在细胞被膜中发挥功能。TEX37蛋白有1个TSC21超家族结构域，该家族的蛋白都是睾丸特异性蛋白^[10]。该结构域在睾丸中转录的基因区比在其他器官中大很多^[11]。在睾丸中有1124个基因被鉴定为高度富集(n=364)和中度富集(n=760)^[12]。而且，大约一半的睾丸特异性基因在精子形成的后期表达，在精子中表达约占30%，在精细胞中表达约占21%，在减数分裂前期的生殖细胞或睾丸细胞中睾丸的特异性转录物相对较少^[12]。因此，在下一步研究中有必要对其亚细胞定位进行分析研究，以便于为深入研究该基因的表达定位奠定基础。

蛋白质的结构与功能之间互为联系^[13]，BMI TEX37蛋白二级结构中含有较多的无规则卷曲螺旋，该螺旋是酶发挥功能的重要活性部位，也是蛋白质功能部位的二级结构组成元件^[14]。BMI TEX37与其他物种的氨基酸序列相似性均在60%以上，表明该基因在物种中相对保守。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰调控的方式，影响细胞的增殖、分化和凋亡等多个过程^[15]，BMI TEX37蛋白酶C磷酸化和酪蛋白激酶II磷酸化位点的发现对以后进一步解析该基因在精子发生方面的功能奠定了基础。