滇杨与毛白杨插穗内源激素含量的比较研究
Comparative Study on the Endogenous Hormone Contents in Cuttings of Populus yunnanensis and P. tomentosa
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杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)树种的统称,因其生长快、适应性强、用途广而被世界许多国家和地区广泛栽培和利用,是当今世界中纬度地区栽培面积最广、木材产量最多的树种之一[1-3]。中国具有丰富的杨树种质资源,占世界杨树种类的50%以上,其中白杨派和青杨派中的许多树种均为中国所特有,且分布非常广泛[4-6]。毛白杨(P. tomentosa)属白杨派(Section Leuce),为中国优良的速生树种之一,以材质好、生长快、冠形优美等特点而为人们所喜爱,是优良的庭园绿化和行道树种,但硬枝扦插不易成活,限制了其栽培利用[7-8]。滇杨(P. yunnanensis)为青杨派(Section Tacamahaca)树种,主要分布于云南省中部、北部和南部,贵州省西部及四川省西南部等地区中海拔范围1 300~3 200 m间的山地,具有分布海拔梯度变化大,适应性强,生长迅速,扦插易于生根等优良特性,是典型而稀有的低纬度高海拔南方型杨属树种,可用于插杆造林[9-11]。
本试验以扦插难以生根的毛白杨和扦插易于生根的滇杨为试材,比较二者插穗生根过程中内源激素生长素(indole-3-acetic acid, IAA)、玉米素(zeatin, ZT)、赤霉素(gibberellin, GA3)和脱落酸(abscisic acid, ABA)的动态变化,探讨该4种内源激素对2种杨树生根难易程度的影响,为揭示毛白杨扦插不易生根的内部机制奠定研究基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以前期收集并繁殖保存的滇杨和毛白杨3株优树为母体,剪取截干后1年生长势与粗度相近的滇杨与毛白杨萌生枝用于制作插穗,插穗长度为30 cm,上部保留2~3颗饱满侧芽。参照随机区组试验设计方法,每小区1个基因型,10株小区,按株行距30 cm×40 cm扦插于不添加任何肥料的苗床上,扦插深度约15 cm。树种间各小区相互交错排列。以扦插第0 天为起始,每隔7 d取样1次,至第49天,共取样8次。每次随机选取滇杨和毛白杨3个基因型各1根插穗切取基部皮层提取内源激素,共计3个生物学重复。
1.2 样品处理
采集的插穗样品用清水冲洗干净沙土,再经蒸馏水冲洗,砂布擦干表面水分。用手术刀切取插穗土面以下2 cm至插穗基部端口以上2 cm之间的所有树皮。若插穗已萌生不定根,则去除不定根。液氮充分研磨,−80 ℃保存备用。
1.3 内源激素的提取与检测
参照李佳蔓等[12]的方法提取IAA、ABA、GA3和ZT。提取IAA、ABA和GA3的方法为:称取样品粉末约1.0 g,加入10 mL甲醇4 ℃静置18 h,过滤甲醇冲洗样品,并合并滤液;加入等体积的石油醚分液,萃取2次(弃醚相),45 ℃减压蒸干;加NaHCO3 (pH 8.5)溶解,用H3PO4调pH至2~3,等体积乙酸乙酯萃取2次,合并酯相,45 ℃旋转蒸干,1 mL 甲醇定容,0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤,作为供试液保存于4 ℃冰箱。提取ZT的方法为:用提取IAA、ABA和GA3相同的方法处理样品,调节pH至2~3,Sep-Pak C18小柱分离纯化,依次以纯水、50%甲醇、100%甲醇洗脱,收集50%甲醇洗脱液,45 ℃旋转蒸干;1 mL 甲醇定容,0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤,作为供试液保存于4 ℃冰箱。
于Agilent 1200 Series高效液相色谱仪上采用外标峰面积法进行4种内源激素的定量检测,试验条件为柱温30 ℃,流速1 mL/min,进样量10 μL,检测波长:GA3,210 nm;IAA和ABA,254 nm;ZT,280 nm。
1.4 数据分析
对滇杨和毛白杨插穗基部皮层内4种内源激素的含量测定值分别进行统计分析,比较滇杨和毛白杨4种内源激素含量的变化。所得数据用Excel 2003进行整理,采用SPSS 13.0进行数据分析,应用Origin 8.5软件进行相关图形的绘制。
2. 结果与分析
2.1 滇杨与毛白杨插穗基部生根观测
根据对取样时挖取的插穗基部观测表明:扦插第7天,滇杨插穗开始出现愈伤组织,并在21 d观测到不定根的出现,而毛白杨在21 d出现愈伤组织,但直到49 d都没有形成不定根(图1)。
2.2 滇杨与毛白杨插穗基部内源激素含量分析
于49 d观测期内,滇杨IAA含量略高于毛白杨,但差异均不显著,且2种杨树均于7 d (滇杨出现愈伤组织)时具有较高IAA含量[滇杨插穗为219.55 μg/g (FW),毛白杨插穗为200.26 μg/g(FW)],而21 d时(滇杨不定根形成,毛白杨产生愈伤) IAA含量均较低。前5个观测期内(0、7、14、21和28 d),滇杨的ZT含量较高,与毛白杨差异仅于0 d时达显著水平,而后3个观测期(35、42和49 d),毛白杨的ZT含量略高,但差异不显著。毛白杨ABA含量和GA3含量于整个观测期内均高于滇杨,其中,毛白杨ABA含量在第0、21、28和49天时显著或极显著高于滇杨,而毛白杨GA3含量于第7~35天共5个时期显著或极显著高于滇杨(图2)。
2.3 滇杨和毛白内源激素含量比值分析
由图3所示:以滇杨为参照,毛白杨的IAA/ZT于0、7 、28和35 d时较高,其余观测期较低,但差异均不显著。IAA/ABA、ZT/ABA、IAA/GA3和ZT/GA3比值在整个观测期内均低于滇杨,其中,2种杨树的IAA/ABA和ZT/ABA比值差异于0和14 d时达极显著水平,而IAA/GA3和ZT/GA3比值于0、7、14和28 d时差异显著。毛白杨插穗基部的ABA/GA3结果在观测期内均高于滇杨,但差异不显著。
3. 讨论
根是植物长期进化过程中形成的适应陆生生活的重要器官之一,主要分为3种,主根源于种子中的胚根,侧根为主根发育出的分支,这2种根均属于直根系,而不定根属须根系,通常在某种环境胁迫下,由地上部分的器官(如茎)发生而成[13]。在林木无性繁殖过程中,扦插技术难易程度直接取决于不定根是否发生。不定根的形成由环境和内源激素相互作用、共同调控[14]。许多研究认为IAA是调节不定根发生和发育的主要内源激素,而其他内源激素主要通过与生长素的互作调节而起作用[15]。本研究结果显示:滇杨与毛白杨插穗基部皮层中,滇杨的IAA和ZT含量较高,但2个树种之间的差异并不显著,而毛白杨插穗基部皮层的ABA和GA3则在整个观测期内含量较高,表明IAA或ZT含量的高低并不是影响毛白杨扦插难生根的主要因素,而高浓度的ABA和GA3可能抑制了毛白杨插穗不定根的形成。
皮层内的IAA主要集中于细胞分裂活动旺盛的形成层区[16],其局部富集有助于刺激不定根发生[17],是不定根原基起始的必要条件,直到根原基形成后,生长素才会迅速转移至其他生长活跃的部位[18]。但也有许多研究表明IAA与植物生根难易没有直接关系[19-20]。董宁光[21]对杨树嫩茎生根研究表明:低浓度的细胞分裂素促进生根,高浓度则抑制生根。欧阳群芳等[15]对欧洲云杉生根过程中内源激素检测时发现:GA3和ZT含量的降低是促进插穗生根的重要原因,高含量是不定根形成的抑制剂。但长白松的扦插试验表明:在组织形成、不定根的产生过程中GA4含量增加[18]。关于ABA含量与生根关系也有不同的报道,ABA在白桦插穗根原基发生过程中大幅度下降[22],是抑制生根的主要激素,但在鹅掌楸不定根形成前开始上升,促进了插穗的生根[23]。在白杨派树种生根过程,高浓度ABA在多数试验中均被证实起抑制作用[24-25]。由此可见,内源激素与生根的关系较为复杂,本研究无论是基于生根时间(滇杨于21 d时IAA和ZT含量低于14 d),还是基于树种对比(IAA和ZT含量于滇杨和毛白杨中差异不显著),均表明IAA和ZT与滇杨和毛白杨生根能力差异的关系不明显。同时,毛白杨于整个观测期内并没有形成不定根,而滇杨于21 d可观测到不定根,2种杨树的内源激素随时间的变化趋势相似,进一步表明ABA和GA3的高浓度富集才是抑制毛白杨生根的主要因素,这与杨树生根过程中内源激素变化研究的较多结果[26-28]相一致。
内源激素对植物生根过程的调节是十分精细和复杂的,一个简单的生理过程不仅需要单个激素的瞬时调控,更多的是多种激素的共同作用结果[29-31],这些激素常以联合体的形式参与植株的生长发育进程[13, 32-33]。因此,杨树插穗生根过程中内源激素动态变化分析时,不仅考虑单个激素的富集与释放,也要考虑激素之间的动态平衡。陈雪梅等[24]认为:IAA/ABA的比值可以作为杨树插穗生根能力的标准,其比值越高,生根能力越强。本研究发现:滇杨插穗基部皮层内的IAA含量高于毛白杨,而ABA含量显著低于毛白杨。相应地,滇杨插穗基部皮层内的IAA/ABA比值显著高于毛白杨。由此可知:插穗基部皮层内高含量的ABA可能抑制了毛白杨插穗基部不定根的形成。此外,研究结果还显示:ABA与GA3协同作用抑制了毛白杨插穗不定根的形成,但二者之间如何维持平衡从而抑制毛白杨不定根的产生,有待于进一步深入研究。
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