正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)病毒属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)^[1]。正番茄斑萎病毒属病毒具有广泛的植物寄主范围，而其传播介体——蓟马在全球重要的农业生产区域均有分布。2013年，朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)首次在中国云南昆明被鉴定并报道^[2]，通过病毒粒子显微结构、基因组结构特点及寄主范围确定该病毒为一种新的正番茄斑萎病毒属病毒^[2-4]。2013—2014年，本项目组首次报道了该病毒的S和M RNA序列^[4]，其S RNA序列长为2 724 nt，正向编码444 aa的NSs蛋白，反向编码275 aa的核壳体蛋白。M RNA序列长约4 741 nt，正向编码309 aa的非结构蛋白NSm及GnGc，反向编码1130 aa的糖蛋白前体。该病毒能入侵朱顶红(Hippeastrum rutilum)、蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis)、喜林芋(Philodendron bipinnatifidum)、烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)等经济作物，引起同心环纹、叶片畸形、坏死斑、坏死和环斑等症状，严重危害农业生产。目前该病毒已广泛扩散至福建、广东、广西、海南和云南等中国南部省份^[5]，感染速度快、范围广，危害极为严重。HCRV主要由细角带蓟马(Taeniothrips eucharii)传播^[2]。细角带蓟马(T. eucharii)是1922年在百慕大群岛(北大西洋)被记录，后来在中国多次被报道^[6-7]。目前关于细角带蓟马与HCRV的相关研究只局限在获毒率与传毒率方面。

目前关于HCRV在不同虫龄细角带蓟马中的增殖规律还不清楚，本研究建立实时荧光PCR技术对饲毒后不同虫龄的细角带蓟马中的HCRV病毒核酸含量进行相对定量分析，旨在明确HCRV在细角带蓟马中的增殖情况，将有助于深入明确HCRV与细角带蓟马的互作关系研究。

1.   材料与方法

1.1   材料

使用的HCRV株系为2012年由本课题组分离并鉴定的HCRV HLS1-2株系，接种于一点红(Emilia sonchifolia)。细角带蓟马(T. eucharii)为2013年由本课题组鉴定并饲养的品系。

1.2   方法

1.2.1   样本准备

收集孵化后的1龄细角带蓟马若虫，将1龄若虫置于感病的一点红叶片上获毒48 h，以保证绝大部分的若虫均获毒。将一部分的1龄若虫收集，置于−80 ℃冰箱中保存，将剩余的蓟马置于无毒的四季豆(Phaseolus vulgaris)和韭葱(Allium porrum)上，恒温箱中饲养。分别收集发育至2龄若虫、蛹及成虫若干只，置于−80 ℃冰箱中保存。提取单头蓟马RNA，并以随机引物进行逆转录，每个处理3个重复，以未获毒的细角带蓟马为阴性对照。

1.2.2   引物设计与合成

荧光定量过程中对于参照基因β-actin源于参考文献[8]，HCRV N基因引物序列根据NCBI已经公布的HCRV RNA序列(Accession No. JX833564)设计(表1)。

表  1  实时荧光定量引物

Table  1.  Primers for qRT-PCR

目的基因gene	引物名称primers	序列(5′→3′) sequence	片段大小/bp size
β-actin[9]	WFT-26F	GTATCGTCCTGGACTCTGGTGA	130
	WFT-92R	GGAAGGGCGTAACCTTCATAG
N	HQ1F	AGGGTTTCATTAGAGCCA	110
	HQ1R	CATTGACCATAGGGAGGT

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1.2.3   质粒标准品制备

以WFT-26F/WFT-92R、HQ1F/HQ1R为引物，扩增β-actin、HCRV N，连接pEASY-T1载体，克隆转化测序筛选后，对阳性克隆提取重组质粒用于标准曲线的制备。凝胶电泳及分光光度计检测质粒纯度及浓度。对2种重组质粒进行10倍的连续梯度稀释，获得10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷、10⁻⁸稀释梯度的质粒。

1.2.4   实时荧光定量PCR方法的建立

本过程选用SYBR^® Premix Ex Taq^TM II (Tli RNaseH Plus)试剂盒，根据说明进行采用两步法反应程序。反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，DNA模板(<100 ng) 2 μL，dH₂O (灭菌蒸馏水) 6 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s，后95 ℃变性3 s，58 ℃退火与延伸30 s，进行40个循环。结束后进行溶解曲线检测。

2.   结果与分析

2.1   荧光定量PCR特异性

对β-actin及HCRV N基因扩增后的特异性进行分析。Real-time PCR结束后形成熔解曲线，结果显示在针对β-actin质粒标准品(图1)定量试验的熔解曲线均只在T_m=82 ℃处出现1条单一的峰，且阴性对照未出现扩增片段。HCRV N基因(图1)质粒标准品定量试验的熔解曲线均只在T_m=79.5 ℃处出现1条单一的峰，且阴性对照未出现扩增片段。说明β-actin及HCRV N基因引物进行定量特异性高，结果可靠。

图  1  β-actin (a)和N基因(b)定量熔解曲线

Figure  1.  Melt curve of β-actin (a) and N gene (b)

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2.2   标准曲线建立

将含有β-actin的阳性标准质粒10倍稀释液作为模板，通过荧光定量PCR扩增。待反应结束以后，通过软件自动分析荧光定量PCR反应结果。绘制β-actin扩增曲线及标准曲线(图2)，标准曲线方程为：y=−3.403 2x+27.005，扩增效率为100.7%，相关系数为0.999 4，标准质粒含量对数与C_t值之间有良好的线性关系。

图  2  β-actin扩增曲线(a)及标准曲线(b)

Figure  2.  Amplification plot (a) and standard curve (b) of β-actin

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将含有HCRV N基因的阳性标准质粒10倍稀释液作为模板，通过荧光定量PCR扩增。待反应结束后，软件自动分析荧光定量PCR反应结果。

绘制HCRV N基因扩增曲线及标准曲线(图3)，标准曲线方程为y=−3.403 2x+27.005，扩增效率为96.71%，相关系数为R²=0.999 8，标准质粒浓度对数与C_t值之间有良好的线性关系。

图  3  HCRV N基因扩增曲线(a)及标准曲线(b)

Figure  3.  Amplification plot (a) and standard curve (b) of N gene

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2.3   对细角带蓟马获毒HCRV后不同虫龄病毒的相对量

通过对不同的处理进行实时荧光定量，最终获得不同虫龄中HCRV相对量(图4)。去除异常值后，应用Scheffe法验证不同虫龄间病毒含量差异，应用双标准曲线法进行分析，结果显示：成虫与其他虫龄间的差异显著(P<0.05)，而1龄若虫、2龄若虫及蛹的差异不显著。结果表明：HCRV在蓟马发育过程中病毒粒子不断增加。1龄若虫中HCRV核酸含量最低，到达成虫时病毒核酸含量最高。说明HCRV在细角带蓟马发育过程中以增殖的形式传播。

图  4  HCRV在细角带蓟马发育过程中的增殖规律

Figure  4.  Multiplication rule of HCRV in different developing stages of T. eucharii

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3.   讨论

本研究首次构建了HCRV的qRT-PCR检测体系，能够定量检测到单头蓟马体内HCRV。所用的qRT-PCR法是基于SYBR Green的，SYBR Green是一种DNA染料，能够与双链DNA结合产生荧光。在PCR过程中通过仪器检测反应体系中的荧光信号，实现对PCR过程的实时监测。在研究中基于N基因和β-actin设计特异性引物进行扩增，避免了在扩增中非特异性条带的产生。在针对N基因和β-actin扩增反应的熔解曲线可以看出其在82 ℃处出现1个单峰，且在温度上升过程中无杂峰出现，说明所选择的引物特异性高。研究中选用基于双标准曲线法的相对定量比较细角带蓟马4个发育时期体内的HCRV核酸相对含量。选用的内参基因为β-actin，β-actin在蓟马体内表达稳定，被用于蓟马相关实时荧光定量PCR检测过程中的参照基因。双标准曲线法需要同时对目的基因和对照基因构建标准曲线，然后通过标准曲线得出的回归方程算出初始模板量，再经过均一化处理后得目的基因的相对含量。通常认为构建标准曲线时，相关系数R²>0.98，扩增效率为90%~110%，其引物用于该反应的荧光定量检测结果较好。本试验中绘制β-actin标准曲线，扩增效率达到100.07%，相关系数R²=0.999 4。绘制N基因标准曲线，扩增效率为96.71%，相关系数为R²=0.999 8。构建的标准曲线复合要求。熔解曲线与标准曲线均表明本试验中所选用的目的基因引物和对照基因引物均符合要求。

qRT-PCR技术对获毒后不同虫龄体内病毒核酸含量进行了检测，为准确分析HCRV在细角带蓟马发育过程中的增殖规律提供数据。HCRV在细角带蓟马发育过程随着蓟马的发育而增加，成虫中的病毒核酸含量最高。

正番茄斑萎病毒属病毒是植物病毒中少数以循回增值型方式传播的病毒。蓟马获毒后可以终生带毒，而病毒在蓟马中的复制增殖提高了其传播效率。1999年，NAGATA等^[9]的研究发现西花蓟马只有在若虫获毒，成虫时期才能够传毒。若虫获毒后并不立即传播，需要在西花蓟马体内增殖后才能够有效传播，但不会通过卵传至后代^[10]。西花蓟马若虫在取食感染正番茄斑萎病毒属病毒的植株后获毒，携带病毒的成虫将病毒传播给其他植物。蓟马的刺吸式口器破坏正番茄斑萎病毒属病毒感病植物的组织后，正番茄斑萎病毒属病毒粒子随着植物汁液到达若虫的中肠并且感染中肠细胞，并被介体蓟马以循回增殖的方式传播。传毒蓟马在若虫时期食用获毒的叶片组织后，病毒粒子进入蓟马的中肠并且感染中肠细胞^[11-13]。研究表明：Tomato spotted wilt virus (TSWV)的获毒最短时间发生在传毒蓟马取食后的5 min^[14-15]。病毒粒子扩散中肠周围的肌肉细胞，随后病毒粒子在中肠中扩散^[16]，最后病毒可以在唾液腺组织中检测到^{[9, 17-18]}。当获毒蓟马发育到最后一个若虫阶段时，病毒粒子也可以在它的前肠(foregut)中检测到^[19]。研究表明：西花蓟马的获毒时期仅在1龄若虫及2龄若虫的前期^[16]，而且其他时期将不会获毒^[11]。在TSWV传毒研究中发现病毒粒子的浓度与传毒过程密切相关^{[12, 18]}。Impatiens necrotic spot virus (INSV)在西花蓟马体内的增殖规律的研究同样表明：随着西花蓟马的发育，INSV在西花蓟马体内呈指数级扩增，到成虫增加到10²拷贝/μL则开始传播病毒，但成虫体内的INSV病毒不传给子代。本试验通过实时荧光定量PCR技术，应用相对定量方法，以β-actin为对照基因，对不同虫龄体内的HCRV病毒核酸含量进行相对定量分析。明确不同虫龄蓟马体内病毒核酸含量是逐步增加的。但是是否能够将病毒传给子代，并没有在本研究中进行验证。