脾虚证是一种全身性的病理状态，影响多个脏器，是临床上较为常见的消化道疾病。中医藏象学说是以五脏为中心的系统学说，其中脾的概念不只包括解剖学上脾或者胰腺，更是涵盖了以胃、十二指肠、空肠和回肠等消化系统在内的一个综合系统^[1]。“脾主运化”的功能提示了脾系统与小肠的消化和吸收功能密不可分^[2]。临床上，相当一部分免疫及消化功能尚不完善的幼犬、病后初愈犬和年老体衰犬患有脾虚泄泻证。

四君子汤出自宋代医学著作《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓和炙甘草4味中药组成。作为经典的补脾益气方剂，四君子汤具有抗衰老、抗肿瘤和促进代谢等作用^[3]。现代药理学研究多着重于其增强机体免疫、调节胃肠活动、胃肠激素、修复胃肠黏膜损伤和促进消化吸收等方面^[4]。本试验中加味四君子汤由四君子汤、神曲、山楂、黄芪等中药按一定比例组成。神曲主要成分为挥发油、维生素B和脂肪油等酵母制剂，此外还含有大量Zn、Fe和Cu等微量元素，能利用氧化供能，促进机体消化吸收，利用食物中蛋白质，引起增进食欲、促进消化等多重功效^[5]。山楂具有消食健胃、行气散瘀和化浊降脂之功效，在心脑血管系统、消化系统及糖代谢等方面均具有较强的药理作用^[6]。黄芪具有补气升阳、生津养血、行滞通痹、托毒排脓和敛疮生肌的功效^[7]。本课题组前期的研究表明：加味四君子汤方剂能提高脾虚犬消化吸收功能，增强免疫力，改善脾虚犬全身机能状态^[8]。本试验进一步研究该加味四君子汤对脾虚犬小肠形态学结构以及小肠表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)表达的影响，探讨加味四君子汤对脾虚犬消化吸收功能的作用及其机理。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验用比格犬由南京亚东实验动物研究开发中心提供。

番泻叶、党参、白术、茯苓、炙甘草、神曲、山楂和黄芪等中药材购自合肥立方大药房。苏木素、伊红购自南京建成生物有限公司。TRIZOL购自Invitrogen公司。无水乙醇、异丙醇购自无锡展望化工他有限公司。DEPC 水购自MDL公司。UltraPure Agarose、SuperScript Ⅲ RT 反转录kit和Sybr qpcr mix购自ABI-invitrogen公司。96孔板、ep管和枪头购自abi公司。

XN-TN50中药提取设备购自合肥小牛轻工械有限公司，核酸浓度测定仪购自THERMO公司，qPCR仪 购自Applied biosystems (USA)公司，微量移液器购自Eppendaorf，TGL-18R台式高速离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司，超净工作台购自苏州智净净化设备有限公司，电泳仪、凝胶成像仪购自biorad公司。

1.2   中药制备

1.2.1   番泻叶

根据文献[9]，取番泻叶20 kg，加10倍量沸水浸泡10 min过滤，将滤液在75 ℃水浴中蒸发浓缩为1 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2   加味四君子汤

根据文献[10]，将党参、白术、茯苓、甘草、黄芪和山楂等中药按一定比例先用水浸泡2 h，再一起在水中煎沸2次，每次40 min，合并滤液，80 ℃常压浓缩为1 g/mL的药液，4 ℃保存备用。

1.3   试验动物分组与模型建立

选取24只1岁龄比格犬，体重10.5~11 kg，正常饲养观察7 d，进行常规免疫与驱虫，确定为健康犬后用于试验。

将24只犬随机分为4组，即对照组、脾虚组、自然恢复组、中药恢复组，每组6只。对照组饲喂基础饲粮。脾虚组、自然恢复组和中药恢复组以6 mL/kg的番泻叶灌喂，上、下午各1次，饲粮照常。当造模犬表现出大便溏泄、食少纳滞、消瘦、体重减轻、神态萎靡、毛色无光泽等症状，符合“中医脾虚证参考标准”和“造模脾虚型标准”，即判定试验犬出现中医脾虚证候。将脾虚组犬颈动脉放血致死进行剖检，余下对照组、自然恢复组饲喂基础饲粮，中药恢复组在饲粮中添加2%加味四君子汤。14 d后，全部犬放血致死进行剖检。

1.4   样品采集

将试验犬放血处死后，采用外科手术的方法打开腹腔，迅速取出十二指肠、空肠、回肠和直肠各约2 cm。各段采样位置：十二指肠，距幽门2~5 cm处采集；空肠，整个空肠中段处采集；回肠，距回盲口处3~5 cm处采集；直肠，大肠末端长约15~16 cm处，位于小骨盆内。十二指肠、空肠、回肠组织采集后，取各肠段1 cm生理盐水冲洗干净，分别放入10%中性甲醛和4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续横断切片，厚5 μm，进行常规HE染色和免疫组化。同时选取部分十二指肠、空肠、回肠组织，修整组织块的大小并迅速放入冻存管中，置于液氮中速冻，−80 ℃冷冻保存，用于测定小肠组织EGF的mRNA相对表达量。

1.5   测定指标及方法

1.5.1   小肠组织形态学观察

常规HE染色，中性胶封片。光镜下详细观察和比较各组肠绒毛和隐窝形态结构变化情况，并利用Proplus照相处理软件测量肠绒毛长度和隐窝深度，每个肠管取2张切片，每张切片选取3个最长绒毛长度最深隐窝深度进行测量。

1.5.2   小肠各段EGF蛋白表达的检测

采用常规免疫组化的方法检测小肠组织EGF表达量，同时设置阴性对照，以PBS替代一抗、二抗，试验结束后用光镜对免疫组化肠道进行拍照，同一组织选择3个视野，应用Image-Pro Plus6.0图像分析系统对图片进行分析统计，结果以平均光密度值表示。

1.5.3   小肠各段EGF的mRNA相对表达量检测

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表  1  用于PCR扩增的引物序列

Table  1.  Primer sequence for PCR amplification

引物 primer	引物序列 (5′→3′) primer sequence	扩增片段长度/bp amplification size
actin-F	TGTGTTATGTGGCCCTGGAC	164
actin-R	TTCCATGCCCAGGAAGGAAG
EGF-F	TATTGCAACAAAGGGCCCCA	182
EGF-R	AGGACCCTGGGTTGGTGATT

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1.6   数据处理

采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)，以Duncan 氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。

2.   结果与分析

2.1   犬小肠黏膜的变化

对照组小肠各段肠黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则。脾虚组小肠各段出现弥漫性的肠道黏膜充血、水肿，并有大量黏液渗出。自然恢复组小肠各段部分肠黏膜充血并伴有轻微水肿。中药恢复组肠黏膜正常，无可见病变。

2.2   加味四君子汤对脾虚犬小肠组织形态的影响

由HE染色结果(图1)可见：对照组肠绒毛密度高，粗细均匀且排列整齐。脾虚组绒毛稀疏，变短且部分裸露固有层。自然恢复组绒毛密度低，绒毛变短。中药恢复组绒毛密度部分缺损，整体尚可，排列整齐。

图  1  犬小肠组织(HE染色，×400)

注：A. 对照组；B. 脾虚组；C. 自然恢复组；D. 中药恢复组；1. 十二指肠；2. 空肠；3.回肠。

Figure  1.  The small intestine tissues of canine (HE staining, ×400)

Note: A. control group; B. splenic asthenia group; C. natural recovery group; D. Chinese medicine recovery group; 1. duodenum; 2. jejunum; 3. ileum.

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2.3   加味四君子汤对脾虚犬小肠绒毛长度的影响

由图2可知：十二指肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组显著高于脾虚组(P<0.05)，中药恢复组极显著高于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组极显著高于自然恢复组(P<0.01)。空肠与回肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组显著高于脾虚组(P<0.05)，中药恢复组极显著高于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组显著高于自然恢复组(P<0.05)。

图  2  加味四君子汤对脾虚犬小肠绒毛长度、隐窝深度、V/C值和EGF水平的影响

注：同一组织不同处理组相比，图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Figure  2.  Effects of supplementary Sijunzi decoction on the villus length, crypt depth, V/C and EGP protein expression in small intestine of canines with splenic asthenia

Note: Among different groups in the same tissue, different small letters indicate significant difference at P<0.05 levels, while different capital letters indicate significant difference at P<0.01 levels.

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2.4   加味四君子汤对脾虚犬小肠隐窝深度的影响

由图2可知：十二指肠、回肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著高于对照组(P<0.01)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组、中药恢复组均极显著低于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组显著低于自然恢复组(P<0.05)。空肠中，脾虚组极显著高于对照组(P<0.01)，自然恢复组显著高于对照组(P<0.05)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组、中药恢复组均极显著低于脾虚组(P<0.01)；自然恢复组、中药恢复组相比无显著差异(P>0.05)。

2.5   加味四君子汤对脾虚犬小肠V/C值的影响

由图2可知：十二指肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组显著低于对照组(P<0.05)；自然恢复组显著高于脾虚组(P<0.05)，中药恢复组极显著高于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组极显著高于自然恢复组(P<0.01)。空肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组显著高于脾虚组(P<0.05)，中药恢复组极显著高于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组显著高于自然恢复组(P<0.05)。回肠中，脾虚组、自然恢复组均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组显著低于对照组(P<0.05)；自然恢复组、中药恢复组均极显著高于脾虚组(P<0.01)；中药恢复组极显著高于自然恢复组(P<0.01)。

2.6   加味四君子汤对脾虚犬小肠EGF表达的影响

IHC检测结果(图3)显示：棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色。试验犬各肠段均有EGF蛋白表达，阳性产物主要分布在肠绒毛两侧以及肠腺周围。

图  3  犬小肠免疫组化图片(免疫组化，×400)

注：Y. 阴性对照；A. 对照组；B. 脾虚组；C.自然恢复组；D.中药恢复组；1.十二指肠；2. 空肠；3. 回肠。

Figure  3.  Immunohistochemical photograph of EGF in small intestine of canines (IHC, ×400)

Note: Y. negative control; A. control group; B. splenic asthenia group; C. natural recovery group; D. Chinese medicine recovery group; 1. duodenum；2. jejunum; 3. ileum.

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由图2可知：各肠段中，脾虚组、自然恢复组EGF表达水平均极显著低于对照组(P<0.01)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)。自然恢复组、中药恢复组均极显著高于脾虚组(P<0.01)。中药恢复组极显著高于自然恢复组(P<0.01)。

2.7   加味四君子汤对脾虚犬小肠EGF的mRNA表达量的影响

由表2可知：十二指肠中，脾虚组、自然恢复组均显著低于对照组(P<0.05)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组与脾虚组无显著差异(P>0.05)，中药恢复组显著高于脾虚组(P<0.05)；自然恢复组与中药恢复组无显著差异(P>0.05)。空肠、回肠中，脾虚组、自然恢复组均显著低于对照组(P<0.05)，中药恢复组与对照组无显著差异(P>0.05)；自然恢复组与中药恢复组、脾虚组均无显著差异(P>0.05)。

表  2  脾虚犬小肠EGF的mRNA相对表达量

Table  2.  Relative expression levels of EGF mRNA in small intestine of canines with splenic asthenia

肠段 section	对照组 control group	脾虚组 splenic asthenia group	自然恢复组 natural recovery group	中药恢复组 Chinese medicine recovery group
十二指肠duodenum	3.563±2.696 a	1.18±0.835 c	1.373±0.707 bc	3.402±2.008 ab
空肠jejunum	2.719±2.047 a	0.757±0.606 b	1.039±1.000 b	1.961±1.419 ab
回肠ileum	3.607±2.874 a	0.923±0.644 b	1.426±1.461 b	2.665±0.616 ab
注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 Note: Different small letters in the same rows indicate significant difference at (P<0.05) levels.

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3.   讨论

脾主运化水谷精微，即完成对饮食物的消化和吸收。《黄帝内经•灵兰秘典论》有云：“小肠者，受盛之官，化物出焉。”可见在中医以消化吸收为主功能的脾系统中，小肠的功能是包含其中的^[11]。小肠是营养物质消化和吸收的主要场所，脾虚组犬小肠各段出现弥漫性的肠道黏膜充血、水肿，并有大量黏液渗出。小肠表面积的大小则直接反映小肠吸收功能，绒毛和隐窝的形态特征是反映上皮细胞的成熟度及吸收功能的最常用指标，绒毛越长，隐窝越浅，表明肠道消化吸收营养物质的能力越强^[12]。V/C值则是小肠功能状态的一种反映，比值与黏膜状态成正比^[13]。故在本试验中以肠绒毛长度、隐窝深度和V/C值来衡量加味四君子汤对脾虚犬小肠黏膜的影响。结果发现：番泻叶诱导脾虚犬与对照组相比小肠绒毛长度极显著下降，隐窝深度极显著升高且极V/C值显著降低。但经过加味四君子汤治疗后，试验犬上述各项指标基本恢复到对照组水平。研究表明：四君子汤内含有多种抗氧化成分，能消除细胞组织的各类氧化损伤，维持生物膜正常结构和功能^[14]。YU等^[15]通过研究家兔肠梗阻模型发现：四君子汤治疗能降低肠道黏膜CD3⁺、CD8⁺T细胞百分率，升高CD4⁺T细胞数量，从而调节适应性免疫反应。且四君子汤中的甘草黄酮提取物可促进小肠隐窝上皮细胞IEC-6迁移，影响细胞内多胺调控信号通路，有助于胃肠黏膜损伤的修复^[16]。本研究通过对服用加味四君子汤治疗后的脾虚犬肠绒毛、隐窝及V/C值测量分析，结果表明加味四君子汤具有保护和修复小肠形态结构的作用，从而改善脾虚犬部分病理症状。

犬表皮生长因子EGF主要由颌下腺合成分泌^[17-18]，肾脏、胰脏、肝脏、乳腺和十二指肠Brunner腺等组织器官中也能合成并分泌，具有促细胞生长、细胞迁移、细胞增殖、伤口愈合及营养物质转运等生物学功能^[19-21]。研究表明：EGF的信号传导可调节肠道上皮细胞的增殖和生存^[22]、肠黏膜形态结构、刷状缘组织中消化酶活性变化^[23]，还可调节肠道消化腺的分泌，刺激黏膜增生，影响营养物质的吸收与转运，在维持动物肠道健康中发挥重要的生物学功能^[24]。EGF阳性细胞多呈圆形或椭圆形，阳性蛋白在肠绒毛两侧及肠腺周围分布。本试验在脾虚证犬饲料中添加加味四君子汤后，通过免疫组化研究发现：相比脾虚犬，中药治疗组犬肠绒毛顶部及肠腺周围分布的EGF蛋白含量显著增加，而自然恢复组增加不明显；通过荧光定量PCR检测结果也证实，在转录水平上中药恢复组EGF的mRNA的含量明显增加。两种检测结果基本一致，说明加味四君子汤能提高犬体内EGF的表达水平，从而保护肠上皮细胞，促进黏膜修复。

4.   结论

番泻叶可诱导犬小肠组织形态结构发生病变，EGF蛋白表达量以及mRNA含量显著下降。加味四君子汤能够使番泻叶诱导犬脾虚证的小肠组织形态学、EGF蛋白表达量以及mRNA相对表达量恢复正常，对犬脾虚证有明显的治疗效果。