肌肉发育和肉质是肉牛最重要的经济指标，因此，受到世界各国肉牛育种工作者和遗传学家的广泛关注，寻找调控肌肉发育和肉质的关键基因一直是研究的热点之一。肌肉组织含有大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分，ECM既是肌肉组织的基本结构蛋白，又对肌成纤维细胞^[1]、肌内脂肪细胞^[2]的增殖和分化起重要的调控作用，成为影响肌肉发育和肉质的因素之一。组成ECM的蛋白有300多种，其中大部分蛋白具有很高的分子量^[3]。TNC (Tenascin-C)是构成ECM的一种糖蛋白^[4]，牛TNC基因位于8号染色体上，由30个外显子和29个内含子组成，基因组序列长度超过92 kb。多数细胞外基质蛋白的组织表达谱很广泛，但TNC基因的组织表达谱很有限，有些只在特定的发育时期表达^[5]。目前发现的Tenascins基因家族有4个成员，但每个基因成员在动物体内的表达模式不同，其中TNR (Tenascin-R)在中枢神经系统中特异表达；TNC的表达范围较广泛，而且受到许多外界因素的调控，如生长因子、细胞因子、机械应力等；TNX (Tenascin-X)是结缔组织的成分之一，其表达水平受外界环境因素的影响很小；TNW (Tenascin-W)的表达模式与TNC类似，只是表达的组织范围更狭窄^[6]。TNW和TNC基因的启动子区域都有TATA-Box，这可能是造成其具有较高表达量的原因^[7]。TNC基因特殊的表达模式及其对ECM独特的调控作用使其受到广泛的关注，课题组前期研究也表明，细胞外基质对肌肉发育和肉质具有重要的影响^[8-9]。本研究利用qRT-PCT技术分析了TNC基因在牛背最长肌(longissimus dorsi muscle)发育过程中的表达变化和TNC基因表达水平与肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量的关系，进一步利用柠檬苦素干扰牛前体脂肪细胞的增殖和分化，分析了在此过程中TNC基因的表达变化，以期为更深入地分析TNC基因在脂肪沉积过程中的生理功能提供更丰富的理论知识。

1.   材料与方法

1.1   样品的采集

选择健康、发育正常的3、6、12、18、24和30月龄的南阳牛各4头，在无菌条件下分别采集背最长肌组织，立即投入液氮中保存，以备分析肌肉发育过程中TNC基因表达变化。

另选择24头2岁左右的南阳牛与夏洛莱F₁代杂交牛，在无菌条件下分别采集背最长肌组织，一部分立即投入液氮中保存，以备分析TNC基因在肌肉组织中的表达情况；另一部分肌肉组织样品真空独立包装后置于4 ℃冰箱保存，以备进行肌内脂肪含量的测定。

1.2   肉质性状指标的测定

背最长肌分离后去除表面脂肪，装入塑料袋并包扎好置于4 ℃冰箱，进行48 h排酸处理，之后取出肉样，采用索氏抽提法进行脂肪含量的测定。根据测定的脂肪含量将肌肉组织样品进行排序，利用四分位法将脂肪含量最高的25%个体(n=6)作为高IMF组；脂肪含量最低的25%个体(n=6)作为低IMF组。

1.3   牛前体脂肪细胞的分离、诱导分化和柠檬苦素处理

无菌条件下采集牛皮下脂肪组织块，放置于37 ℃无菌保温盒中带回实验室。牛前体脂肪细胞的分离参照徐铁山等^[10]的方法进行。选择生长状态良好的传代细胞以1×10⁵ mL⁻¹ 的密度接种于12 孔培养板中，待细胞生长至80%汇合时进行诱导分化培养。此时将完全培养基更换为基础分化培养基 [含胰岛素(INS)10 μg/mL、地塞米松(DEX) 1.0 μmol/L、L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX) 0.5 mmol/L] 培养2 d，然后更换为诱导分化培养基(含胰岛素10 μg/mL)培养2 d，之后更换为完全培养基，每2 d换培养基1次，直至细胞浆中出现明显的脂质液滴形成。药物干预和更换培养液同步进行，传代于12孔培养板的细胞生长汇合至70%~80%时记为0 d，之后分别用诱导分化培养基(对照组)和添加2 μmol/L柠檬苦素的诱导分化培养基(处理组)培养^[11]，分别收集培养0、6、12、18 h和1、1.5、2、4、6、8、10、12 d的细胞样品，置于液氮中保存备用。

1.4   油红O染色

培养细胞经4%多聚甲醛固定2 h，PBS和蒸馏水分别洗3次，用1%油红O染色液染色30 min，然后用蒸馏水漂洗干净，倒置显微镜下观察并拍照保存。

1.5   总RNA的提取及检测

用Takara公司的RNAiso plus试剂盒提取各组织、细胞样品的总RNA。利用Nanodrop 2000测定总RNA的纯度和质量浓度，用DEPC处理的双蒸水稀释至1 μg/μL备用。

1.6   候选基因的qRT-PCR分析

分别取均质后的总RNA 1 μL为模板，用Takara公司的PrimeScript^TM 1^st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第1链，以此为模板，用Takara公司生产的SYBR® Premix Ex Taq^TM II试剂盒进行荧光定量分析(CFX Connect^TM Real Time PCR Detection System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。总的反应体系为20 μL，其中，模板cDNA第1链1 μL，10×SYBR® Premix Ex Taq^TM 2 μL，上、下游引物各0.7 μL，ddH₂O 7.6 μL。反应程序为95 °C预变性1 min；然后94 °C变性30 s，退火30 s，72 °C延伸30 s，42个循环。对所有样本进行4个重复测定，并在每次试验时设阴性对照。引物序列信息见表1。

表  1  荧光实时定量PCR分析的引物信息表

Table  1.  The information of primers for real time PCR analysis

基因名称gene name	模板序列template sequence	引物序列(5′→3′) primer sequence	退火温度/℃ annealing temperature
TNC	NM_001078026.2	GCCTGAAGAGAGTGACAACT	58
		GATCGATGCTGGTACGATCT
GAPDH	NM_001034034.1	ATGCTGGTGCTGAGTATGTG	54
		GAAGTTACGGCTATCTGTCG

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1.7   基因表达数据分析

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2.   结果与分析

2.1   TNC基因在牛肌肉发育过程中的表达变化

由图1可知：TNC基因在3~12月龄期间的牛背最长肌组织中的表达水平比较恒定；从18月龄开始，TNC基因的表达水平显著上升。通常牛肌内脂肪的沉积也是从18月龄开始逐渐增加的^[12]，故说明TNC基因的表达与肌内脂肪的沉积调控有关。

图  1  TNC基因在牛背最长肌组织发育过程中的表达变化

注：相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著 。

Figure  1.  The expression pattern of TNC gene during the development of longissimus dorsi muscle in cattle

Note: The same letter means no significant difference, different letters indicate significant differences.

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2.2   TNC基因在不同脂肪含量的肌肉组织中的表达

根据索氏抽提法测定的脂肪含量结果：高IMF组的平均脂肪含量为(2.69±0.51)%，极显著高于低IMF组的(1.08±0.16)%的脂肪含量(t=7.424，P=0.000)。但TNC基因表达分析表明：高脂肪组和低脂肪组肌肉组织中TNC基因的表达水平没有显著的差异(t=1.97，P=0.077)(图2)。

图  2  TNC基因在不同肌内脂肪含量的背最长肌组织中的表达情况

Figure  2.  The expression of TNC in longissimus dorsi muscle with different IMF content

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2.3   TNC基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化

由图3可知：诱导分化后的第6小时TNC基因的表达量急剧升高，之后快速下降，出现明显的表达高峰。在诱导分化后期，随着细胞质中脂质液滴的累积，TNC基因的表达水平再次升高。

图  3  TNC基因在牛前脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化

注：“*”表示差异显著；“**”表示差异极显著。

Figure  3.  The expression pattern of TNC gene during the induced differentiation process of bovine preadipocytes

Note: “*” indicate significant difference; “**” indicate extremely significant difference.

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2.4   柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化及TNC基因表达的影响

添加2 μmol/L柠檬苦素能够明显抑制牛前体脂肪细胞的分化，导致成熟脂肪细胞中脂质液滴的沉积减少(图4)。基因表达分析表明：在诱导分化的第6小时，TNC基因的表达出现高峰，此时添加柠檬苦素的处理组其TNC基因的表达水平显著低于对照组(P<0.05)(图3)，说明柠檬苦素抑制牛前体脂肪细胞的分化与TNC基因表达量的下降有关。进一步的分析表明：在诱导分化的后期(第10和12天)，处理组TNC基因的表达水平极显著低于对照组(P<0.01)(图3)，说明柠檬苦素降低成熟脂肪细胞中脂质沉积与TNC基因表达水平的极显著下调有关。

图  4  柠檬苦素对成熟脂肪细胞中脂质液滴积累的影响

注：箭头指示的为细胞中的脂质液滴。

Figure  4.  Effects of limonin on lipid droplets accumulation in mature adipocytes

Note: The granular material pointed by arrow means lipid droplets in adipose cell.

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3.   讨论

3.1   TNC基因表达与肌肉组织发育的关系

TNC是一种细胞外基质糖蛋白，能够与整合素配体(integrin ligands)和纤连蛋白—整合素复合体相互作用，共同调节细胞的黏附、迁移、增殖和分化过程^[13]。动物出生后的肌肉发育主要涉及肌肉卫星细胞和肌内脂肪细胞的增殖、分化和迁移等过程，TNC必然发挥着重要作用。TNC基因在胚胎期高表达，在成年动物体内其表达量受到抑制，但是在组织受伤后的愈合期间表达量升高^[13]。此外，TNC基因的表达变化常常与胚胎发育过程中的器官形成和形态变化有关^[14]。在神经组织中，TNC由胶质细胞合成并分泌到细胞外，目前还不清楚肌肉组织中的TNC来源于哪类细胞。本研究发现：TNC基因在24月龄和30月龄的背最长肌组织中表达量升高，此时正是肌内脂肪积累旺盛的时期，其高表达可能与此过程有关。前人研究表明：限饲能够明显降低鸡腹脂的量，同时引起TNC基因表达量显著下降，因此，限饲影响鸡生长发育和脂肪沉积很有可能是通过调控TNC等基因的表达实现的^[15]。TNC基因在不同发育阶段的鸡脂肪组织中的表达量也表现出规律性的变化，表明该基因的表达也受到日龄因素的影响。

脂肪组织是动物体最主要的能量储存库，对动物的生产性能和肌肉的品质都有重要的影响，尤其是肌内脂肪的含量和分布是评价牛肉质性状的关键指标。目前尚没有TNC基因影响肉质指标的研究报道。本研究也发现：TNC基因的表达水平在高肌内脂肪含量组和低肌内脂肪含量组之间差异不显著，这种情况有可能与采集组织样本有关，因为肌肉组织内的脂肪分布是不均匀的。另外，许多研究报道指出细胞外基质成分对肌内脂肪的含量和分布有影响^[16-17]，因此也不排除TNC通过间接作用影响肌内脂肪的含量和分布。

3.2   TNC对脂肪细胞增殖分化的影响

TNC是成熟脂肪细胞的细胞外基质的重要组成部分，通过与胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin)、periostin、肌原纤维蛋白2 (fibrillin-2)等其他细胞外基质成分交联结合，组成复杂的网络结构，增加细胞外基质的韧性和稳定性，保护成熟脂肪细胞免受外界应力的伤害^[4]。本研究发现：TNC基因在脂肪细胞中具有很高的表达量。成熟脂肪细胞外面包裹着一层厚厚的细胞外基质成分，这些细胞外基质成分对成熟脂肪细胞的生存是必需的，因为成熟脂肪细胞里有1个储存甘油三酯的巨大液滴，几乎充满了整个细胞质，外界的机械应力很容易导致成熟脂肪细胞破裂，而厚厚的细胞外基质成分则可以有效地保护成熟脂肪细胞对抗外界机械应力的伤害^[18]。本研究发现：TNC基因在脂肪细胞诱导分化的后期表达水平升高，此时也是细胞质中脂质液滴开始大量积累的时候，这可能与加强细胞外基质强度以保护细胞稳定性有关。包围在成熟脂肪细胞外围的细胞外基质成分大部分是由脂肪细胞自身合成并分泌的，但也有少部分来自于混入脂肪细胞中的上皮细胞、单核细胞以及少量的多能干细胞^[19]。本研究在体外培养的脂肪细胞中检测到TNC基因的表达，而且在诱导分化开始后的短时间内具有很高的表达水平，说明脂肪细胞具有独立合成TNC蛋白的能力。

柠檬苦素是存在于芸香科和楝科植物中的一类含呋喃环的四降三萜类天然化合物，具有抗菌、消炎、抑制癌细胞生长等多种生物学活性^[20]。本研究发现：柠檬苦素还能够干扰前体脂肪细胞的分化，进而影响成熟脂肪细胞中脂质的沉积，这与KABLAN等^[11]的研究结果一致。基因表达分析发现：诱导分化开始后的第6小时TNC基因的表达水平急剧上升，此时正是细胞贴壁生长的关键时期，TNC具有促进细胞黏附的作用，该基因的高表达可能与促进细胞贴壁生长有关^[21]。在前体脂肪细胞诱导分化的后期TNC基因的表达量上升，此时细胞质中脂质液滴的体积快速增大，需要细胞外基质进行相应的重构和调整，TNC同细胞外基质中的其他蛋白多糖和蛋白酶一样参与了细胞外基质的重构过程^[22]。这些研究表明TNC对脂肪细胞的增殖、分化和脂质沉积起着一定的调控作用。