干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响
Effect of Interfering with E2F7 on the Proliferation of C2C12 Myoblasts
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Keywords:
- E2F7 /
- C2C12 myoblasts /
- proliferation /
- siRNA /
- skeletal muscle development
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畜禽肠道的黏膜屏障系统易受环境尤其是热应激的破坏，对于匮乏散热系统、高温调节能力较差的家禽更是如此。肠黏膜屏障由生物屏障、免疫屏障、机械屏障和化学屏障组成，机械屏障是肠黏膜防御系统中最重要的一环[1]，而肠道肠黏膜机械屏障的结构基础是黏膜上皮细胞之间的紧密连接又称封闭小带。紧密连接的物质基础是高浓度的跨膜蛋白，主要是闭合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)及外周胞浆蛋白(ZO)[2]。其中Claudin与Occludin是整体膜蛋白，对肠黏膜屏障功能的维持和紧密连接的完整性有重要作用，并且occludin的下调易引起肠道通透性的增加[3]。ZO的异构体ZO-1、ZO-2能与Occludin和肌动蛋白骨架(actin)连在一起形成稳定的连接系统，是紧密连接的重要组成部分，ZO-1对紧密连接功能具有重要意义，所以ZO-1可作为机械屏障功能完整性的指标[4]。动物遭受热应激时，体表及心脑血管血流量增加以增强体内热量辐射扩散，从而导致肠道血流量减少，发生缺血缺氧，进而引起无氧代谢发生，肠道乳酸堆积，上皮黏膜水肿，甚至出现黏膜层断裂和脱落等症状，导致肠道通透性急剧增加，内毒素移位，破坏肠黏膜的屏障功能[5-7]。
近年研究发现：热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)可减轻肠黏膜上皮细胞应激损伤，降低肠道通透性，缓解机体肠道应激状态[8-10]。而谷氨酰胺(glutamine，Gln)被证实可特异性诱导HSP70的表达，但通过Gln诱导HSP70上调表达以保护畜禽肠道黏膜屏障的研究尚不多见。本试验拟通过以Gln为诱导剂，诱导吉林白鹅HSP70的上调表达，研究热应激条件下模型动物肠血液指标、肠道通透性、肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin和ZO-1的表达变化，进而探究Gln介导HSP70对鹅的热应激反应及肠道上皮黏膜屏障的保护作用。从理论上阐明Gln介导HSP70保护热应激鹅肠黏膜机械屏障的作用机制，还可为研发安全、高效的抗应激制剂提供理论与试验依据。
1. 材料与方法
1.1 试验动物的选择与试验设计
选取健康1日龄吉林白鹅180只，随机分为3个处理组，分别为适温组(CON)、热应激组(HS)和谷氨酰胺组(GLN)，每组6个重复，每个重复10只鹅，饲养于环控仓内，自由采食及饮水。随日龄的增长，逐渐将饲养温度调节至22 ℃±1 ℃。待饲养至69日龄时，CON组及HS组分别腹腔注射生理盐水，GLN组注射Gln注射液，注射剂量均为0.75 g/kg (bw)；注射24 h后HS组和GLN组进行4 h的急性热应激处理 (40 ℃±1 ℃，相对湿度65%)，CON组仍置于22 ℃±1 ℃条件下。试验鹅只按正常免疫程序进行免疫接种。
1.2 样品采集
热应激结束后，每个重复随机选取3只鹅处死，分别用促凝管与抗凝管收取动脉血，制备血清和血浆，−20 ℃保存待测。取血后迅速取出肠段，用载玻片刮取空肠黏膜于冻存管中，液氮速冻保存，后转移至−80 ℃待测。
1.3 血液指标测定
血清指标：LDH、CK、T3、T4和CORT；血浆指标：DAO、DLA。其中CK、LDH利用全自动生化分析仪进行测定(Beckman Coulter，美国)，T3、T4利用全自动化学发光免疫分析仪进行测定(Beckman Coulter，美国)，CORT、DAO、DLA利用酶标仪进行测定(BioTek，美国)。以上试剂盒除CORT、DAO、DLA购自南京建成生物工程研究所以外，其余购自美国Beckman Coulter有限公司，具体操作按照说明书进行。
1.4 空肠上皮黏膜HSP70及紧密连接相关基因的表达水平测定
以GAPDH为内参基因，参照GenBank中鹅HSP70、Occludin、Claudin 1和ZO-1基因的mRNA序列，运用Primer Premier 5.0设计引物，NCBI BLAST分析引物特异性，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司负责引物的合成。所有引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences基因gene 基因ID gene ID 引物序列primer sequence 产物/bp product size HSP70 NM_198892.1 F: 5'-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3' 335 R: 5'-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3' Occludin XM_013199669.1 F: 5'-ACAGCAGCAGCACTTACCTCAAC-3' 109 R: 5'-AGGCAGAGCAGGAGGACGATG-3' Claudin 1 XM_013199194.1 F: 5'-GACCAGGTGAAGAAGATGCGGATG-3' 107 R: 5'-CGAGCCACTCTGTTGCCATACC-3' ZO-1 XM_013177404.1 F: 5'-GAGCCTTCAGACCATTCCAGACATTC-3' 155 R: 5'-TCGCCTGCCACCTCTTCCATAG-3' GAPDH XM_013199522.1 F: 5'-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3' 179 R: 5'-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3' 注：F. 正向引物；R. 反向引物。
Note: F. forward primer；R. reverse primer.取适量样品于研钵中用液氮研磨处理，按照Trizol试剂(Invitrogen，美国)说明书进行总RNA的提取。利用微量紫外分光光度计(Thermo Nano Drop2000，美国)检测总RNA的浓度及纯度。所有OD260 nm/OD280 nm值为1.8~2.0的样品进行反转录。按照PrimerScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Japan)说明书将样品反转为cDNA，用普通PCR仪进行样品反转录，反转条件：30 ℃ 15 min反转录反应，85 ℃酶失活5 s，4 ℃结束。
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1.5 空肠上皮黏膜HSP70及紧密连接相关蛋白的表达水平测定
取一定量的组织样品用液氮研磨转移至离心管，加入RIPA裂解液(康为世纪，中国)与一定量的蛋白酶抑制剂提取总蛋白，用BCA定量试剂盒(Thermo，美国)测定样品总蛋白浓度。用蛋白免疫印迹法(Western-blot)测定相关蛋白表达水平。利用Kodak Molecular Imaging Systems进行图像采集，Quality One软件进行蛋白灰度值分析，蛋白相对表达用“目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值”表示。
1.6 数据统计分析
试验数据采用IBM SPASS Statistic 19进行单因子分析，用Duncan’s法进行多重显著性比较分析，结果用“平均值±标准差(mean±SD)”表示。
2. 结果与分析
2.1 Gln对热应激吉林白鹅血液指标的影响
由表2可知：Gln可有效缓解热应激对吉林白鹅血液指标的影响。热应激所致的CK、LDH、T4、CORT、DAO和DLA水平显著升高，在腹腔注射Gln后均又显著下降。其中DAO和DLA恢复到了对照组水平。
表 2 Gln对热应激吉林白鹅血液指标的影响Table 2. Effect of Glutamine on blood index of heat stressed Jilin white goose项目item CON HS GLN CK/(IU·L−1) 710.76±117.84 Aa 3813.27±153.43 Bb 1075.84±59.59 Ac LDH/(IU·L−1) 220.34±38.53 Aa 1012.4±111.4 Bb 415.97±83.2 Ac T4/(nmol·L−1) 19±1.49 Aa 56.23±1.72 Bb 38.55±0.55 Cc T3/(nmol·L−1) 2.32±0.37 Aa 2.3±0.14 Aa 3.28±0.39 Bb CORT/(ng·mL−1) 35.54±2.77 Aa 114.08±4.69 Bb 71.92±3.12 Cc DAO/(ng·mL−1) 17.92±0.58 Aa 21.21±0.64 Bb 18.31±1.5 Aa DLA/(mmol·L−1) 6.4±0.23 Aa 8.57±0.97 Ab 6.4±0.1 Aa 注：同行数据不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异性极显著(P<0.01)；下同。
Note: The difference between the lowercase letters of the peer data were significant (P<0.05), and the difference between the uppercase letters were extremely significant (P<0.01); the same as below.2.2 Gln对热应激吉林白鹅空肠HSP70及紧密连接相关基因mRNA相对表达量的影响
如图1所示：热应激处理后空肠HSP70 mRNA表达量显著升高(P<0.01)，注射Gln后进一步诱导了HSP70 mRNA的高表达(P<0.01)；与对照组相比，热应激处理显著降低了Claudin 1、Occludin和ZO-1的mRNA表达(P<0.01)，但注射Gln可显著提高上述紧密连接相关基因的表达水平(P<0.01)。
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图 1 基因mRNA相对表达量注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；下同。Figure 1. Relative expression of mRNA geneNote: Different lowercase mean significant different (P<0.05), different capitals mean extremely significant difference (P<0.01); the same as below.2.3 Gln对热应激吉林白鹅空肠HSP70及紧密连接相关蛋白相对表达水平的影响
由图2、3可见：HSP70和紧密连接蛋白Claudin 1、Occludin和ZO-1蛋白水平上的表达情况与基因表达的规律一致。Gln可诱导热应激鹅HSP70蛋白高表达(P<0.01)，也可显著提高因热应激而显著下降的紧密连接蛋白Claudin 1、Occludin、ZO-1的蛋白表达水平(P<0.01)。
3. 讨论
动物血液指标是动物体内物质代谢及组织器官生理机能状况的重要判断指标[11]。CK是一种器官特异性酶，是主要存于心肌及骨骼肌的细胞内酶，CK含量的增加反映应激对一些组织细胞的损伤程度[12]。LDH是糖代谢中丙酮酸无氧酵解为乳酸的催化酶，血液中LDH浓度升高说明热应激时机体无氧酵解过程加强[13]。白丹丹等[14]、钟光等[15]报道热应激导致机体细胞膜受损，无氧代谢增强，血液中CK、LDH浓度升高。DAO、DLA是反应肠黏膜屏障系统完整性的重要标志物，DAO是肠黏膜上皮绒毛细胞中的一种细胞内酶，DLA是肠道细菌的代谢产物，肠道通透性增加会直接引起血液中DAO和DLA含量升高[16-17]。马燕芬等[18]研究表明热应激会导致奶山羊瘤胃黏膜屏障功能受损，通透性增加，增强血液中DAO和DLA活性水平。热环境会引起机体下丘脑—肾上腺皮质轴兴奋，改变血液中CORT、T3、T4活性以调节机体代谢。仲庆振等[19]、王玲等[20]发表的文献中报道高温条件下，动物血液中T3、T4出现下调趋势。本研究发现：经热应激处理后，鹅血液中CK、LDH、T4、CORT、DAO和DLA水平均显著升高，但T3水平未表现出显著变化。鹅注射Gln可显著降低鹅血液中CK、LDH、T4、CORT、DAO和DLA的水平，但未能恢复至对照组水平。由此可见，Gln作为一种抗热应激试剂可有效降低鹅血液中应激指标，调节机体代谢，缓解家禽热应激生理反应，减轻家禽组织器官热应激损伤。
上皮细胞在黏膜表层通过紧密连接、黏附连接、桥粒构建了一个选择性屏障，其功能是平衡促进相反性目标的转运及限制跨细胞间隙的自由交换[21]。紧密连接是肠道黏膜的选择性渗透屏障，代表细胞旁转运的限速步骤，在分子水平，紧密连接由紧密连接蛋白家族构成，其中一些调控细胞旁通道，另一些则搭建紧密连接支架并且填充细胞间隙[22]。紧密连接蛋白家族主要由Claudin、Occludin、连接黏附分子(junction adhesion moleucule，JAMs)及ZO组成[23]。CHEN等[24]对小鼠进行口服丙烯醛试验，其数据结果表明：丙烯醛引起Claudin 1、Occludin、ZO-1三种紧密连接蛋白水平的显著性下调与再分布，导致小鼠肠上皮屏障受损通透性增强；YAN等[25]和TURNER[26]也分别在文献中报道：病理条件下紧密连接蛋白的下调表达标志着机体肠道通透性的增加，也意味着肠道上皮黏膜屏障完整性的破坏；XING等[27]对断奶仔猪的研究表明：饲料中添加 Gln可使仔猪肠道紧密连接蛋白mRNA的表达增加，降低仔猪肠道通透性，促进仔猪肠道发育[27]；同样CHAUDHRY等[28]在对小鼠的研究中发现：Gln可以有效缓解小鼠由乙醇引起的肠道损伤，其添加可以阻断乙醇诱导的小鼠肠道远端结肠中紧密连接蛋白的缺失与重新分布；而YANG等[29]在试验中发现肠上皮屏障功能障碍与HSP70蛋白水平密切相关，其结果证实HSP70的上调表达对上皮屏障系统功能的维持具有重大意义，HSP70预处理可显著降低由于应激导致的肠道通透性增加问题；LIU等[30]也在综述中论述了HSP70通过多种生物功能改善肠道屏障功能的相关保护机制。
本研究结果显示：吉林白鹅进行热应激处理后，HSP70 mRNA和蛋白表达均显著升高，说明机体在遭受应激时会自主上调HSP70表达以缓解应激损伤，注射Gln后又进一步极显著地提高了鹅HSP70 mRNA和蛋白的表达水平，说明注射Gln可显著提高鹅的抗热应激能力。紧密连接蛋白基因Claudin 1、Occludin和ZO-1 mRNA与蛋白水平的表达趋势一致，热应激处理显著降低了上述紧密连接蛋白基因和蛋白水平的表达，但注射Gln后上述紧密连接蛋白的表达得到了显著的恢复。该结果表明：急性热应激可使吉林白鹅肠道上皮黏膜紧密连接受损，肠道通透性增加；Gln作为HSP70表达诱导剂，可在热应激条件下促使HSP70大量合成表达以行使分子伴侣生物功能，提高肠道上皮黏膜紧密连接蛋白表达水平，降低肠道通透性，保护肠道上皮黏膜屏障系统。
4. 结论
腹腔注射Gln可缓解热应激对鹅血液中CK、LDH、DAO、DLA、CORT和T4水平的影响；Gln可通过诱导热应激鹅体内HSP70的表达，改善肠道上皮黏膜紧密连接Claudin 1、Occludin和ZO-1 mRNA及蛋白的相对表达，降低肠道通透性，缓解吉林白鹅肠道应激损伤。
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图 1 E2F7在C2C12成肌细胞不同时期的表达水平
注：* P<0.05；** P<0.01；n.s. 无显著相关性；下同。
Figure 1. The expression levels of E2F7 mRNA in different phases of C2C12 myoblasts
Note: * P<0.05; **P<0.01; n.s. no significant; the same as below.
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图 2 转染不同小干扰RNA对E2F7基因的干扰效率
Figure 2. The interference efficiency of different siRNAs for E2F7
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图 3 干扰E2F7基因促进C2C12成肌细胞增殖
Figure 3. Interference E2F7 mRNA promoting C2C12 myoblasts proliferation
表 1 试验选用基因及microRNA的引物序列和退火温度
Table 1 The primer sequences and annealing temperatures
基因
gene引物序列 (5’→3’)
primer sequence退火温度/℃Tm E2F1 F：GAGAAGTCACGCTATGAAACCTC 62 R：CCCAGTTCAGGTCAACGACAC E2F2 F：ACGGCGCAACCTACAAAGAG 62 R：GTCTGCGTGTAAAGCGAAGT E2F3 F：AAACGCGGTATGATACGTCCC 62 R：CCATCAGGAGACTGGCTCAG E2F7 F：GCTTTGGGAAACTTGGGATAG 62 R：CAGTGTGGCTTCAGTCATAGA Cyclin D F：GCTTGCTCCGGGGATGAAAT 60 R：GCGAGGACACCATAAGGAAATCTG CDK4 F：AGTTTCTAAGCGGCCTGGAT 60 R：AACTTCAGGAGCTCGGTACC Cyclin E F：TAGGCCCTCAGCCTCACTC 62 R：CCACCCCTGGGATAAAGCAC GAPDH F：TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT 60 R：ATGCATTGCTGACAATCTTGAG miR-7 F：CAACAAATCACAGTCTGCCATA 60 miR-25 F：AGGCGGAGACTTGGGCAATTGC miR-27-3p F：TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC 60 miR-27-5p F：AGAGCTTAGCTGATTGGTGAAC miR-92a F：AGGTTGGGATTTGTCGCAATGCT 60 miRNA
通用下游引物R：Uni-miR qPCR Primer, included in kit
( miRNA Universal Downstream Primer,
TaKaRa)60 U6 F: CTCGCTTCGGCAGCACA 60 R: AACGCTTCACGAATTTGCGT 
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