增施不同配比解磷菌、解钾菌生物菌肥对烤烟生长发育和根际土壤酶活性的影响
The Effects of Different Ratios between Phosphate-solubilizing Bacteria and Potassium-solubilizing Bacteria Fertilizers on the Flue-cured Tobacco Growth and the Enzyme Activities in the Rhizospheric Soil
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高效液相色谱法(HPLC)被广泛运用于植物的硫代葡萄糖苷类化合物[1]、中草药有效成分[2]、茶叶中的游离氨基酸[3]、叶黄素[4]和有机酸[5-6]等成分含量的测定，且具有方法简便、数据准确和重复性好的特点，但未见有此法测定紫花苜蓿叶黄素循环组分含量的研究。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科多年生草本植物，堪称“牧草之王”，既是中国草地农业的主要作物，也是生态治理的重要草种，更是畜牧业赖以发展的物质基础[7-8]。植物在环境胁迫下各项生理活动能力都会降低，尤其是光合能力。一般情况下，植物体能够通过自身调节来避免过量光能对植物的伤害，其中植物体叶黄素循环保护机制与热耗散密切相关，是光保护的主要机制[9]。植物依靠叶黄素循环(xanthophyll cycle)进行热耗散被认为是光保护的主要途径[10]。YAMAMOT[11]提出，叶黄素循环即为叶黄素的3种组分：紫黄质(violaxanthin，V)、环氧玉米黄质(antheraxanthin，A)和玉米黄质(zeaxanthin，Z)在不同的光强和pH条件下，通过环氧和脱环氧化作用相互转化的循环机制。植物能通过叶黄素循环的热耗散，在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下，紫黄质(V)经中间物环氧玉米黄质(A)可转变成玉米黄质(Z)[12]，从而抵抗逆境对植物的伤害。本试验通过建立适合紫花苜蓿叶片中叶黄素循环组分含量测定的HPLC法，为进一步研究紫花苜蓿的耐热机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
云南野生紫花苜蓿种子是本研究团队繁殖的种子，为采自云南迪庆州德钦县奔子栏乡干热河谷地区的野生种；阿尔冈金紫花苜蓿种子引自加拿大。试验用0.1% HgCl2对2个紫花苜蓿种子消毒 30 min，然后将其置于人工气候箱中催芽24 h，白天(14 h)温度为25 ℃，夜间(10 h)温度为18 ℃。将发芽的种子种在介质为腐殖土和红土(对其进行高温高压灭菌)为2∶1的花盆中，3~4 d浇灌1次50%的Hoagland营养液，在植株高约10 cm时，选择长势较一致的幼苗，将其移栽到较大的花盆中，每个种设3个重复，每盆8株。在其生长至150 d时取成熟叶片，以HPLC法测定叶黄素循环组分。
叶黄素循环V、A和Z组分标准品购于CaroteNature公司，纯度99%。
1.2 试验方法
1.2.1 标准品溶液的配制
称取叶黄素(V)标准品0.768 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为76.8 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.076 8、0.153 6、0.307 2和1.536 0 μg/mL的溶液。称取叶黄素(A)标准品0.564 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为56.4 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.056 4、0.112 8、0.225 6和1.128 0 μg/mL的溶液。称取叶黄素(Z)标准品4.8 mg，以甲醇溶解，用容量瓶定容至10 mL，配成质量浓度为480 μg/mL的母液，再分别稀释成质量浓度为0.048 0、0.096 0、0.192 0和0.960 0 μg/mL的溶液。
1.2.2 高效液相色谱(HPLC)条件
用Agilent 1100高效液相色谱仪(美国：G1322A DEGASSER、G1311A QuatPump、G1316A COLCOM、G1315B DAD)进行测定。Agilent Hypersil ODS (4.0×250 mm，4.6 μm)色谱柱(美国)，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，体积分数线性梯度洗脱程序为90% A液 + 10% B液洗脱15 min，接着在5 min内，90% A液体积分数线性递增至100%，之后再洗脱20 min，流速1 mL/min，检测波长445 nm，柱子温度30 ℃，取10 μL样品进样到色谱仪。
1.2.3 样品液的制备
取紫花苜蓿鲜叶0.1 g，倒入液氮研磨至粉末状，加入4 mL 85%丙酮，匀浆2~3 min，再加入1 mL 100%丙酮，匀浆1 min之后置于冰上15 min，1 200 g离心10 min，取上清液用 0.45 μm微孔滤膜过滤后即得样品液，色素提取的全过程在黑暗中进行[13]。
1.2.4 标准曲线的建立
分别取10 μL质量浓度为3、10、50、100和200 μg/mL的标准品溶液，按照上述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标y，质量浓度为横坐标x，建立回归方程。
1.2.5 精密度试验
精密吸取质量浓度为1.92 μg/mL的叶黄素V标准品溶液、质量浓度为1.41 μg/mL的叶黄素A标准品溶液和质量浓度为9.6 μg/mL的叶黄素Z标准品溶液，平行测定5次，每次进样10 μL，按照1.2.2节色谱条件，测定3种叶黄素循环组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.6 稳定性试验
取质量浓度为1.92 μg/mL的叶黄素V标准品溶液、质量浓度为1.41 μg/mL的叶黄素A标准品溶液和质量浓度为12 μg/mL的叶黄素Z标准品溶液，分别在制备后的0、3、6、9、12、18和24 h进样，每次进样10 μL，按照1.2.2节色谱条件，测定3种叶黄素循环组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.7 重现性试验
称取同一样品5份，按1.2.3节方法制备样品溶液，每次进样10 μL，测定叶黄素循环各组分的峰面积，计算RSD值。
1.2.8 回收率试验
按1.2.3节方法制备样品溶液，测定样品中叶黄素循环各个组分(V、A和Z)的峰面积，通过标准曲线分别计算出质量分数。再分别精确量取样品溶液适量，依次加入叶黄素循环各组分(V、A和Z)的标准品溶液各3份。按照1.2.2节色谱条件进行检测，每次进样10 μL，记录图谱，通过计算得出加标回收率以及RSD值[14-16]。
$ {\rm{RSD}} = \left[ {{\rm{Spr}}{{\left( {\sum {{{{x}}_{{n}}} - {\bar{{x}}}} } \right)}^2}/\left( {{{n}} - 1} \right)} \right]/{\bar{{x}}} \times 100\text{%} ; $
( ) 回收率=加标后测量值/(样品测定值+加标量)×100%。
1.2.9 数据分析
紫花苜蓿叶片叶黄素循环组分的试验数据均以“平均值±标准误”表示，利用统计学软件(SPSS 20.0)进行单因素方差分析(ANOVA)及差异显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 3种物质的标准图谱
叶黄素循环组分紫黄质(V)、环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)的标准图谱见图1~3。由图1~3可知：3种物质的保留时间分别为6.706、9.945和14.852 min。
2.2 紫花苜蓿叶片叶黄素循环组分分离图谱
吸取样品溶液10 μL进入液相色谱仪，在1.2.2节色谱条件下，测定其峰面积，以标准品为对照，测定样品中叶黄素循环组分的含量，V、A和Z含量分别为9.868、6.978和5.771 μg/mL。色谱图如图4所示。
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图 4 紫花苜蓿叶片紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质的分离图谱Figure 4. Chromatogram of violaxanthin, antheraxanthin and zeaxanthin2.3 3种物质标准曲线的绘制
通过梯度质量浓度标准品溶液的测定，色谱峰面积与质量浓度之间呈良好的线性关系(图5~7)，可以得到3种物质的线性回归方程：
V物质的回归方程为y=77 032.972 61x−2.113 31 (r=0.999 49)。
A物质的回归方程为y=76 728.788 71x−1.498 57 (r=0.999 61)。
Z物质的回归方程为y=911 43.207 69x−1.345 47 (r=0.999 60)。
由此，可通过测定3种物质的色谱峰面积，准确计算出样品中3种物质的浓度。
2.4 方法验证
按照1.2.5节的方法进行精密度试验，测定V、A和Z标准品溶液平均(n=5)峰面积(mAU·s)分别为140 7.17、102 0.50和948.55，RSD分别为0.96%、0.39%和0.87%，符合常规定量分析要求，表明仪器精密度良好。
按照1.2.6节的方法进行稳定性试验，测定室温下叶黄素循环各组分V、A和Z标准品溶液(n=7)的峰面积(mAU·s)，结果分别在1 241.97~1 378.39、1 077.32~1 040.56和1 180.41~1 123.47范围内，且0~24 h叶黄素循环3种组分峰面积的RSD值分别为3.33%、1.42%和1.86%，符合常规定量分析要求，表明供试样品溶液在24 h内稳定。
按照1.2.7节的方法进行重现性试验，测得样品溶液(n=5) V、A和Z的平均峰面积(mAU·s)分别为176.27、4.28和8.98，RSD分别为0.48%、3.98%和2.59%，符合常规定量分析要求，表明该方法的重复性良好。
取已知质量浓度的3种物质(V、A和Z)样品，分别对应加入低、中、高[17]3个不同质量浓度水平的标准品溶液进行回收率测定(n=3)，通过各自的回归方程得出相应的质量浓度，并计算回收率，结果见表1，各组分回收率试验均良好，RSD值符合常规定量分析要求。
表 1 加标回收实验结果Table 1. The results of standard addition recovery叶黄素循环的3个组分
three components of
xanthophyll cycle${\;\rho}$ (样品)/(μg·mL−1)
sample mass concentration加标量/(μg·mL−1)
adding standard
matter amount加标后测定值/
(μg·mL−1)
measured value回收率/%
rate of recovery平均回收率/%
average recovery相对标准差/%
RSDV 2.123 6.144 8.304 100.44 99.55 0.96 7.680 9.771 99.67 9.216 1.117 98.53 A 1.098 4.512 5.318 94.80 96.04 1.38 5.640 6.462 95.91 6.768 7.664 97.43 Z 1.332 3.840 4.888 94.52 94.08 0.51 4.800 5.774 94.17 5.760 6.635 93.57 2.5 样品叶黄素循环3个组分含量的测定
按1.2.3节方法制备样品溶液，在1.2.2节色谱条件下测定2个样品叶黄素循环组分的峰面积，再以各组分的标准方程计算出质量比，结果见表2。从表2可见：2种紫花苜蓿的叶黄素循环组分V和Z、A+Z与V+A+Z及其比值没有差异(P>0.05)，只有A含量云南野生种显著高于阿尔冈金。
表 2This page contains the following errors:
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品种 w(V)/(mg·g−1) w(A)/(mg·g−1) w(Z)/(mg·g−1) w(A+Z)/(mg·g−1) w(V+A+Z)/(mg·g−1) [(A+Z)/(V+A+Z)]/% 云南野生种wild species 0.168 83±0.014 98 a 0.006 77±0.000 55 a 0.010 72±0.001 48 a 0.017 48±0.001 64 a 0.186 31±0.016 59 a 9.38±0.14 a 阿尔冈金Algonquin 0.157 84±0.010 85 a 0.005 55±0.000 45 b 0.011 42±0.000 62 a 0.016 97±0.000 97 a 0.174 81±0.011 19 a 9.73±0.64 a 注：同列中不同小写字母表示在5%水平上差异显著。
Note: Small letters indicate significant difference in the same column at 5% level.3. 讨论
植物叶黄素的3种组分在一定条件下相互转化，可以减轻逆境胁迫对其造成的光抑制，因此，对3种组分含量的测定有利于了解植物光抑制的情况。有研究表明：Z和A有耗散过剩光能和猝灭激发能的作用[18]。本试验中，相同条件下的云南野生种和阿尔冈金的叶黄素循环组分V和Z、A+Z与V+A+Z及其比值没有差异(P>0.05)，是因为样品的生长条件正常，未受到环境胁迫。但云南野生紫花苜蓿叶黄素循环所产生的V、A和Z+A均大于阿尔冈金，可能是因为该种质资源较耐干热，光耗散能力较强[19]。叶黄素循环对过剩能量的耗散能力可以用叶黄素循环组分转化状态(DPS)表示，即DPS=(A+Z)/(V+A+Z)[20]。本试验中，云南野生种的DPS值小于阿尔冈金，是由于二者的A+Z转化量相近，但云南野生紫花苜蓿的叶黄素循环库(V+A+Z)含量较高。有研究表明：在高光胁迫条件下，转基因拟南芥的(A+Z)/(V+A+Z)和NPQ降低，其叶黄素循环功能减弱，对光抑制的敏感性增强[21]。在逆境条件下叶黄素循环的过剩能量耗散能力、光保护作用及机制等方面还有待进一步研究。
4. 结论
云南野生紫花苜蓿叶黄素循环所产生的V、A和Z+A均大于阿尔冈金，表明该种质资源具有较好的耐干热性。本研究利用HPLC法测定紫花苜蓿中叶黄素组分的含量，建立了相应标准曲线测定叶黄素循环各组分含量的方法。该方法能依据保留时间准确有效的区分组分峰和杂峰，在一定质量浓度范围内各组分均具有良好的线性关系，稳定性、重复性好，回收率高，能准确测量叶黄素循环组分的含量，且简单易操作。通过对2种紫花苜蓿叶片叶黄素循环3个组分含量的分析可知，该方法测得的数据符合叶黄素循环相关理论研究，适用于紫花苜蓿叶片中叶黄素循环3个组分含量的测定。
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图 1 不同处理对烤烟农艺性状的影响
注：小写字母表示处理间差异达5%显著差异；下同。
Figure 1. Effects of different treatments on the agronomic traits of flue-cured tobacco
Note: Small letters indicate significant difference among treatment at 5% level; the same as below.
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图 2 不同处理对烤烟根际土壤酶活性的影响
Figure 2. Effects of different treatments on the enzyme activities in the rhizospheric soil of flue-cured tobacco
表 1 不同处理对烤烟经济性状的影响
Table 1 Effects of different treatments on the economic characters of flue-cured tobacco
处理
treatment产量/(kg·hm−2)
yield产值/(CNY·hm−2)
output value均价/(CNY·kg−1)
average price上等烟比例/%
first class tobacco ratio中等烟比例/%
middle class tobacco ratioT1 2 417.40±71.27 a 55 632.98±817.46 ab 23.0±0.34 ab 62.49±0.02 ab 31.78±0.01 ab T2 2 399.85±46.36 a 53 961.74±748.85 b 22.5±0.40 bc 59.10±0.02 bc 31.76±0.01 ab T3 2 465.10±29.61 a 58 294.55±499.82 a 23.65±0.10 a 65.39±0.01 a 33.63±0.06 a CK 2 322.90±44.98 a 50 657.42±1 090.33 c 21.81±0.12 c 56.02±0.01 c 29.39±0.05 b 注：小写字母表示处理间差异达5%显著差异；下同。
Note: Small letters indicate significant difference among treatment at 5% level; the same as below.
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表 2 不同处理对烤烟化学成分的影响
Table 2 Effects of different treatments on the chemical components of flue-cured tobacco
化学成分chemical components T1 T2 T3 CK 烟碱/% nicotine 2.32±0.071 ab 2.44±0.148 a 2.12±0.010 b 1.81±0.021 c 总氮/% total nitrogen 1.76±0.005 a 1.70±0.068 a 1.76±0.148 a 2.03±0.199 a 蛋白质/% protein 8.50±0.047 ab 7.90±0.264 b 9.08±0.946 a 10.39±1.243 a 还原糖/% reducing sugar 24.22±3.081 a 23.05±0.459 a 24.76±0.697 a 18.23±0.291 b 钾/% potassium 1.83±0.428 a 2.31±0.280 a 2.06±0.151 a 1.34±0.150 b 氯/% chlorine 0.32±0.033 ab 0.35±0.099 ab 0.28±0.001 b 0.49±0.033 a 钾/氯potassium chlorine ratio 5.71±0.868 a 6.60±0.867 a 7.35±0.537 a 2.73±0.493 b
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[1] 李卫, 周冀衡, 张一扬, 等. 云南曲靖烟区土壤肥力状况综合评价[J]. 中国烟草学报, 2010, 16(2): 61. DOI: 10.3969/j.issn.1004-5708.2010.02.013. [2] 黄俊杰, 李世琛, 杨德海, 等. 大理红塔植烟基地土壤肥力综合评价[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2017, 32(1): 125. DOI: 10.16211/j.issn.1004-390X(n).2017.01.019. [3] 胡海洲, 丁根胜, 陈志强, 等. 云南牟定主要植烟区土壤肥力评价[J]. 安徽农业科学, 2013, 41(19): 8158. DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2013.19.032. [4] 张加云, 李向阳, 余凌翔, 等. 云南省新烟区土壤肥力状况综合评价[J]. 西南农业学报, 2011, 24(4): 1386. DOI: 10.3969/j.issn.1001-4829.2011.04.033. [5] 万兵兵, 刘晔, 吴越, 等. 烟草根际解磷解钾菌的筛选鉴定及应用效果研究[J]. 河南农业科学, 2016, 45(9): 46. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2016.09.011. [6] DONG W Y, ZHANG X Y, WANG H M, et al. Effect of different fertilizer application on the soil fertility of paddy soils in red soil region of southern China[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e44504. DOI: 10.1371/journal.pone.0044504.
[7] 王睿豪. 微生物菌肥对小粒黑豆生长发育及生理特性的影响[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2017. [8] 吴恩彪. 微生物肥料对云烟87根系生长及其根际土壤细菌群落多样性影响[D]. 福州: 福建农林大学, 2015. [9] 李春俭, 张福锁, 李文卿, 等. 我国烤烟生产中的氮素管理及其与烟叶品质的关系[J]. 植物营养与肥料学报, 2007, 13(2): 331. DOI: 10.3321/j.issn:1008-505X.2007.02.024. [10] 黄鹏, 何甜, 杜娟. 配施生物菌肥及化肥减量对玉米水肥及光能利用效率的影响[J]. 中国农学通报, 2011, 27(3): 76. [11] 张继光, 申国明, 张久权, 等. 烟草连作障碍研究进展[J]. 中国烟草科学, 2011, 32(3): 95. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5119.2011.03.020. [12] ABUSUWAR A, OMER E. Effect of intercropping, phosphorus fertilization and rhizobium inoculation on the growth and nodulation of some leguminous and cereal forages[J]. Agriculture and Biology Journal of North America, 2011, 2(1): 109. DOI: 10.5251/abjna.2011.2.1.109.124.
[13] 蒋欣梅, 夏秀华, 于锡宏, 等. 微生物解磷菌肥对大棚茄子生长及土壤有效磷利用的影响[J]. 浙江大学学报(理学版), 2012, 39(6): 685. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9497.2012.06.016. [14] 闫小梅, 虞丽, 叶成龙, 等. 一株灰潮土解磷菌的解磷特性及其对花生的促生作用[J]. 中国农学通报, 2015, 31(26): 150. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb15040148. [15] 王洋娟. 微生物菌肥对苹果树体生长及病害防控的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2014. [16] 周芳芳, 周丽娟, 詹军, 等. 烟草功能菌的研究进展[J]. 河南农业科学, 2013, 42(12): 6. DOI: 10.3969/j.issn.1004-3268.2013.12.002. [17] 李鑫, 周冀衡, 李强, 等. 枸溶性钾肥与解钾菌液配施对烤烟生长及钾素营养状况的影响[J]. 烟草科技, 2016, 49(11): 1. DOI: 10.16135/j.issn.1002-0861.2016.0003. [18] 肖胜. 施用不同种类解钾菌对不同部位烟叶化学成分及经济性状的影响[J]. 重庆与世界, 2016(11): 46. DOI: 10.13769/j.cnki.cn50-1011/d.2016.11.013. [19] 岳自慧, 翟汝伟, 罗世武, 等. 作物秸秆配施生物菌肥对宁南山区新修梯田土壤理化性状的影响[J]. 中国水土保持, 2018(2): 50. DOI: 10.3969/j.issn.1000-0941.2018.02.018. [20] 米国全, 王裔娜, 史艳艳, 等. 土壤熏蒸剂及生物菌肥对日光温室番茄土壤酶活性及产量的影响[J]. 河南农业科学, 2018, 47(7): 100. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2018.07.016. [21] 闵申. 施用生物菌肥对农作物土壤酶活性的影响[J]. 江西农业, 2016(10S): 30. DOI: 10.19394/j.cnki.issn1674-4179.2016.19.028. [22] YC/T 142—2010. 烟草农艺性状调查测定方法[S]. [23] 李春丽, 毛绍春. 烟叶化学成分及分析[M]. 昆明: 云南大学出版社, 2007. [24] 关松荫. 土壤酶及其研究法[M]. 北京: 农业出版社, 1986. [25] 闫克玉, 赵献章. 烟叶分级[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003. [26] 张振荣, 布云红, 赖泳红, 等. 不同功能菌剂对连作烟叶农艺性状和根际土壤细菌的影响[J]. 云南大学学报(自然科学版), 2012, 34(S1): 116. [27] 黄锦文, 唐莉娜, 曾文龙, 等. 不同土壤处理对烤烟根际土壤生物学特性的影响[J]. 中国烟草学报, 2016, 22(2): 75. DOI: 10.16472/j.chinatobacco.2015.265. [28] 卜令铎, 李江舟, 张立猛, 等. 不同外源物质(灌根)对烤烟根系及烟叶养分吸收的影响[J]. 南方农业学报, 2017, 48(5): 812. DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2017.05.009. [29] 高峰, 尤垂淮, 刘朝科, 等. 施用微生物菌剂对烤烟经济性状及其根际微生态变化的影响[J]. 福建农业学报, 2014, 29(12): 1230. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0384.2014.12.015. [30] 张云伟, 徐智, 汤利, 等. 不同有机肥对烤烟根际土壤微生物的影响[J]. 应用生态学报, 2013, 24(9): 2551. DOI: 10.13287/j.1001-9332.2013.0504. [31] 王满, 卫宣志, 郭芳阳, 等. 动植物有机肥对烤烟根际土壤酶活性及微生物碳氮的影响[J]. 江西农业学报, 2017, 29(10): 63. DOI: 10.19386/j.cnki.jxnyxb.2017.10.14. [32] 龚丝雨, 聂亚平, 张启明, 等. 增施生物炭对烤烟成熟期根际土壤酶活性的影响[J]. 江西农业学报, 2017, 29(10): 54. DOI: 10.19386/j.cnki.jxnyxb.2017.10.12. [33] 管国强, 李倩, 尚磊, 等. 菌株混合培养的溶磷解钾效果及条件优化[J]. 湖北农业科学, 2016, 55(2): 323. DOI: 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.013. [34] 夏觅真, 马忠友, 曹媛媛, 等. 棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用[J]. 中国微生态学杂志, 2010, 22(2): 102. DOI: 10.13381/j.cnki.cjm.2010.02.001. -
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1. 曾云鸿，蒋海港，杨霏，Victor RESCO DE DIOS，姚银安. 五种蕨类植物气体交换作用的节律响应. 植物生理学报. 2023(11): 2107-2116 . 
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